猴免疫缺陷病毒(SIV)在艾滋病模型恒河猴组织中的分布和载量测定

目的研究当艾滋病恒河猴模型的血浆病毒载量处于低水平或阴性时,猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency viruses,SIV）在宿主组织中的分布情况。方法SIVmac251感染恒河猴10只,定期检测其血浆载量,感染病毒平均高峰时间第14天时,活检取淋巴结。选取感染18个月后病毒载量最低水平和阴性的2只艾滋病猴（SAIDS）,经安死术后取淋巴结、脾、肝、肺、肾、脑等组织,用原位杂交和实时荧光定量PCR的方法检测病毒在组织中的分布和组织中的病毒载量。结果感染后14d,10只猴血浆病毒载量达到10^7copies/mL,淋巴结组织病毒载量为10^5-10^8copies/g,原位杂交方法在腹股沟淋巴结中检测到强阳性斑点。感染后第18个月的2只猴,血浆病毒载量下降并维持不高于10^2copies/mL水平或阴性,但组织分布不尽相同,在肠系膜淋巴结、肾上腺、海马回、空肠、脾脏等组织中检测到10^5-10^6copies/g的病毒载量,于一只猴的脑积液中检测到10^3copies/mL的病毒载量。用原位杂交的方法在肠系膜淋巴结和空肠中检测到强阳性斑点,其它组织中未检测到阳性斑点。结论实验证实SAIDS猴在血浆病毒载量低甚至阴性时,病毒在不同组织中仍有分布,有些组织中甚至出现高病毒载量,提示在制备SIV/SAIDS模型中,尤其在药物筛选和疫苗评价时,应考虑组织病毒载量指标的测定和药物、疫苗对组织病毒的治疗清除作用的评价。     

ELISPOT方法检测SIVmac239感染猴特异性细胞免疫水平

目的为了完善现有的SIV／恒河猴模型，掌握恒河猴被SIV感染后体内细胞免疫应答状态，为评价HIV疫苗提供方法和数据上的参考，我们测定了SIV感染猴体内病毒特异性的细胞免疫水平。方法实验前选出4只无SIV、sTLV、SRV／D和B病毒感染的恒河猴，用SIVmac239病毒液静脉感染实验猴，使用RT-PCR、流氏细胞术和ELISPOT等方法，监测SIVmac239病毒在恒河猴体内复制情况、感染猴的外周免疫损伤情况和细胞免疫情况，持续测定一年。结果实验结果显示IFN-γ ELISPOT方法能有效的评估实验猴的细胞免疫情况，IFN—YELISPOT结果和CD4＋T细胞数无相关性，与血浆病毒载量稍有相关。结论本实验明确了SIVmac239感染中国恒河猴体内CTL的基本趋势和范围，了解了外周血病毒载量、外周免疫损伤与细胞免疫状况之间的联系，完善了SIV／SAIDS模型评价指标，为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了基础条件。     

SIVmac239毒株经静脉及直肠感染中国恒河猴的比较

目的研究猴免疫缺陷病毒SIVmac239毒株经静脉及直肠途径感染中国恒河猴后的生物学特性和症状表现,并比较由感染途径不同导致的差异,为该模型系统的应用提供依据。方法以SIVmac239毒株经静脉感染19只中国恒河猴,经直肠感染6只中国恒河猴,观察至感染后232或168d,比较其抗猴免疫缺陷病毒(SIV)特异性抗体滴度、CD4 T细胞数量、血浆病毒载量、淋巴结病理改变以及临床表现的变化。结果所有猴均出现SIV抗体阳转。在静脉感染猴,感染后10d检测到SIV特异的IgM,而直肠感染猴始终未能检测到。在感染后168d,静脉感染猴的SIV特异性IgG的平均水平较直肠感染猴高10倍。在观察期内,直肠感染组的CD4 T细胞数下降不如静脉感染组显著。所有猴的血浆SIV载量均在感染后10~14d达到高峰(107拷贝/ml左右),约2个月后降至平台期(103~106拷贝/ml)。2只静脉感染猴及1只直肠感染猴在感染后150~210d死于猴免疫缺陷综合征,呈快速进展型改变。结论SIVmac239毒株静脉及直肠感染接种中国恒河猴,均可建立慢性的SIV感染,其特征与人感染人类免疫缺陷病毒后的改变相似,均可以作为良好的研究获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的动物模型,尤其有助于预防性或治疗性AIDS疫苗的研究。     

猴免疫缺陷病毒（SIVmac239）恒河猴适应株耐9-(2-磷酸甲氧丙基)腺嘌呤(PMPA)突变位点筛查

目的初步明确猴免疫缺陷病毒（SIVmac239）耐9-（2-磷酸甲氧丙基）腺嘌呤（PMPA）突变基因位点,指导SIV／恒河猴模型在药物评价中的应用。方法SlVmae239恒河猴适应株感染恒河猴,之后进行PMPA治疗,测定不同时间点血浆病毒载量和外周血CD4^＋T细胞数;使用CEMx174细胞进行药物敏感实验。单拷贝PCR测定病毒rt基因变异情况。结果PMPA治疗不能有效降低感染猴血浆病毒载量,且对血CD4^＋T细胞数没有显著影响;细胞水平药物敏感实验证实该病毒株对PMPA不敏感。序列比对发现S205L和M5021可能影响到病毒对PMPA的药物敏感性。结论本研究为SIV／恒河猴模型的合理使用及HIV-1的临床治疗提供了信息。     

SHIV1157ipd3N4中国恒河猴细胞适应株静脉感染中国恒河猴有效浓度的确定

目的 确定SHIV1157ipd3N4静脉途径感染中国恒河猴的有效病毒浓度,明确SHIV1157ipd3N4感染实验猴体内病毒复制和免疫损伤情况.方法 10只正常中国恒河猴分成6组,分别用10倍系列稀释的病毒液1 mL静脉感染,测定血浆病毒载量,CD4+/CD8+,CD4+T淋巴细胞绝对数,分析感染后恒河猴体内病毒复制...     

SHIV-KB9感染中国恒河猴动物模型的建立

目的为了进一步确证SHIV-KB9感染中国恒河猴的病毒浓度范围,测试动物对病毒的适应性,明确该动物模型的可重复性。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查。选出4只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,分别用10倍系列稀释的病毒液静脉感染实验猴,使用流氏细胞术、血常规、病毒分离、DNA-PCR和RT-PCR等方法确定实验猴是否被感染,以及感染后恒河猴体内病毒复制和免疫细胞损伤情况。结果实验猴的血浆病毒载量、病毒分离结果、CD4+/CD8+比值和CD4+T细胞数等证实,4.8×105 copies/mL以上浓度的SHIV-KB9病毒液能成功感染中国恒河猴。结论本研究进一步明确了SHIV-KB9感染中国恒河猴的有效病毒浓度范围,确定了SHIV-KB9病毒感染中国恒河猴的病毒学、免疫学的测定指标,成功的建立了SHIV-KB9/中国恒河猴动物模型。     

SHIV-KB9感染中国恒河猴的实验研究

目的研究SHIV-KB9感染中国恒河猴的可能性,确定其有效病毒浓度,明确实验猴感染SHIV-KB9后的病毒复制和免疫反应情况,建立SHIV/SAIDS模型,并确定、完善SHIV/SAIDS模型评价指标。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查。选出6只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,分别用10倍系列稀释的病毒液静脉感染实验猴,使用流式细胞术、血常规检测、病毒分离、DNA-PCR和RT-PCR等方法确定实验猴是否被感染,以及感染后恒河猴体内病毒复制和免疫细胞损伤情况,持续测定3个月。结果实验猴的血浆病毒载量、病毒分离结果、CD4+/CD8+比值和CD4+细胞数等证实,4.8×106copies/mL以上浓度的SHIV-KB9病毒液能成功感染中国恒河猴。结论SHIV-KB9成功感染中国恒河猴为进一步建立SHIV/SAIDS模型奠定了良好的实验基础,为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。     

猕猴艾滋病模型EKM基因治疗效果观察

目的明确体外导入EKM基因的实验猕猴感染SHIV-KB9后,病毒复制和免疫反应情况,为基因治疗AIDS提供实验依据。方法用血清学方法筛选出无SIV、STLV、SRV／D和B病毒感染的猕猴7只,实验当天回输自体储备血75ml,同时采集猴外周血75m1进行CD4＋T细胞分离培养,并导入EKM基因,培养结束后收获细胞,静脉回输猴体后再进行SHIV-KB9感染。采用流式细胞术、血常规检测、病毒栽量检测和基因拷贝数检测的方法确定导入基因后的实验猕猴感染sHIV．KB9后体内病毒复制和免疫损伤情况。结果导入基因和回输细胞的实验猕猴其血浆病毒载量峰值都与已报道的推迟14d出现,比模型对照组推迟11d出现,血浆病毒载量峰值均比模型对照组峰值低。流式细胞术结果表明其CD4＋T细胞计数也稳定在一定水平,CD4／CD8比值未出现明显倒置。实验组猕猴在试验结束时均未发展为猴AIDS。结论自体回输导入EKM基因的CD4＋T细胞的猕猴AIDS模型其血浆病毒载量峰值与模型对照组峰值比较有迟后作用,且低于模型对照组峰值,与回输细胞的实验对照组没有明显区别,其更确定的效果还有待进一步的研究。     

SHIV病毒在猴体内的复制与传代

目的为建立SHIV艾滋病动物模型提供毒力较强的病毒株,将新合成的SHIV XJ02170病毒适应猴体,并增强其毒力。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查和PCR检测。选出13只无SIV,STLV1,SRV D和B病毒感染的猴。第一批实验,将SHIV前病毒DNA质粒经肌肉注射到猴体内,每只500μg;SHIV病毒液,经静脉注射到猴体内,每只2ml。病毒质粒和病毒液各接种2只猴。当第一批猴体检出病毒后,10ml感染猴的全血,抗凝后静脉注射到第二批猴体内,当第二批猴检出病毒后再将10ml感染猴的全血静脉注射到第三批猴体内,连续传代4次。每批实验均定期采集血液标本,分别用肝素和EDTA抗凝,进行病毒分离;病毒基因PCR检测;CD4,CD8测定;病毒抗体检测。结果SHIV XJ02170病毒和SHIV XJ02170前病毒DNA质粒在猴体内的传代中均能分离出病毒;从传代猴的血浆和外周血单核细胞(PBMC)中检出了病毒DNA和RNA基因;CD4,CD8测定结果显示有暂时性倒置现象,后变为正常倒置与正常交替出现;在传代的猴血清中检测出特异性HIV病毒抗体。结论SHIV XJ02170病毒与SHIV XJ02170前病毒DNA质粒,均能在恒河猴体内复制。     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。     

SIVmac251不同途径感染恒河猴急性期实验研究

目的建立SIV黏膜感染的恒河猴模型，并与静脉感染相比较，研究不同途径感染后病程进展是否存在差异。方法用SIVmac251经静脉、阴道、直肠3种途径分别感染恒河猴，定期采血，进行全血病毒分离，测定血浆病毒载量、CD4^＋／CD8^＋比值及抗体检测。结果感染后7d至目前56d为止，外周血单核淋巴细胞中前病毒DNA检测、全血病毒分离全部呈现阳性，只有直肠感染猴S172在7d和42d时出现较高病毒滴度；血浆病毒载量检测阳性出现先后顺序为静脉感染、直肠感染、阴道感染，14d达到高峰，然后迅速下降，变化趋势基本保持一致。血浆抗体检测从第14天开始3种途径感染的恒河猴体内抗体均为阳性；感染后CD4^＋／CD8^＋比值下降，在第28天时出现比例倒置。结论经不同途径均成功感染恒河猴后在病毒分离和血浆病毒载量等方面表现出了一定的差异。     

猴免疫缺陷病毒感染猕猴快速进展型死亡特征

观察猴免疫缺陷病毒（ｓｉｍｉａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ,ＳＩＶ）ＳＩＶｍａｃ和ＳＩＶｍａｃ２５１毒株感染猕猴快速进展型死亡的感染特征。方法用ＳＩＶｍａｃ和ＳＩＶｍａｃ２５１静脉接种,实验性感染８０只恒河猴和４只食蟹猴,定期采集静脉血浆进行病毒分离测定血浆病毒水平,间接免疫荧光法测定血浆病毒抗体水平,并取淋巴组织进行常规理组织学检查。结果８４只猕猴感染ＳＩＶｍａｃ和ＳＩＶｍａｃ２     

猴免疫缺陷病毒(SIV)慢性感染猴模型的建立

目的：在先前已建立了模拟人艾滋病感染者和患者的猴免疫缺陷病毒（ＳＩＶ）急性感染猴和中、晚期猴艾滋病（ＳＡＩＤＳ）模型的基础上,再摸索建立ＳＩＶ慢性感染猴模型,以期为抗区滋病药物的体内药效学介研究提供更合适的动物模型。方法：用ＳＩＶｍａｃ２５１感染恒河猴１７只,追踪观察其临床表现,体征变化,病程进展,血浆和全血病毒症规律,淋巴细胞亚群ＣＤ４的动态等。结果：临床体征有特征性,病程较长,１年内死亡２只（     

两株SIV_(mac)的滴定和特性

SIVmac251的MID100为32TCID，而SIVmac239的MID100高于320TCID。体内滴定感染成功的5只猴（SIVmac2513只，SIVmac2392只）和用ZMID100SIVmac251感染的7只猴感染后有全身淋巴结肿大，并出现规律性的血浆病毒血症和抗体反应。SIVmac251感染的7只恒河猴和2只食蟹猴的淋巴结和脾脏的病理组织学检查，显现规律的SIVmac感染后的组织学变化。上述结果表明两株SIVmac均能诱发SIVmac感染猴的系列表现和变化，可应用于抗艾滋病药物猴体疗效的评价。     

艾滋病病毒感染猴的循环免疫复合物的变化

【目的】观察猴免疫缺陷病毒(SIV)感染猕猴后循环免疫复合物(CIC)的动态变化。【方法】使用SIVmac251感染30只实验猴，并在感染SIV后不同时间点取样，采用补体致敏的酵母茵凝集试验，检测血清CIC水平的变化．并同时检测了68只正常猴的血清作为对照。【结果】30只SIV感染猴在接种后第4周开始检出CIC(总阳性率为30％)，第8周迅速升高并达到高峰46，7％，在第16周降低至33．3％并逐渐下降；从第20周开始，感染猴的CIC浓度维持一较低的滴度和阳性率，接近于正常猴(约10％)。【结论】CIC在SIV急性感染期间出现并升高，但其后伴随着循环中病毒的减少，CIC也逐渐下降。CIC的形成可能无益于控制病毒复制和引导抗病毒免疫，并可能参与了SIV感染后的发病过程。     

猴艾滋病急性期肠粘膜相关淋巴组织NK细胞表型及功能

目的研究猴艾滋病毒感染急性期恒河猴肠道相关淋巴组织(mucosal associated lymphoid tissues,MALTs)NK细胞亚群和功能变化。方法 SIV静脉感染恒河猴后,定期进行动物感染指标测定,并在感染后不同时间点取肠组织,分离派氏淋巴结单个核细胞(peyer’s patch mononuclear cells,PPMC)和粘膜固有层单个核细胞(lamina propria mononuclear cells,LPMC),进行T细胞和NK细胞表面抗体染色,流式分析。结果 SIV感染急性期MALTs CD56CD16+NK细胞亚群比例增幅明显,同时细胞毒性功能增强;CD56-CD16-NK细胞亚群数量减少,功能无明显变化;CD56+CD16+和CD56+CD16-NK细胞数量比例略有增加趋势,但免疫调节功能显著降低。结论SIV感染急性期恒河猴肠道MALTs中NK细胞脱颗粒作用增强,表型功能呈现出较强可塑性。该研究对探索艾滋病粘膜免疫机理、抗病毒治疗及药物研发具有参考意义。     

猴艾滋病模型CD28家族mRNA动态变化及中药干预作用

目的观察猴艾滋病毒(SIV)感染猴模型外周血CD28家族免疫共刺激分子mRNA动态变化及中药复方艾可清的干预作用。方法 SIVmac251感染12只恒河猴,分别于感染前、感染后8周每周、给药前(SIV感染第10周)、给药后每4周时间点采集外周静脉血,分离PBMC,以定量PCR检测CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4及HLA-DRmRNA。结果所观察的4种免疫共刺激分子及免疫活化标志物HLA-DR mRNA量出现了不同程的升高,其中HLA-DRmRNA高峰出现在SIV感染后第2周,而4种免疫共刺激分子mRNA峰值均出现在SIV感染第5周之后。艾可清使ICOS、CD28、PD-1及HLA-DRmRNA量出现不同程度的降低,而对CTLA-4mRNA量无显著影响。结论 SIV感染猴外周血PBMC负性和正性CD28家族免疫共刺激分子mRNA均出现不同程度的升高;艾可清可能通过同时降低正性及负性免疫共刺激分子mRNA表达而减轻艾滋病免疫活化。