甲状腺激素受体介导的荧光素酶报告基因试验筛查内分泌干扰化学物

目的 采用人源性甲状腺激素受体(TRα/β)的荧光素酶报告基因试验系统筛查内分泌干扰化学物(EDCs),评估双酚A（BPA）、甲萘威和1-萘酚(1-NAP)的拟/抗甲状腺激素活性。 方法 以恒河猴肾细胞(LLC-MK2)作为转染细胞,通过瞬时转染的方法分别构建基于pGL3-promega和pGL4.27的TRα/β的报告基因试验。用三碘甲状腺氨酸（T3）、甲状腺氨酸（T4）作为阳性受试物评价两个检测系统的灵敏性,并检测BPA、甲萘威和1-NAP的拟/抗甲状腺激素活性。 结果 基于pGL3-promega的TRβ的报告基因试验,T3的最低检测限为1.216×10-11 mol/L,在7.482×10-6 mol/L时诱导荧光素酶(Luc)的表达倍数是对照组的5.98倍,半数有效浓度（EC50）为3.327×10-8 mol/L;T4最低检测限为1.622×10-8 mol/L,最大诱导Luc表达的倍数为3.4倍,EC50为2.213×10-7 mol/L。基于pGL4.27的TRβ的报告基因试验中,T3的最低检测限为9.863×10-12 mol/L,在1.671×10-6 mol/L时产生最大诱导Luc表达的倍数为对照组的8.57倍,EC50为3.327×10-8 mol/L;T4最低检测限为1.349×10-9 mol/L,最大诱导Luc表达的倍数是4.6倍,EC50为4.074×10-7 mol/L。用TRβ的报告基因试验系统评价BPA、甲萘威和1-NAP都无甲状腺受体激动剂活性,甲萘威和1-NAP有一定受体拮抗性。 结论 本研究建立的基于pGL3-promega和pGL4.27的TRβ的报告基因试验都有较高的灵敏性,pGL4.27相对更高,可以用来筛查内分泌干扰化学物,检测化学物质的拟/抗甲状腺激素活性。     

建立基于荧光素报告基因系统检测雌激素样物质方法的研究

目的 建立基于报告基因的HeLa细胞体外雌激素样物质检测方法.方法 分别构建含有人雌激素hER α和hER β编码序列的表达质粒以及人雌激素反应元件(estrogen response elements,ERE)调控的荧光素报告质粒,用脂质体将hER α、ERE质粒或hER β、ERE质粒共转染HeLa细胞,用雌二醇(E2)处理后检测报告基因荧光素酶的活性.结果构建了pER αneo和pER βneo质粒以及ERE调控的荧光素酶报告质粒pGL3-ERE-Luc,共转染质粒pERE4-Luc和pER αneo或pERE4-Luchygro和pEP αneo到HeLa细胞株后,建立稳定表迭ERE-Luc的hER α/hEP β HeLa细胞株,实验证实报告基因的表达与E2呈明显的剂量反应关系,ER α和ER β的EC50分别为9.2×10-11mol/L和2.5×10-10mol/L.结论 基于荧光素酶报告基因的体外雌激素样物质检测方法有效可靠.     

雌激素对乳腺癌细胞中PDZK1蛋白表达量的影响

目的观察雌激素17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)及其抑制剂对雌激素受体(estrogen receptor,ER)阳性的乳腺癌细胞株ER-MDA-MB-231、MCF-7中PDZK1(PDZ domain containing1)蛋白表达量的影响。方法应用Western blotting法观察E2及ICI182,780在不同时间、不同浓度作用下2种细胞内PDZK1蛋白表达量的变化。结果浓度为10-8mol/L的E2作用72h可以使MCF-7、ER-MDA-MB-2312株细胞内PDZK1蛋白表达量显著升高;而抑制剂ICI182,780则相反,以10-6mol/L的浓度作用36h即可明显抑制ER-MDA-MB-231细胞中PDZK1蛋白的表达,且以上变化表现出剂量、时间依赖关系。结论PDZK1是雌激素应答蛋白,它在ER阳性的乳腺癌细胞中的表达受雌激素信号转导通路的调节。雌激素及ICI182,780可能通过调节其蛋白表达量来影响肿瘤细胞的生长和耐药性。     

柴胡皂苷d对肝星状细胞内雌激素受体转录激活的影响

【目的】观察柴胡皂苷d对大鼠肝星状细胞内的雌激素受体转录激活的调节作用,探讨柴胡皂苷d的药理机制。【方法】体外培养大鼠肝星状细胞系HSC-T6,将雌激素受体的特异性报告基因ERE-tk-Luc用人工细胞膜介导细胞瞬时转染法转入HSC-T6细胞中,在不同药物浓度、不同时间作用点及加用雌激素受体抑制剂ICI182.780等条件下,采用双荧光素酶报告基因检测系统观察柴胡皂苷d及雌二醇对转染细胞荧光素酶(Luc)表达的影响。【结果】柴胡皂苷d浓度为0.01~5μmol/L、雌二醇浓度为0.01~1μmol/L时,荧光素酶活性呈剂量依赖性递增;柴胡皂苷d为5μmol/L,而雌二醇为1μmol/L时,荧光素酶活性最高;当雌二醇浓度到达5μmol/L时,效应减弱。且以5μmol/L柴胡皂苷D、1μmol/L雌二醇分别诱导细胞24 h时,荧光素酶表达活性最高。ICI182.780可明显抑制柴胡皂苷d、雌二醇对荧光素酶活性的诱导作用。【结论】柴胡皂苷d可促进HSC-T6细胞内雌激素受体转录激活。     

大豆苷元对HEC-1B细胞增殖及雌激素受体报告基因表达的影响

目的探讨大豆苷元对子宫内膜癌细胞增殖的影响及其对雌激素受体报告基因表达的影响。方法体外培养子宫内膜癌细胞子宫内膜癌雌、孕激素受体阴性细胞系(HEC-1B),采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测不同浓度大豆苷元对子宫内膜癌细胞增殖的影响,同时检测大豆苷元对雌激素应答原件(ERE)调控的雌激素受体α(ERα)和雌激素受体β(ERβ)的荧光素酶报告基因表达的影响。结果大豆苷元对HEC-1B细胞体外增殖有明显抑制作用,差异有统计学意义(P<0.01),其抑制作用有明显量效和时效性特征。在浓度为20～80×10-6mol/L的大豆苷元作用下,报告基因luc的表达较正常对照组明显提高,差异有统计学意义(P<0.05),在80×10-6mol/L时到达最高值;大豆苷元通过ERβ介导的报告基因表达水平的升高程度强于ERα,差异有统计学意义(P<0.01)。结论大豆苷元可通过调节子宫内膜癌细胞ERα和ERβ介导的报告基因的表达,调整ERα/ERβ比例,从而抑制子宫内膜癌细胞的增殖。     

hERα-LBD原核表达载体的构建及蛋白表达活性鉴定

目的 构建人雌激素受体α 亚型配体结合区（hERα-LBD）的原核表达载体,并进行表达蛋白的活性鉴定。方法 以hERα -LBD质粒为模板,采用PCR方法扩增hERα -LBD基因,PCR扩增产物鉴定后与T载体（pGEM-T-easy）连接,将连接物转化到感受态细胞中,阳性菌落经酶切和测序鉴定,和pET-28a（+）质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD ,转化到大肠杆菌JM109和BL21感受态细胞中。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细胞表达hERα-LBD融合蛋白;将雌二醇-牛血清白蛋白（BSA）偶联抗原(E2-BSA) 与融合蛋白混合,通过电泳法鉴定hERα-LBD的雌激素配体结合活性。结果 PCR扩增的hERα -LBD基因片段约为1.9 kb,与预期目的片段大小一致。与T载体连接,形成pGM-T-hERα -LBD重组质粒,转化到感受态细胞,阳性菌落酶切和测序鉴定正确,与pET-28a（+）质粒酶切后连接,成功构建原核重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD;在大肠杆菌中异源表达人雌激素受体ERα的配体结合区hERα-LBD蛋白。经亲和色谱法纯化后,hERα-LBD蛋白的表达量可达250 mg/L。电泳法证实hERα-LBD具有雌激素结合活性。结论 成功构建原核重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD,hERα-LBD具有雌激素结合活性。     

异补骨脂素和蜕皮甾酮对人乳腺癌T47D细胞增殖及ER亚型表达的影响

目的利用人乳腺癌T47D细胞观察异补骨脂素和蜕皮甾酮对雌激素受体阳性细胞增殖的作用,并检测其对T47D细胞雌激素受体亚型ERα、ERβ表达的影响。方法采用MTT细胞增殖实验观察中药补骨脂、川牛膝的两种活性成分:异补骨脂素和蜕皮甾酮对ERα、ERβ阳性细胞T47D增殖的影响;通过流式细胞术检测细胞增殖周期的变化;用半定量RT-PCR法检测上述成分对靶细胞ERα、ERβmRNA表达情况的影响。结果10-6mol/L和10-7mol/L异补骨脂素和蜕皮甾酮能够显著促进培养的T47D细胞增殖,提高细胞分裂增殖指数,表现出雌激素样作用;RT-PCR结果显示:10-6mol/L和10-7mol/L异补骨脂素和蜕皮甾酮均可使ERαmRNA表达显著增加,异补骨脂素同时也可提高ERβmRNA表达。结论异补骨脂素和蜕皮甾酮具有植物雌激素作用,并可影响靶细胞ER亚型的mRNA表达水平。     

雌激素受体激动剂对人脐血内皮祖细胞增殖和迁移的影响

目的:观察选择性雌激素受体(ER)激动剂PPT(α亚型激动剂)和DPN(β亚型激动剂)对人脐带血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells EPCs)增殖和迁移的影响,并与17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)的作用进行比较。方法:采用密度梯度离心法分离获得脐带血单个核细胞,硫氰酸荧光素标记荆豆凝集素I(FITC-UEA-I)、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)双染及CD133免疫荧光鉴定EPCs。培养的EPCs分别加入不同浓度的E2、PPT和DPN(分别为1×10-10mol/L、1×10-9mol/L、1×10-8mol/L、1×10-7mol/L)进行细胞增殖实验分析(WST)、显微镜下EPCs计数及Transwell技术测定对EPCs迁移的影响。结果:E2及PPT呈浓度依赖性促进EPCs的增殖和迁移,PPT刺激作用等同于E2,DPN无刺激作用。结论:雌激素α亚型激动剂PPT明显刺激内皮祖细胞的增殖和迁移,其作用与17β-雌二醇相同。     

基于荧光素酶报告基因的MCF7细胞雌激素样物质检测方法的建立

目的:建立基于报告基因的MCF7细胞体外雌激素样物质检测方法,并研究2,2-双(对氯苯基)-1,1,1-三氯乙烷(2,4-DDT)和甲氧氯(METH)的雌激素样作用.方法:合成人雌激素反应元件(ERE)核心片段并将其插入pGL3-promoter载体的多克隆位点,构建成雌激素反应元件ERE调控的报告质粒pERE-Luc,用脂质体转染法将pERE-Luc及内对照质粒phRL-SV40瞬时转染MCF7细胞,用17β-雌二醇(E2)及受体拮抗剂三苯氧胺(TAM)等处理后检测报告基因荧光素酶的表达,并用雌激素样物质2,4-DDT和METH对方法的有效性进行验证.结果:构建了ERE调控的报告质粒pERE-Luc,转染pERE-Luc的MCF7细胞报告基因的表达与E2呈明显的剂量反应关系,1×10-11mol/L E2可引起报告基因表达,至1×10-9mol/L可达到最大表达值,而未转染pERE-Luc时与E2无明显反应,TAM可以显著抑制E2引起的报告基因的表达.验证结果表明,2,4-DDT浓度>1×10-7mol/L及METH浓度>1×10-6mol/L时可产生雌激素样活性,2,4-DDT的雌激素样活性强于METH.结论:建立的基于荧光素酶报告基因的体外雌激素样物质检测方法有效可靠,以此方法检测2,4-DDT和METH显示有明显的雌激素样活性作用.     

雌激素受体α36介导雌激素促进甲状腺乳头状癌细胞增殖的分子机制

目的 研究雌激素受体α36(estrogen receptor alpha-36,ERα36)介导雌激素促进甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)细胞增殖的分子机制及相关信号通路.方法 采用免疫组化(S-P)检测ERα36在34例人PTC组织标本及其21例配对癌旁组织标本中的表达;梯度浓度E2(0、10-7、10-8、10-9 mol/L)处理PTC细胞株K-1和BCPAP后,Western blot检测两种细胞株中ERα36的表达;10-8 mol/L E2处理后,Western blot检测两种细胞株ERK1/2和AKT磷酸化水平的变化,以及ERα36-siRNA对其的抑制作用;梯度浓度的E2处理BCPAP细胞后,MTT法检测细胞增殖和ERα36-siRNA对增殖的抑制作用.结果 在人PTC组织中ERα36的阳性表达率为82.4％,明显高于癌旁组织(P＜0.05).PTC细胞株K-1和BCPAP均表达ERα36;10-8 mol/L E2处理细胞后,ERα36的表达增高,且呈时间依赖性.E2能促进BCPAP和K-1细胞ERK1/2和AKT蛋白磷酸化水平增高,且处理15 ain时BCPAP细胞最明显,10 min时K-1细胞最明显,而ERα36-siRNA能抑制E2的诱导效果;E2促进BAPAP细胞增殖,ERα36-siRNA则抑制E2的诱导效果.结论 ERα36通过ERK/AKT途径介导雌激素促进PTC细胞增殖.     

基于报告基因系统的肝细胞核因子4α活性检测体系的建立

目的 建立一个基于荧光素酶报告基因系统的肝细胞核因子4α(HNF4α)活性检测系统,筛选可调控HNF4α活性的小分子化合物.方法 采用亲和层析法纯化HNF4α蛋白,行蛋白热迁移实验检测相关DNA片段及小分子化合物与HNF4α蛋白的直接相互作用.分别构建含有3个拷贝和9个拷贝的Ninjurin 1(NINJ1)基因启动子区HNF4α反应元件的荧光素酶报告基因质粒pGL3-NINJ1-3p和pGL3-NINJ1-9p,转染肝癌细胞,采用荧光素酶报告基因法检测肝癌细胞内HNF4α转录活性的改变,qPCR检测小分子化合物木犀草素或阿尔维林处理后肝癌细胞中HNF4α及下游基因的表达情况,荧光素酶报告基因法检测小分子化合物处理后细胞内HNF4α转录活性的改变.结果 蛋白热迁移实验证实,NINJ1基因启动子区HNF4α的DNA结合片段可与HNF4α蛋白结合.在过表达HNF4α的肝癌细胞中,pGL3-NINJ1-3p和pGL3-NINJ1-9p均可检测到肝癌细胞中HNF4α活性的改变,且pGL3-NINJ1-9p较pGL3-NINJ1-3p的检测灵敏度更高(P＜0.01).木犀草素和阿尔维林与HNF4α蛋白存在直接相互作用,分别下调和上调HNF4α靶基因;pGL3-NINJ1-9p可检测到木犀草素和阿尔维林对HNF4α转录活性的影响.结论 利用报告基因载体pGL3-NINJ1-9p成功建立了HNF4α活性的检测系统,为筛选调控HNF4α活性的小分子化合物等提供了基础工具.     

HMGB2启动子报告基因载体的构建、活性验证及与其结合的转录因子的预测

目的: 构建高迁移率族蛋白B2(high mobility group box2,HMGB2)启动子荧光素酶报告基因载体,并对其进行活性验证,预测可能与HMGB2启动子结合的转录因子。方法: 在NCBI Genbank数据库中查询HMGB2基因启动子区域序列,运用PCR扩增HMGB2启动子序列片段,将其克隆至pGL3-Basic载体中,构建重组质粒pGL3-HMGB2-promoter,并通过双酶切和测定核酸序列鉴定。采用虫荧光素酶报告实验验证pGL3-HMGB2-promoter重组质粒的活性,进一步通过在线软件PROMO预测可以与HMGB2启动子序列结合的转录因子。结果： 经限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列比对,证实pGL3-HMGB2-promoter重组质粒构建成功。虫荧光素酶报告实验结果显示,构建的重组质粒具有启动子活性。PROMO在线软件分析结果表明,有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合。 结论： 成功构建了含有HMGB2启动子序列的荧光素酶报告基因重组质粒,该质粒具有启动子活性,且有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合,促进HMGB2的转录。     

人细胞表面黏附分子P选择素启动子报告基因的构建及鉴定

目的构建人细胞表面黏附分子P选择素（p-selectin）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,检测其 转录活性,并应用于筛选药物对其转录活性的影响。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的p-selectin启动子序列并设 计两端引物,扩增人基因组DNA中的p-selectin启动子。用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和p-selectin启 动子后,将p-selectin基因启动子插入到pGL3-basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-pselectin-promoter。将其与内参 质粒pRL-SV40瞬时共转染293F细胞,检测双荧光素酶活性。对不同启动子片段长度的p选择素报告基因进行双荧光素酶的 检测。以炎症因子和药物分组刺激转染了报告基因质粒的293F细胞并检测双荧光素酶活性。结果成功构建p-selectin基因启 动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-pselectin-promoter/ pRL-SV40 组荧光素酶活性为0.8573±0.4703,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40 组的荧光素酶活性值0.03955±0.05894。 pGL3-1826 bp相比较于pGL3-1092 bp组和pGL3-3738 bp组具有最强的转录活性。炎症因子LPS和TNF-α和药物As2O3均具 有上调pGL3-pselectin-promoter转录活性的作用。结论pGL3-pselectin-promoter在293F细胞中能被转录激活,并验证了炎症 因子对其转录表达的作用,并为药物筛选与评价提供解决方案。     

小鼠PGC-1α基因启动子的转录调控功能分析

目的 克隆小鼠PGC-1α基因的启动子并分析其转录调控模式.方法 设计引物,以小鼠肝脏组织DNA 为模板,PCR扩增PGC-1α基因启动子区并克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic 中,构建具有PGC-1α启动子转录活性的报告质粒pGL3-PGC-1α-Luc.通过特异性引物,引入替换碱基突变相关转录因子调控模序,构建点突变融合载体,并将其转染1c1c7 及c2c12 细胞系,检测荧光素酶的表达情况.结果 构建的pGL3-PGC-1α-Luc 系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA 测序分析都显示正确;PGC-1α基因启动子区域（-2533~＋78）具有较强的转录活性;突变失活PGC-1α基因启动子区域中的CRE及IRE反应原件导致转录活性明显降低.结论 成功构建小鼠PGC-1α基因启动子报告质粒,PGC-1α基因上游区域（-2533~＋78）具有较强的启动子活性;启动子区域中的CRE和IRE反应原件为主要转录调控位点.     

稳定表达人α-分泌酶adam10基因启动子荧光素酶报告基因细胞系的构建研究

目的 构建携带adam10基因启动子的荧光素酶报告载体,筛选稳定表达细胞系并分析其活性.方法 提取人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)基因组DNA,以其为模板,PCR扩增adam10基因启动子并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.17中,构建adam10基因启动子荧光素酶报告载体pGL4.17-adam10,将其转染SH-SY5Y细胞(无启动子的pGL4.17载体作阴性对照,带有CMV启动子的pGL4.51载体作阳性对照),经G418进行稳定表达株的筛选,用1μmol/L维甲酸处理细胞4d后检测其荧光活性.结果 成功扩增到438 bp的adam10基因启动子,pGL4.17-adam10经PCR和双酶切鉴定均正确.SH-SY5Y细胞被该载体转染后经G418筛选得到稳定表达adam10基因启动子的细胞株,经检测具有较强的转录活性;1μmol/L雏甲酸能诱导adam10基因启动子高效表达.结论 成功构建了人adam10基因启动子荧光素酶报告载体,adam10基因启动子在SH-SY5Y细胞中能稳定表达,为深入研究adam10基因的表达调控、多态性分析及其高通量药物筛选提供基础.     

转录因子MZF1对大鼠RGC32基因启动活性的影响及可能的结合部位

目的 :构建大鼠补体应答基因32(response gene to complement,RGC32)启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察人胚肾细胞(HEK293)过表达髓锌指基因1(myeloid zinc finger gene1,MZF1)对大鼠RGC32基因启动活性的影响。同时,筛选其可能的MZF1结合位点。方法:将RGC32基因启动子全长(-686~-1 nt)插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得RGC32基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-RGC32-FL)后,再将p GL3-RGC32-FL与本课题组前期构建的大鼠野生型MZF1表达质粒(p IRES2-EGFP-MZF1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,以确定MZF1对RGC32基因的启动作用。另用生物信息学软件预测RGC32基因启动子上转录因子MZF1潜在的结合位点,并据此构建3个RGC32基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3)。将上述RGC32基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒与MZF1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,以筛选MZF1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠RGC32基因启动子(全长和各截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-RGC32-FL和p IRES2-EGFPMZF1共转染HEK293细胞发现,RGC32基因启动子活性显著增加。而将p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3分别与p IRES2-EGFP-MZF1共转染HEK293细胞后显示,p GL3-RGC32-3的启动活性显著低于p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1和p GL3-RGC32-2。提示MZF1可能结合在RGC32基因启动子的-286~-86 nt区域。结论 :成功构建了大鼠RGC32基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,证实过表达MZF1可促进RGC32基因的启动,并初步筛查出转录因子MZF1在RGC32基因启动子上可能的结合区域。     

大鼠XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1,XAF1)基因启动子(全长和截断)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞HEK293中过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对XAF1基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-1结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠XAF1基因启动子序列(-1497 ~ +166 nt),将XAF1基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中获得pGL3-XAF1-QC,与大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对XAF1基因的启动作用?同时,应用生物信息学软件预测XAF1基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒(pGL3-XAF1-1?pGL3-XAF1-2?pGL3-XAF1-3和pGL3-XAF1-4)?将上述全长和各截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-XAF1-QC和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,XAF1基因启动子活性显著增加?而将pGL3-XAF1-QC?pGL3-XAF1(1~4号)和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-XAF1-3的启动活性显著低于pGL3-XAF1-1和pGL3-XAF1-2?提示IRF-1可能结合在大鼠XAF1基因启动子的-337 ~ -47 nt区域?结论:本实验成功构建了大鼠全长及截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在XAF1基因启动子上的结合区域,为后续研究奠定了基础?     

二甲双胍和LPS通过转录因子RUNX2调控NFATc2基因的转录

目的 构建人T细胞活化核因子C2（NFATc2）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NFATc2-promoter,检测其转录活性,探究二甲双胍和脂多糖对其转录活性的影响。方法 利用UCSC网站查找人NFATc2基因的启动子序列并设计上下游引物PCR扩增人NFATc2基因启动子片段;用限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ双酶切质粒pGL3-basic,将人NFATc2基因启动子片段插入到pGL3-basic质粒,重组质粒命名为pGL3-NFATc2-promoter。将pGL3-NFATc2-promoter与内参质粒pRL-TK共转染293F细胞,检测其荧光素酶活性。同时构建人NFATc2基因启动子不同片段长度的报告基因载体并进行荧光素酶活性检测,分别给予不同浓度的二甲双胍和脂多糖处理24 h后检测二甲双胍和脂多糖对NFATc2转录活性的影响。进一步突变NFATC2基因启动子上转录因子RUNX2的结合位点探究二甲双胍和脂多糖对NFATc2的转录调控作用。结果 研究成功构建了不同片段长度（2170、2077、1802、1651、1083、323 bp）的人NFATC2基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NFATc2-promoter,经酶切及测序鉴定完全正确。将不同片段长度的pGL3-NFATc2-promoter转染到293F细胞,发现pGL3-1651 bp具有最高转录活性,荧光素酶活性约为pGL3-2170 bp的3.3倍（1.8433±0.1457 vs 0.5467±0.0850）。中浓度（5 mmol/L）和高浓度（10 mmol/L）的二甲双胍分别上调pGL3-1651 bp的转录活性多达2.5、3倍（1.3467±0.1601 vs 0.8867±0.0321,1.8124±0.2771 vs 0.8867±0.0321）。不同剂量的脂多糖均能上调pGL3-1651 bp的转录活性不低于1.6倍（1.4813±0.0616 vs 0.8867±0.0321）。突变pGL3-1651 bp上的RUNX2结合位点后,二甲双胍和脂多糖上调的pGL3-1651 bp转录活性均受到抑制,转录活性下降（2.1667±0.1527 vs 1.233±0.1155;2.3667±0.2887 vs 1.1333±0.3786）。结论 pGL3-NFATc2-promoter在293F细胞中能被转录激活,并证实脂多糖和二甲双胍转录激活pGL3-NFATc2-promoter依赖于转录因RUNX2。