海洋来源微生物的分离培养与抗肿瘤活性筛选

目的 从海洋环境样品中分离纯化微生物，经发酵培养与活性筛选，获取抗肿瘤活性菌株以供筛选药源活性产物，获无活性菌株以供核糖体工程转化研究。方法 通过单菌落挑选与划线培养分离纯化微生物菌株，经摇床发酵和提取操作制备活性测试样品。采用MTT法结合显微镜下细胞形态学检测的方法，测试样品的抗肿瘤活性。结果 从渤海湾驴驹河潮间带海泥样品中分离得到了微生物127株，其中真菌80株、放线菌47株。在127株中100 mg·L^-1样品浓度下对K562细胞的抑制率大于40%的活性菌株为8株，占菌株总数的6.3%(其中放线菌4株，占放线菌数的8.5%，真菌4株，占真菌数的5%)，抑制率在20%～40%的放线菌6株，占放线菌数的12.7%。结论 从渤海湾海泥样品中分离得到真菌80株、放线菌47株，从中获得抗肿瘤活性真菌4株、放线菌10株，从放线菌中获得抗肿瘤活性菌株的频率远远高于真菌。活性菌株为寻找药源活性产物提供了菌株，无活性菌株则为核糖体工程拓展药源菌株来源研究提供了资源。     

放线菌野生株代谢功能的核糖体工程改造与新产抗肿瘤活性产物研究

目的 利用核糖体工程技术,改造放线菌次级代谢功能,筛选获得抗肿瘤活性突变株,并对突变株新产活性产物进行研究。方法 以海洋来源无活性放线菌野生株HLF-39和HLF-43为出发菌,通过单菌落挑选与平板划线培养,分离纯化链霉素抗性突变株,通过摇床液态发酵和发酵提取物乙酸乙酯萃取样品的抗肿瘤活性筛选,获得抗肿瘤活性突变株;采用活性跟踪与微量预试先导 放大实验制备组合的实验模式,与原始菌样品对照比较,在快速确定差异活性斑点基础上,组合各种色谱技术,分离纯化突变株新产抗肿瘤活性产物;根据理化性质和波谱数据鉴定化合物结构;采用MTT法测评抗肿瘤活性。结果 链霉素对HLF-39和HLF-43的最低抑菌浓度分别为3和10 mg·L^-1。经抗性筛选,得到对链霉素产生抗性的HLF-39突变株28株、HLF-43突变株204株。在所得突变株中,3株HLF-39突变株和14株HLF-43突变株有抗肿瘤活性,100 mg·L^-1样品对K562细胞的抑制率大于20%;其中,4株分别对11、100、200和300 mg·L-1链霉素产生抗性的HLF-43突变株CHS-21101、CHS-210010、CHS-220002和CHS-230001活性显著,100 mg·L^-1样品对K562细胞的抑制率分别达59.5%、50.0%、44.1%和59.6%。从CHS-21101发酵物中分离得到2个该突变株新产抗肿瘤活性产物,并分别鉴定为环(4-羟脯-亮)二肽（1）和phencomycin（2）。化合物1和2对K562细胞呈抑制活性,100 mg·L^-1抑制率分别为33.9%和21.4%。结论 利用核糖体工程抗性筛选技术,从2株无活性放线菌野生菌株成功筛选得到17株具有抗肿瘤活性的链霉素抗性突变株,从其中1株发酵物中分离鉴定了2个该突变株新产抗肿瘤活性产物。用核糖体工程技术改造无活性放线菌野生株的次级代谢功能,可筛选获得活性突变株并提供深入研究新产活性产物,从中筛选新药及其先导结构,从而拓展药源放线菌活性菌株新资源。     

仙鹤草内生真菌代谢物抗肿瘤成分的研究

目的 从仙鹤草的根茎以及叶中分离内生真菌,并进行初步鉴定及活性筛选.方法 选择Hela,HepG2,Skov3,S-180细胞为指示细胞进行MTT法实验.结果 从仙鹤草的根,茎以及叶中分离共出47株内生真菌,其中20株内生真菌对一种或多种肿瘤细胞有抑制作用,其中根、茎叶,抗肿瘤活性菌株比例分别为40.0%,44.7%及42.1%,其中抗肿瘤活性菌株主要分布于青霉属,曲霉属等10个属中.结论 首次从仙鹤草中分离和鉴定出47株内生真菌,仙鹤草内生真菌中广泛分布着活性菌株.     

一株产长春新碱内生真菌的初步研究

目的 通过长春花叶内生真菌的分离，筛选产生长春新碱的菌株。方法 从长春花叶中分离内生真菌，对其发酵提取物进行TLC和HPLC分析。结果 从长春花叶中分离筛选到一株无孢菌群菌株：97CY3。它能产生长春新碱，HPLC测定其长春新碱含量约为0.205μg／L。结论 长春花内生真菌中，有的菌株可产生与宿主所产相同的抗癌物质长春新碱。     

利用稻瘟霉模型筛选粗疣合叶苔内生真菌中的活性菌株

目的 利用稻瘟霉模型快速筛选粗疣合叶苔内生真菌中具有生物活性的菌株,并对活性菌株 T11 进行鉴定。方法 首次对粗疣合叶苔内生真菌进行了分离,通过观察内生真菌醋酸乙酯提取物引起稻瘟霉分生孢子或菌丝形态生长异常或生长抑制的情况,初步确定具有生物活性的菌株,进一步进行体外抗真菌及抗肿瘤活性筛选,对活性最好的 T11 菌株进行了分类鉴定。结果 粗疣合叶苔分离得到47株内生真菌,具有抗稻瘟霉活性的活性菌株40株,占总分离菌株的 85.1%。其中 T11 号菌株可明显抑制真菌生长和肿瘤细胞增殖。结论 粗疣合叶苔内生真菌具有明显的抗真菌和细胞毒作用,是潜在的抗菌、抗肿瘤药物资源。     

泰山黄精内生真菌的分离鉴定及抑菌活性研究

目的 研究泰山黄精内生真菌的分布及其多样性,并筛选具有抑菌活性的内生真菌。方法 采用平板分离法分离黄精内生真菌,采用滤纸片扩散法测试黄精内生真菌培养物抗耐药菌活性,同时采用分子生物学方法对筛选出的活性菌株进行鉴定。结果 从泰山野生黄精的根、茎、叶和果实中共分离出32株内生真菌,分属于7个属,分布最广的类群是镰刀菌属Fusarium sp.,占总菌株的31.3%,其次是不产孢真菌Sterile mycelia（28.1%）和链格孢属Alternaria sp.（21.9%）。各组织中内生真菌的分布存在一定的组织差异性,根中内生真菌的分离率最高,茎和叶中次之,果实中最少。共有来自5个属的14株内生真菌至少对1种供试菌株有抗菌活性,其中8株具有广谱抗耐药菌活性。对活性最强、抑菌谱最广的不产孢菌株HJG-10进行分子生物学鉴定,将其确定为裂褶菌Schizophyllum commune。结论 泰山黄精中蕴含着大量具有抑菌活性的内生真菌,为寻找和开发新型抑菌生物制剂开辟了一条新途径。     

产紫青霉G59的两株突变株新产抗肿瘤活性产物研究

目的 阐明无活性真菌产紫青霉G59的两株抗肿瘤活性突变株2-2-3和PDN-f-2新产活性产物。方法 采用与原始菌样品直接对照和活性跟踪分离的实验模式,利用液液萃取、柱层析、重结晶等方法分离纯化活性产物。利用现代波谱技术鉴定化合物结构。用MTT法测试样品对K562细胞的抑制活性。结果 从2-2-3和PDN-f-2发酵物中分别分离鉴定了ergone (1) 和citrinin (2)。化合物1和2抑制K562细胞的IC50分别为7.4和48.0 μg/ml。结论 化合物1和2均为产紫青霉产物中未见报道的G59的两株突变株新产活性产物。将无活性真菌野生株转化成活性突变株并研究其新产活性产物,将有可能成为拓展药源真菌活性菌株新资源的很好途径。     

太子参内生真菌体外抗肿瘤、抗氧化活性研究

目的 探讨太子参内生真菌代谢产物的体外抗肿瘤、抗氧化活性. 方法 采用组织块法对太子参内生真菌进行分离,用MTT法检测抗肿瘤活性;DPPH法检测抗氧化活性. 结果 从太子参中共分离出18株内生真菌,其中有6株菌株对肿瘤细胞具有显著的抑制作用(IC50＜200 μg/mL),3株具有较好的抗氧化活性(IC50＜ 100 ...     

厚朴内生真菌的分离鉴定及药理学活性的分析

目的：从要用植物厚朴的枝条的皮质部分离内生真菌,并对抗肿瘤,抑菌等药理学活性进行分析。方法：采用马铃薯葡萄糖培养基（PDA）为分离及发酵培养基,并对分离出的内生真菌进行发酵培养,提取代谢产物进行抑菌活性分析。结果：从来源不同的三种厚朴中共分离出51株内生真菌;分别来自青霉属（Penicillium）,镰刀菌属（Fusarium）,交链孢属（Alternaria）,等20个属。其中青霉属有生长优势。对各菌株发酵液的提取物进行药理学检测,发现各发酵产物均呈现出不同的抗肿瘤及抑菌活性,而其中的13株有抑菌活性。结论：发酵产物中含有大量的抑菌物质。可以并有良好的抑菌效果。可以为下一步开发提供良好的微生物资源基础。     

一株具免疫增强活性红树林真菌的筛选及鉴定

目的对海南红树林土壤层中分离和筛选具有免疫增强活性的真菌菌株进行鉴定,探讨红树林真菌在免疫调节方面的应用价值。方法通过MTT法对分离自红树林的真菌发酵上清进行检测,筛选具有免疫增强活性的菌株,结合形态学特征和rDNAITS序列分析确定其种属分类地位。结果共分离到真菌325株,其中有12株具有促进人外周血淋巴细胞增殖作用,其中菌株PH0016有较强效果。菌落形态观察、光学显微观察、rDNAITS序列测定鉴定菌株PH0016为淡紫色拟青霉（Paeeilomyces lilacinus）。结论PH0016是一株淡紫色拟青霉,其发酵上清具有一定的免疫增强活性,值得进一步研究其活性代谢产物。     

产紫青霉G59的庆大霉素抗性突变株新产抗肿瘤活性产物研究

目的 阐明真菌无活性野生株产紫青霉G59的庆大霉素抗性突变株2-5-3-1新产抗肿瘤活性产物.方法 在活性跟踪和薄层检测指导下,通过与原始菌样品直接对照,利用液液萃取、柱层析、制备薄层层析、重结晶等技术,分离纯化活性产物.根据理化常数和波谱数据鉴定化合物结构.用MTT法测试样品对K562细胞的抑制活性.结果 从突变株2...     

二乙酰二脱水卫矛醇抗瘤作用的实验研究

目的　探讨二乙酰二脱水卫矛醇 (1 ,2 :5 ,6 -Dianhydro - 3 ,4-diacetylgalactitol,DADAG)的体内外抗肿瘤作用。方法　用MTT法观察DADAG对人肿瘤细胞株的抗增殖作用 ;以小鼠脑内移植艾氏腹水癌 (Ehrlichascitescarcinoma,EAC)和DBA/ 2小鼠脑内移植白血病L1 2 1 0为移植瘤模型 ,观察DADAG的体内抗瘤效果。结果　DADAG对HL60细胞和K562细胞有较强的抑制作用 ,IC50 值分别为 3 .7μg·ml- 1 和 2 5 .5μg·ml- 1 。DADAG的高剂量(1 0 .0mg·kg- 1 )对小鼠脑内移植EAC有一定的抑制作用 ,对小鼠的生存期延长率 (increaseoflifespan ,ILS)是 30 % (P <0 .0 5) ;而DADAG的低剂量 6 .4mg·kg- 1 、中剂量 8.0mg·kg- 1 和高剂量 1 0 .0mg·kg- 1 对小鼠脑内移植白血病L1 2 1 0均有明显的抑制作用 ,ILS分别为 35 %、47%和 55 % (P值均 <0 .0 1 )。结论　DADAG有较强的体内外抗瘤作用     

白血病耐药细胞中多药耐药基因MDR1与核转录因子κB的关系

目的:研究核转录因子κB与多药耐药基因MDR1在白血病化疗耐药中的作用,阐明核转录因子κB(NF-κB)与白血病多药耐药的关系及相关分子机制。方法：白血病细胞K562和阿霉素(ADM)诱导的耐药细胞K562/ADM分别应用ADM（0、0.25、0.50、1.00和2.00 μg·L^-1）或丝裂霉素(MIT)（0、2、4、8和16 mg·L^-1）　作用48 h,通过MTT法检测细胞生存率,计算细胞耐药指数;RT-PCR方法检测MDR1和IκB mRNA表达;Western blotting方法检测P-gp和P65的蛋白表达。结果：ADM和MIT分别作用后,与空白对照组比较,白血病细胞K562细胞生存率下降(P<0.01),呈剂量依赖性;ADM和MIT对耐药细胞K562/ADM生存率作用不明显;在mRNA水平上,与K562细胞比较,K562/ADM细胞的MDR1 mRNA高表达(P<0.01)。与空白对照组比较,ADM 0.50和1.00　 μg·L^-1>或MIT 4和8 mg·L^-1分别作用K562细胞和K562/ADM细胞,IκBα mRNA表达均下降(P<0.01),并呈剂量依赖性;在蛋白水平上,与K562细胞比较,K562/ADM细胞的P-gp蛋白高表达(P<0.01)。与空白对照组比较,ADM 0.50和1.00 μg·L^-1或MIT 4和8 mg·L^-1分别作用K562/ADM细胞,P-gp蛋白表达量升高(P<0.01),同时P65蛋白表达量升高,且呈药物剂量依赖性(P<0.01)。结论：MDR1基因及P-gp蛋白的高表达很可能是白血病细胞K562多药耐药性形成的关键机制,而NF-κB的激活可能参与了多药耐药的调控。     

瑞芬太尼在神经外科手术麻醉中靶浓度的研究

目的探讨瑞芬太尼与丙泊酚联合靶控输注(TCI)全凭静脉麻醉在神经外科手术中的适宜TCI靶浓度。方法选择100例ASAⅠ~Ⅲ级择期行开颅手术的患者。丙泊酚麻醉诱导,初始血浆靶质量浓度(简称靶浓度)设为5 mg.L-1,瑞芬太尼血浆靶浓度为3μg.L-1,待患者意识消失后,将丙泊酚血浆靶浓度降低并维持在3 mg.L-1,静脉注射维库溴铵0.1 mg.kg-1,3 min后行气管插管。术中持续监测血流动力学变化,调节瑞芬太尼靶浓度,将无创血压(MAP)维持在基础值的+10%~-20%范围内。间断静脉注射维库溴铵维持肌松。缝合硬膜时静注氯诺昔康8 mg。记录不同麻醉期瑞芬太尼血浆靶浓度和效应室靶浓度,观察麻醉恢复期情况。结果开颅前期(麻醉诱导至切皮)、开颅期(切皮至剪开硬膜)、颅内操作期和关颅期(缝合硬膜至术毕)瑞芬太尼血浆靶浓度分别为(2.98±0.39)μg.L-1、(3.44±0.86)μg.L-1(、3.55±1.00)μg.L-1和(3.33±1.08)μg.L-1,95%置信区间上限分别为3.01μg.L-1、3.52μg.L-1、3.63μg.L-1和3.43μg.L-1;效应室靶浓度分别为(2.83±0.53)μg.L-1、(3.43±0.85)μg.L-1、(3.54±0.99)μg.L-1和(3.31±1.09)μg.L-1,95%置信区间上限分别为2.87μg.L-1、3.50μg.L-1、3.62μg.L-1和3.41μg.L-1。麻醉后呼吸恢复时间为(10±6)min,呼之睁眼时间为(13±8)min,拔管时间为(16±7)min,定向力恢复时间为(21±8)min。结论瑞芬太尼与丙泊酚联合靶控输注静脉麻醉用于神经外科手术诱导迅速,术中血流动力学平稳,术后麻醉恢复快。血浆靶浓度和效应室靶浓度达到平衡的时间短,数值接近,用血浆靶控能够满足临床需要;当丙泊酚血浆靶浓度为3 mg.L-1时,根据95%置信区间上限,建议在开颅前期、开颅期、颅内操作期和关颅期,将瑞芬太尼血浆靶浓度分别设为3.0μg.L-1、3.5μg.L-1、3.6μg.L-1和3.4μg.L-1。     

川芎嗪对转基因多药耐药细胞K562/MDR耐药性的逆转作用

目的：研究川芎嗪（TMP）与环孢菌素A（CsA）单独及联合逆转人红白血病多药耐药细胞K562/MDR的多药耐药性（MDR）,并进一步探讨其耐药逆转机制。方法：分别以倍比稀释后不同浓度的TMP（50～6　400 mg?L^-1 ）和CsA（0.5～256 mg·L^-1 ）作用于体外培养的K562/MDR细胞72 h,采用MTT法检测细胞生长率,确定TMP和CsA的非细胞毒性剂量;采用非细胞毒性剂量,实验分为5组：G1组（TMP+ADM+K562/MDR）、G2组（CsA+ADM+K562/MDR）、G3组（TMP+CsA+ADM+K562/MDR）、阴性对照组（以K562/S代替K562/MDR）、空白对照组（以1640培养基代替药物）,检测各组细胞生长抑制50%的ADM浓度,即IC₅₀,计算耐药倍数和逆转倍数;利用荧光分光光度法检测各组细胞内ADM浓度;流式细胞术检测跨膜糖蛋白P-gp的表达情况。结果：TMP及CsA的非细胞毒性剂量分别为320和2.0 mg·L^-1,K562/MDR细胞的耐药倍数为19.2倍;TMP及CsA均能降低K562/MDR细胞的耐药性,逆转倍数分别为5.2及9.6倍,并且两者联合应用,逆转倍数为15.6倍;TMP和CsA单独及联合应用均能明显增加K562/MDR细胞内ADM浓度;TMP及CsA单独应用均能降低K562/MDR细胞P-gp的表达,并且两者联合应用使K562/MDR细胞P-gp的表达率明显降低,与阴性对照组比较差异有显著性（P<0.01)。结论：TMP和CsA单独及联合应用可逆转K562/MDR细胞对化疗药物ADM的MDR,且两者具有协同作用。其逆转机制可能为降低P-gp水平,升高细胞内ADM浓度,增强对ADM的敏感性,从而发挥治疗肿瘤的作用。     

积雪草中积雪草酸的分离、纯化及其含量测定

目的分离纯化积雪草中积雪草酸,并建立高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)测定积雪草酸的含量。方法超声提取积雪草中积雪草酸,将粗提物用石油醚-丙酮体系在硅胶柱上梯度洗脱,HPLC法测定积雪草酸的含量。色谱条件:采用Waters Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈-10 mmol.L-1乙酸铵溶液(38∶62,V/V),检测波长为210 nm,流速为1.0 mL.min-1,柱温25℃,进样体积为20μL。结果积雪草酸在浓度10～200 mg.L-1线性关系良好(R2=0.999 5),其日内、日间RSD均小于5.4%,回收率为100.5%。积雪草中积雪草酸含量为0.99 g.kg-1。经提取、分离、纯化得到积雪草酸白色粉末,纯度为79.0%。结论本实验所用分析方法简便、准确、重复性好,可用于积雪草酸的含量测定;所用提取分离及纯化积雪草酸的方法可使中药中积雪草酸得到有效富集。