硝基化通用T细胞表位疫苗CD47-NitraTh的设计与抑瘤活性

利用遗传密码扩充技术,将免疫原性氨基酸对硝基苯丙氨酸定点引入到通用T细胞表位,并将其与免疫检查点分子CD47分子胞外区19-140片段融合表达,构建了靶向免疫检查点CD47的疫苗CD47-NitraTh。CD47-NitraTh能够在BALB/c小鼠体内诱导产生高滴度抗体,并可显著抑制CT26结肠癌肿瘤生长,提高脾脏CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的比例,同时可促进naïve T细胞向Th1细胞极化。值得关注的是,CD47-NitraTh不仅提高了肿瘤浸润淋巴细胞的比例,同时还降低了肿瘤组织中Treg细胞比例,意味着CD47-NitraTh疫苗能够重塑肿瘤免疫抑制性微环境。本研究结果提示,CD47-NitraTh 可以作为有效的肿瘤疫苗候选分子。     

TSC1基因对调节性T细胞发育分化的免疫调控作用

【目的】 本研究利用TSC1的T细胞特异缺失小鼠探讨TSC1对T细胞尤其是调节性T细胞(Treg)发育的免疫调控效应。 【方法】 主要应用T细胞特异性TSC1基因敲除小鼠(Lck-cre; TSC1loxp/loxp)及细胞分子免疫学技术, 阐明TSC1基因对CD4⁺ Treg发育分化及其免疫功能的重要调控作用和规律。 【结果】 (1)TSC1基因缺失小鼠,其胸腺CD4⁺CD8^-T (CD4SP),CD8⁺CD4^-T(CD8SP),CD4^-CD8^-T(DN)和CD4⁺CD8⁺T(DP)细胞百分率无显著差异;(2)TSC1基因缺失小鼠CD4⁺Foxp3⁺Tregs百分率和细胞绝对数均明显增加;(3)小鼠外周免疫器官(脾脏)的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞百分率和绝对数均无显著差异;(4)小鼠胸腺中CD4⁺CD25⁺Foxp3^-T细胞百分率和绝对数有下降的趋势;(5)小鼠胸腺中Treg其他亚型如CTLA-4以及GITR型均有所增加。 【结论】 TSC1缺失可以影响nTreg的发育和分化,而对iTreg发育和分化无明显影响,并且TSC1对于nTreg的调节可能是通过调控其前体发育分化而实现的。     

含对硝基苯丙氨酸HER2疫苗的免疫原性研究

为了打破HER2自身蛋白的免疫耐受,产生高效的免疫应答,利用遗传密码扩充技术,将免疫原性氨基酸对硝基苯丙氨酸定点引入到HER2片段的第5、26、79位,获得了含有对硝基苯丙氨酸的HER2突变体。通过镍亲和色谱柱,获得纯度达95%以上的原型和突变体HER2分子。对HER2疫苗的免疫原性进行分析,结果显示,pNO₂Phe⁷⁹HER2能够在C57BL/6小鼠体内产生高滴度的交叉性抗体。免疫小鼠的抗血清能够识别具有完整HER2受体胞外区的SKBR-3细胞,并通过ADCC效应裂解HER2高表达的HER2+B16F10细胞。这些研究结果提示,定点引入了对硝基苯丙氨酸的pNO₂Phe⁷⁹HER2可以作为靶向HER2的肿瘤疫苗候选分子。     

免疫检查点B7-H3表位疫苗的设计及其抗肿瘤活性

B7-H3是在多种肿瘤表面过表达的免疫检查点分子,是肿瘤免疫治疗的理想靶点。利用本实验室前期设计的硝基化T细胞表位为基础,构建了可靶向免疫检查点B7-H3的表位疫苗。该疫苗能在CT26结肠癌模型中显著抑制肿瘤生长,且与PD-L1蛋白疫苗有明显的协同作用。B7-H3疫苗可以增加脾脏T淋巴细胞中CD4⁺ T细胞的比例和肿瘤浸润T淋巴细胞中CD8⁺ T细胞的比例,同时减少肿瘤浸润CD4⁺ T淋巴细胞中抑制性Treg细胞的比例,有效改善肿瘤免疫抑制微环境。研究结果提示,B7-H3表位疫苗可以作为有效的肿瘤疫苗候选分子。     

非小细胞肺癌患者外周血CD8+CD39+T细胞水平及临床意义

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血CD8⁺CD39⁺T细胞水平及临床意义。方法选取60例NSCLC患者为NSCLC组,60例健康人群为对照组。检测两组外周血CD8⁺CD39⁺T细胞水平,分析NSCLC患者外周血CD8⁺CD39⁺T细胞水平与其临床特征和预后的关系。结果NSCLC组外周血CD8⁺CD39⁺T细胞水平显著高于对照组(P＜0.05)。肿瘤直径＞3 cm、低分化、TNMⅢ期的NSCLC患者外周血CD8⁺CD39⁺T细胞水平高于肿瘤直径≤3 cm、中高分化、TNMⅠ~Ⅱ期的患者(P＜0.05)。CD8⁺CD39⁺T细胞高水平组术后1年肿瘤无进展生存率及无进展生存期均低于低水平组(P＜0.05)。TNM分期、外周血CD8⁺CD39⁺T细胞水平是NSCLC患者预后的影响因素(P＜0.05)。结论CD8⁺CD39⁺T细胞在NSCLC患者外周血中呈高水平,且与临床病理特征及预后关系密切,可作为患者病情和预后的评估指标。     

自体树突状细胞疫苗联合细胞因子诱导的杀伤细胞治疗胆系肿瘤的临床疗效观察

目的 观察自体树突状细胞(DC)疫苗联合细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)治疗胆系肿瘤的临床疗效。 方法 采集患者外周血单个核细胞,采用多种肿瘤抗原刺激后进行扩增和培养,收获成熟DC制成疫苗进行皮内注射,同时联合自体CIK细胞静脉回输,观察85例胆系肿瘤患者治疗前后的临床疗效、免疫功能、不良反应及生存时间。 结果 85例胆系肿瘤患者经自体DC-CIK细胞治疗后,临床症状较前明显改善(P <0.05);临床疗效显著,完全缓解2例(2.3%)、部分缓解14例(16.5%)、疾病稳定54例(63.5%)及疾病进展15例(17.6%);免疫功能提高,治疗后淋巴细胞亚群中CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺、CD3⁺CD56⁺及CD4⁺/CD8⁺比值升高,而调节性T细胞降低(P <0.05)。至随访结束,58例患者死亡,2例失访,25例存活,中位生存期为16.5个月(95% CI:12.1~20.9个月)。 结论 自体DC-CIK细胞治疗是胆系肿瘤患者一种安全有效的治疗方法,不良反应少,但相关结论仍有待进一步大样本随机对照研究证实。     

黏蛋白1(MUC1)致敏的树突状细胞疫苗体外抗肿瘤实验研究

目的 研究以CpG作为免疫佐剂,应用黏蛋白1（MUC1）致敏树突状细胞（DC）制备疫苗在体外诱导的特异性抗肿瘤作用。方法 健康人外周血采用密度梯度离心法,分离外周血单核细胞（PBMC）,应用GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子体外培养诱导DC,观察细胞形态,并通过流式细胞术检测成熟DC细胞标志物CD80、CD86。再应用CpG作为免疫佐剂,MUC1作为抗原致敏DC制备疫苗,致敏的DC与T细胞混合培养,观察其诱导T淋巴细胞增殖能力。诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）与肿瘤靶细胞以5：1、10：1、20：1的效靶比共孵育,MTT法检测CTL杀伤活性。结果 DC表型检测结果为CD80+细胞占70.4％,CD86⁺细胞占72.0％,呈现成熟DC表型。MUC1致敏的DC疫苗与淋巴细胞混合培养显示,DC疫苗具有刺激T细胞增殖活化的作用,其中DC+CpG+MUC1组明显高于MUC1+DC或CpG+DC组,差异有统计学意义（P<0.01）。DC疫苗诱导产生的特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤作用较单独T细胞组或DC组明显增强,差异有统计学意义（P<0.01）。并随着效靶比增大,其杀伤作用呈逐渐增强。结论 经CpG和MUC1致敏的DC疫苗在体外可诱导产生特异性抗肿瘤免疫效应。     

异基因造血干细胞移植后小鼠共刺激分子表达与急性移植物抗宿主病的关系

目的 探究异基因造血干细胞移植后小鼠共刺激分子表达及其与急性移植物抗宿主病（aGVHD）发病的关系。方法 供体为5只C57BL/6J（H2KD^-H2KB⁺）雄性小鼠,受体为30只CB6F1（H2KD⁺H2KB⁺）雌性小鼠。将受体小鼠随机分为单纯照射组、骨髓移植组和aGVHD组,每组10只。单纯照射组：受体小鼠接受γ射线照射后不注射任何细胞;骨髓移植组：受体小鼠接受γ射线照射后注射5×10⁶个供体来源去T淋巴细胞的骨髓有核细胞;aGVHD组：受体小鼠接受γ射线照射后,同时注射5×10⁶个供体来源去T淋巴细胞的骨髓有核细胞和3×10⁷个供体来源脾细胞。采用log-rank生存曲线分析各组小鼠移植后生存情况。分别在移植后7、14、21、28 d采用流式细胞术检测骨髓移植组和aGVHD组小鼠外周血CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞表面共刺激分子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）、程序性死亡蛋白1（PD-1）、可诱导共刺激分子（ICOS）和CD28的表达情况,以及移植后21 d两组小鼠脾组织CD4⁺T淋巴细胞内白细胞介素（IL）-17、γ干扰素、IL-4的表达情况,并在移植后21 d采用3,3''-二氨基联苯胺（DAB）染色检测两组小鼠结肠组织共刺激分子配体的表达情况。结果 单纯照射组受体小鼠均在γ射线照射后19 d内死亡;骨髓移植组小鼠在γ射线照射后均未出现aGVHD症状,30 d内均存活;aGVHD组小鼠在γ射线照射后出现aGVHD症状的时间为14（11~18）d,生存时间为22（13~30）d。随着时间的推移,aGVHD组小鼠外周血CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞表面CTLA-4、PD-1表达在移植后均呈下降趋势,ICOS、CD28表达均呈上升趋势。在移植后28 d时aGVHD组小鼠外周血CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞表面CTLA-4、PD-1表达均低于骨髓移植组,ICOS、CD28表达均高于骨髓移植组,差异均有统计学意义（P均<0.05）。DAB染色结果示,骨髓移植组结肠组织CD80、ICOS配体（ICOSL）、PD-1配体（PD-L1）表达均为阴性,aGVHD组结肠组织CD80、ICOSL、PD-L1阳性表达率分别为40%、80%、80%。与骨髓移植组比较,aGVHD组小鼠脾组织CD4⁺T淋巴细胞内IL-17、γ干扰素表达均增加,IL-4表达减少,差异均有统计学意义（P均<0.05）。结论 异基因造血干细胞移植小鼠发生aGVHD后,共刺激分子CTLA-4表达随时间推移逐渐降低。CTLA-4、ICOS、PD-1均可能通过调节辅助性T细胞（Th）1、Th2、Th17等T淋巴细胞亚群分布参与aGVHD的发生、发展。     

移植物细胞组分对异基因造血干细胞移植预后的影响

目的：探讨移植物中单个核细胞（mononuclear cell,MNC）、CD34⁺ 细胞及 T 淋巴细胞亚群剂量对移植后生存的影响。方法：回顾性分析121例行异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）的血液系统恶性疾病患者,研究回输移植物中MNC、CD34⁺ 细胞、CD3⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）剂量及CD4⁺ /CD8⁺ T细胞比值对移植后造血重建及生存的影响。结果：中性粒细胞成功植入120例,高剂量CD34⁺ T细胞 （≥6.90×10⁶ 个/kg）（P < 0.001）、CD3⁺ T细胞（≥6.24×10⁸ 个/kg）（P=0.042）和CD8⁺ T细胞（≥1.05×10⁸ 个/kg）（P=0.021）与中性粒细胞更快植入相关。血小板成功植入119例,高剂量CD34⁺ 细胞与血小板更快植入相关（P=0.001）。53例（43.8%）患者发生急性移植物抗宿主病,28例发生慢性移植物抗宿主病。1年和3年总体生存（overall survival,OS）率为83.5%和68.0%,1年和3年无进展生存（progression-free survival,PFS）率为75.0%和64.4%。单因素分析中,高剂量MNC（≥9.79×10⁸ 个/kg）、高剂量CD3⁺ T细胞和CD4⁺ /CD8⁺ T细胞比值<3.57患者有更好的OS,高剂量MNC患者有更好的PFS（P=0.061）。多因素分析显示,CD4⁺ /CD8⁺ T 细胞比值<3.57患者有更好的OS（HR=0.288,95%CI：0.084~0.988,P=0.048）。1年和3年累积复发率分别为18.2%和26.8%,高剂量MNC和CD8⁺ T细胞患者有更低的累积复发率。结论：移植物细胞组分对异基因造血干细胞移植预后有重要影响,高剂量 CD34⁺ 细胞可促进血小板更快植入,回输移植物中CD4⁺ /CD8⁺ T细胞比值<3.57的患者有更好的OS和更低的累积复发率。     

免疫共刺激分子增强自噬小体疫苗诱导的T细胞应答

自噬小体疫苗DRibble被证实可以有效诱导小鼠和人T细胞应答,为了进一步增强DRibble疫苗诱导人T细胞应答的能力,本研究将免疫共刺激分子OX40、CD80和对照质粒分别转染至表达CMV pp65蛋白的LT3-pp65细胞系中,制备3种类型的DRibble疫苗为:Ctrl/pp65 DRibble、OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble。通过ELISA法检测不同DRibble疫苗诱导树突状细胞表达IL-12的水平,结果显示,OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble诱导树突状细胞表达IL-12的水平显著高于Ctrl/pp65 DRibble。进一步将3种DRibble疫苗分别刺激树突状细胞后与扩增的CMV特异性T细胞共培养,通过流式细胞术检测表达IFN-γ的T细胞占总T细胞的百分比。实验结果显示,与Ctrl/pp65 DRibble相比,OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble诱导CD8⁺ T细胞表达IFN-γ的能力显著增高,OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble诱导CD4⁺ T细胞表达IFN-γ的水平也显著高于Ctrl/pp65 DRibble。实验证明免疫共刺激分子OX40和CD80修饰均可以加强DRibble疫苗体外诱导人T细胞应答的能力。     

Epitope DNA vaccines against tuberculosis: spacers and ubiquitin modulates cellular immune responses elicited by epitope DNA vaccine

Cell-mediated immune responses are crucial in the protection against tuberculosis. In this study, we constructed epitope DNA vaccines (p3-M-38) encoding cytotoxic T lymphocyte (CTL) epitopes of MPT64 and 38 kDa proteins of Mycobacterium tuberculosis. In order to observe the influence of spacer sequence (Ala-Ala-Tyr) or ubiquitin (UbGR) on the efficacy of the two CTL epitopes, we also constructed DNA vaccines, p3-M-S(spacer)-38, p3-Ub (UbGR)-M-S-38 and p3-Ub-M-38. The immune responses elicited by the four DNA vaccines were tested in C57BL/6 (H-2b) mice. The cytotoxicity of T cells was detected by LDH-release method and by enzyme-linked immunospot assay for epitope-specific cells secreting interferon-gamma. The results showed that DNA immunization with p3-M-38 vaccine could induce epitope-specific CD8 CTL response and that the spacer sequence (AAY) only enhanced M epitope presentation. The protein-targeting sequence (UbGR) enhanced the immunogenicity of the two epitopes. The finding that defined spacer sequences at C-terminus and protein-targeting degradation modulated the immune response of epitope string DNA vaccines will be of importance for the further development of multi-epitope DNA vaccines against tuberculosis.     

In Vitro Anti-tumor Immune Response Induced by Dendritic Cells Transfected with Recombinant Adenovirus Carrying Mutant K-ras Genes

Summary： The specific anti-tumor immune response induced by mouse bone marrow dendritic cells （DCs） lransfected with recombinant adenovirus carrying mutant k-ras genes was investighted. DCs were generated from mouse bone marrow in the presence of rmGM-CSF （3.3 ng/mL） and rmIL-4 （1.3 ng/mL） and detected by FACS, and then transfecled with the recombinant adenovirus encoding mutant k ras gene. The efficacy of transfection and T cell stimulating activity of DCs were detected. CTL activity of the mice vaccinated with DCs was observed. The resuhs showed thai DCs had dendritic veiled morphology. BmDCs highly expressed B7-1（80%）, B7-2（77%）, MHC Ⅱ （70%）, CDllc （65%）, CD40 （70%） and CD54 （96%） with FACS, and no significant difference in the expression was observed before and after the transfection （P〈0.05）. The DCs transfeeled by mutant k-ras gene could significantly stimulate lymphoeytes proliferation as compared with those transfeeted by Ad e or non-modified DCs （P〈0.05）. DC vaccine transfected by mutant k-ras gene could induce CTL activity against Lewis lung cancer, but not against B16. The specific eytotoxicity against Lewis lung cancer in Ad-k-ras/12-transdueed DC group was signifieantly higher than those in the control, vector and non transfeeted DCs groups （P〈0.05）. It was concluded that special antitumor response could be induced by DCs transfected with recombinant adenovirus carrying mutant k-ras genes.     

肿瘤抗原脉冲致敏的树突状细胞疫苗抗肿瘤作用的实验研究

目的：进一步研究体外肿瘤抗原脉冲致敏的骨髓树突状细胞瘤苗主动免疫诱导小鼠体内抗肿瘤免疫应答,并观察其抵抗野生性肿瘤攻击的免疫保护作用及对荷瘤小鼠模型的免疫应答。方法：采用本室建立的骨髓树突状细胞分离与细胞因子体外扩增培养方法,并在体外经灭活ＮＳ１骨髓瘤细胞及其裂解产物脉冲刺激后直接作为疫苗,然后进行免疫预防与治疗的在体动物实验。结果：可从１只小鼠股骨中获得（３～５）×１０５个树突状细胞（ＤＣ）,其纯度为９５％以上,对混合Ｔ淋巴细胞具有强刺激活性。主动免疫同系健康ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠的试验显示,ＤＣ疫苗能诱导抗原特异的细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）活性,免疫１次的动物首次受到肿瘤攻击后诱发肿瘤形成率为０％,再次攻击的肿瘤形成率为２０％;而免疫３次的动物两次攻击的肿瘤形成率皆为０％。主动免疫治疗同种荷瘤动物的试验表明,ＤＣ疫苗也能抑制肿瘤生长,荷瘤动物存活率提高及生存期明显延长。结论：肿瘤抗原体外致敏的树突状细胞能诱导宿主体内的抗肿瘤免疫保护性反应,且对荷瘤模型动物具有明显的免疫治疗作用。     

小鼠AFP/DC疫苗体外免疫活性检测及对小鼠皮下移植瘤抑制作用

目的将已构建的Balb/c小鼠具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉信号肽的AFP2cDNA真核表达载体,分别在小鼠树突状细胞(DCs)中表达,并观察其在体外抗肝癌免疫中的作用和对小鼠皮下移植瘤的抑制作用。方法脂质体转染PcDNA3.1( )/AFP1、PcDNA3.1( )/AFP2至DCs细胞进行表达、鉴定,将DCs疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养,MTT比色法测定脾淋巴细胞的特异性杀伤肝癌细胞的活性。随后建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型,用AFP1/DCs和AFP2/DCs进行皮下注射,观察其对Balb/c小鼠皮下移植瘤的抑制作用;观察各组治疗后皮下移植瘤的体积的大小,治疗组小鼠的存活期,取瘤组织行免疫组化观察Bax凋亡基因的表达情况,观察另一半荷瘤小鼠的生存时间。结果所构建的真核表达质粒pcDNA3.1( /-)/AFP1和pcD-NA3.1( /-)/AFP2在小鼠树突状细胞中获得稳定高效表达,AFP2/DCs明显刺激T淋巴细胞的增殖及提高CTL的特异性杀伤作用,AFP1/DCs和AFP2/DCs皮下注射可显著抑制肝癌H22细胞移植瘤的生长,以AFP2/DCs的效果更明显,治疗2周后AFP2/DCs组小鼠的肿瘤体积(726.7±298.2)mm3明显小于AFP1/DCs组的肿瘤体积(1486.2±457.2)mm3和空质粒对照组的肿瘤体积(2137±547.2)mm3,两组间有统计学差异(P<0.05),AFP2/DCs治疗组、AFP1/DCs治疗组的抑瘤率可达79.2%和39.7%,空质粒对照组和生理盐水对照组的抑瘤率为0;AFP2/DCs治疗组、AFP1/DCs治疗组的小鼠存活期分别为(54.5±4.2)d、(40.2±4.8)d,较空质粒对照组(30.6±6.2)d显著延长。AFP2/DCs治疗组移植瘤组织中Bax阳性细胞的百分率为92%,显著高于AFP1/DCs组(64%)和pcDNA/DCs(21%)和生理盐水组(23%),两组间差异有显著性(P<0.05)。结论成功地构建了真核表达载体PcDNA3.1( )/AFP1和PcDNA3.1( )/AFP2,编码去掉分泌性信号肽的AFP2cDNA真核表达载体转染的小鼠树突状细胞,能够诱导较强的特异性抗肝癌免疫效应。其机制可能与诱导肝癌细胞凋亡有关。     

Prophylactic Antitumor Effect of Mixed Heat Shock Proteins/Peptides in Mouse Sarcoma

Background:

To develop a vaccine-based immunotherapy for sarcoma, we evaluated a mixture of heat shock proteins (mHSPs) as a vaccine for sarcoma treatment in a mouse model. Heat shock protein/peptides (HSP/Ps) are autoimmune factors that can induce both adaptive and innate immune responses; HSP/Ps isolated from tumors can induce antitumor immune activity when used as vaccines.

Methods:

In this study, we evaluated the effects of mHSP/Ps on prophylactic antitumor immunity. We extracted mHSP/Ps, including HSP60, HSP70, GP96, and HSP110, from the mouse sarcoma cell lines S180 and MCA207 using chromatography. The immunity induced by mHSP/Ps was assessed using flow cytometry, ELISPOT, lactate dehydrogenase release, and enzyme-linked immunosorbent assay.

Results:

Of S180 sarcoma-bearing mice immunized with mHSP/Ps isolated from S180 cells, 41.2% showed tumor regression and long-term survival, with a tumor growth inhibition rate of 82.3% at 30 days. Of MCA207 sarcoma-bearing mice immunized with mHSP/Ps isolated from MCA207 cells, 50% showed tumor regression and long-term survival with a tumor growth inhibition rate of 79.3%. All control mice died within 40 days. The proportions of natural killer cells, CD8⁺, and interferon-γ-secreting cells and tumor-specific cytotoxic T-lymphocyte activity were increased in the immunized group.

Conclusions:

Vaccination with a polyvalent mHSP/P cancer vaccine can induce an immunological response and a marked antitumor response to autologous tumors. This mHSP/P vaccine exerted greater antitumor effects than did HSP70, HSP60, or tumor lysates alone.