MDA在PCR-RFLP基因分型中的实用性

目的:评估多重置换扩增(MDA)在聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)基因分型中的实用性.方法:用MDA法对50例样本进行了全基因组扩增,并用扩增后的DNA作为模板,对两个单核苷酸多态性(SNP)进行了PCR-RFLP基因分型.结果:对于所检测的两个SNP,以经MDA扩增的基因组DNA为模板,与未经MDA扩增的基因组DNA为模板进行的PCR-RFLP基因分型,结果完全一致.结论:MDA可用于PCR-RFLP等遗传分析.     

西藏藏族群体15个短串联重复序列位点的遗传多态性研究

目的获得15个短串联重复（Short tandem repeat，STR）基因座在西藏藏族人群中的基因型及等位片段频率分布，获得相应位点的群体遗传学数据。方法126份EDTA抗凝血样采自西藏藏族地区无血缘关系的藏族个体。Chelex法提取DNA，PCR复合扩增，自动基因分析仪电泳收集电泳结果数据，基因扫描分析软件计算扩增产物片段相对大小，基因分型软件进行样本基因型分型。结果全部样本的每个STR基因座都获得了清晰的基因型分型结果。15个STR基因座的杂合度介于0.627-0.897之间。累计非父排除率和累计个人识别机率为0.999999527和〉0.999999999。结论经一次扩增电泳可获得15个STR基因座的基因型分型结果，累计非父排除率和累计个人识别机率较高，适用于法医学亲权鉴定和个人识别。     

HLA-DRB1基因芯片与PCR-SSP分型的比较

目的：比较基因芯片和PCR-SSP用于汉族南方人群HLA-DRB1基因分型的结果，评价分型芯片的准确性。方法：77份待分型样本，分别用等位基因特异的PCR-SSP和基因分型芯片对DRB1分型。芯片分型通过组间特异引物扩增基因组DNA，扩增用荧光标记。扩增标记后的产物与分型芯片的探针杂交，通过杂交产生的荧光信号确定样品的HLA-DRB1基因亚型，比较两种方法分型所获得的结果，不吻合的样本全部经第三方验证或测序。结果：77份样本，两种方法分型全部成功。分型结果的吻合率为93％。不吻合样本6份，其中SSP定型纯合子4份，芯片分型全部为杂合子。经第三方验证，证实芯片对纯合子和杂合子的分型全部正确。另外2份不吻合的样本经测序，证实SSP分型错误1份，芯片分型错误1份。芯片的重复率为96％。结论：基因芯片是一种理想的分型方法，具有特异性高、重复性好、操作简便、所需样本量少、一次可作多份样本的优点。     

两种肠道腺病毒基因型分型方法的比较

目的研究简便快速肠道腺病毒基因型分型方法。方法采集137例非腹泻人群的粪便样本,在A549细胞中培养,提取病变细胞的基因组DNA进行PCR扩增或直接提取粪便悬液过滤上清基因组DNA进行巢式PCR扩增,对PCR阳性者进行克隆、测序以及基因型分型。结果137份样本中,两种方法均有17份样本检出腺病毒,阳性率为12．4％（17／137）。序列分析显示,两种方法检出的腺病毒型别一致。这17份样本分别属于人腺病毒5型（5份）、7型（3份）、12型（3份）及48型（6份）。结论两种方法的敏感性、特异性一样,但方法二是直接提取粪便悬液过滤上清基因组DNA进行巢式PCR扩增,无需方法一需进行3次体外细胞感染实验后从病变细胞中提取基因组DNA进行PCR扩增,节省实验的时间及成本,特别是避免体外细胞感染过程中可能出现的污染,值得推荐。     

内蒙古某部训练基地鼠类中检测到巴贝西原虫DNA片段

目的了解某部基地鼠中巴贝西原虫感染情况。方法采用巢式PCR对20份鼠肝脏标本中基因组DNA进行扩增,对阳性样本进行测序和分析。结果 PCR产物凝胶电泳结果显示,有1份来自褐家鼠的样本为阳性。序列测定并分析显示,该PCR扩增序列与猎户巴贝西原虫同源性高达96%。结论某部基地鼠类中检测到巴贝西原虫DNA片段,提示该基地鼠类存在巴贝西原虫感染性风险。     

基因芯片在中国南方汉族人白细胞抗原-DRB分型中的应用

目的 建立一种用于HLA-DRB分型的基因芯片。并通过与PCR-SSP比较。评价芯片的性能。方法 根据中国汉族南方人常见的HLA-DRB位点基因及其多态性的独特序列。在第二外显子区域设计特异性的寡核苷酸分型探针。将其点在玻片上,制成芯片。基因组DNA通过组间特异引物扩增。扩增中同时用荧光素Ｃy5标记,扩增标记后的产物与结合在芯片上的探针进行杂交,通过荧光扫描仪对杂交产生的荧光信号值进行分析。确定样品的HLA-DRB基因亚型,将这一方法应用于110份样本的HLA-DRB基因分型并与PCR-SS究型的结果进行比较。结果 110份淋巴细胞样本,除1份PCR无产物致芯片不能分型外,其余样本芯片分型全部成功。不吻合样本10份;其中SSP定型纯合子6份,芯片分型全部为杂合子,SSP定型为杂合子1份,芯片结果为纯合。经第三方用PCR-SO验证,证实芯片分型正确。另外3份不吻合的样本经测序,证实SSP分型错误2分。芯片分型错误1份。芯片的重复率为95%。结论 基因芯片是一种理想的分型方法,具有特异性高,重复性好。操作简便,所需样本量少。结果判读容易,一次可作多份样本的优点。     

检测痕量DNA CYP17基因MspA1I多态性方法探讨

目的建立一种有效的检测痕量DNA细胞色素P45017α酶基因MspA1I多态性的方法。方法利用自行设计引物扩增短DNA片段(208bp)，替代扩增长DNA片段(459bp)的Garey法，检测痕量模板DNA的CYP17基因多态性。结果得到了稳定的、重复性良好的目的DNA片段，使MspA1I多态性分型简便，易行。结论提示可将扩增的短DNA片段替代长DNA片段的原理和方法推广应用于其他痕量DNA多态性分型。     

应用巢式PCR方法对低模板量DNA的流脑病例标本进行MLST分型检测

目的应用巢式PCR方法对低模板量DNA的流脑样本进行MLST分型检测。方法根据脑膜炎奈瑟菌MLST分型检测所选择的管家基因序列选择巢式PCR所需要的引物,对低模板量DNA的流脑样本进行MLST分型检测。结果对6份血清、脑脊液标本进行MLST分型检测,其中3份标本检测成功。结论巢式PCR方法提高了低模板量DNA的流脑样本的MLST分型检测的敏感性。     

两种恒河猴肠道腺病毒基因型分型方法的比较分析

目的通过对两种肠道腺病毒基因型分型方法进行比较,以寻找出简便快速的肠道腺病毒基因型分型方法。方法采集57例圈养的恒河猴粪便样本,方法一：将粪便悬液过滤上清感染BSC-1细胞,提取病变细胞的基因组DNA进行PCR扩增,然后克隆、测序,确定病毒基因型;方法二：从粪便悬液过滤上清中直接提取基因组DNA进行巢式PCR扩增,对PCR阳性者进行克隆、测序以及基因型分型。结果 57份样本中,两种方法均有12份样本检出腺病毒,阳性率为21.1%（12/57）。系统进化分析显示,两种方法检出的腺病毒型别一致。提示这些序列主要可分为两大组：类SAdV-6组（2个非重复序列）和类SAdV-7组（9个非重复序列）。此外,有三个克隆,其最相似序列分别为：SAdV-1、SAdV-3和HAdV-52。结论虽然两种方法的敏感性、特异性一样,但方法二是直接提取粪便悬液过滤上清基因组DNA进行巢式PCR扩增,而无需方法一进行3次体外细胞感染实验后从病变细胞中提取基因组DNA进行PCR扩增,节省了实验的时间及成本,特别是避免了体外细胞感染过程中可能出现的污染,因此值得推荐。     

一种快速聚合酶链式反应方法的探究和法医学应用

目的 优化和建立一套快速聚合酶链式反应(PCR)扩增体系和程序,缩短扩增时间,提高短串联重复序列分型的速率和办案效率.方法 运用AmpFLSTR(R) Identifiler(R) Plus试剂盒和7种快速扩增酶进行筛选和优化,最后对筛选出的酶优化其扩增体系和扩增程序,并对几种常规检材中提取的DNA进行扩增和检测,然后对其分型结果进行验证和讨论.结果 最终优化的扩增程序由常规的3h左右缩短至24 min,DNA检验结果与常规方法一致.结论 应用优化后的快速PCR扩增体系可以成功准确扩增DNA样本,显著提高DNA分型速率.     

利用多重PCR检测3种食源性致病菌

目的旨在建立一种可以同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的多重PCR方法。方法以金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌invA、志贺氏菌ipaH基因作为靶序列设计3对特异性引物,进行PCR反应得到223bp、302 bp、369 bp扩增片段,经测序证实扩增产物为目的片段。结果采用建立的FTA滤膜结合多重PCR的检测方法同时对这3种食源性致病菌进行检测,灵敏度均达到102 cfu/ml。结论该方法灵敏度高、耗时短,可用于同时检测3种致病菌,为预防控制细菌性食物中毒的暴发流行提供了新的检测方法。     

先天致畸病原体感染多重PCR检测方法的建立

目的：建立先天多种病原体（ＴＯＲＣＨ）感染的多重ＰＣＲ诊断方法。方法：选择弓形虫、巨细胞病毒、Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒特异性基因片段,按照多重ＰＣＲ引物设计的特殊要求,各设计一对引物,以四种病原体标准株为模板进行扩增。找出各病原体最佳扩增条件,再进行综合分析,最终找到一个理想的多得扩增条件,结果：各病原体扩增片段及多重ＰＣＲ扩增条带均清晰、均一,产量较高,无非特异扩增,片段长度与理论值一致;ＤＮＡ测     

多重聚合酶链反应检测食品中致病性小肠结肠炎耶尔森菌和伤寒沙门氏菌

[目的 ]快速准确地检测致病性小肠结肠炎耶尔森菌和伤寒沙门氏菌 .[方法 ]根据小肠结肠炎耶尔森菌的ail基因和ST的H1 d基因顺序设计二对引物 ,通过聚合酶链反应检测食品中的小肠结肠炎耶尔森菌和伤寒沙门氏菌 ,扩增产物经电泳 ,分别出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的 170和 4 5 8bp的ail和H1 d基因片断的条带时即判定该样品为阳性 .[结果和结论 ]本法特异性强、灵敏度高 ,能在60h内出结果 ,适用于食品中小肠结肠炎耶尔森菌和伤寒沙门氏菌的快速检验 .     

HIV-1基因限制性显示片段的克隆与序列分析

目的　克隆并分析经限制性显示－聚合酶链反应（ＲＤ－ＰＣＲ）扩增的ＨＩＶ－１基因片段。方法　将所有ＨＩＶ－１基因片段 分成１０组并进行ＲＤ－ＰＣＲ扩增,纯化各组ＰＣＲ产物后将之克隆至Ｔ载体上并快速鉴定。从阳性克隆中提取质粒,扩 增靶片段并测序。结果　序列分析表明,所扩增的片段均属于ＨＩＶ基因。结论　改良了一种多片段的克隆及鉴定方法并 用于限制性显示扩增片段的克隆。     

用DNA-PCR方法于基因组水平检测K562细胞及慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因

目的：在慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞系K562及慢粒患者中尝试基于DNA水平的bcr／abl融合基因检测方法。方法：以Waller的“L—T DNA PCR”方法为基础，并针对其引物位置设计的缺陷，改进设计了一套DNA—PCR引物，分别提取K562细胞及慢粒患者外周血单个核细胞DNA，进行bcr／abl融合基因扩增，并对扩增片段进行序列测定。结果：运用DNA—PCR方法成功地扩增出了K562细胞及2名CML患者外周血基因组的bcr／abl融合基因片段，随后进行的片段测序进一步明确了融合基因的断裂位点。结论：DNA—PCR提供了一种基于基因组DNA水平的新检测手段，结合测序能鉴定融合基因的断裂位点，若结合定量PCR的方法则能监测患者的治疗效果与预后，还能检测患者经化疗后的残留微小病灶。     

鸡胚致死孤儿病毒（CELO）和鸡减蛋综合症病毒（EDS） 多重PCR检测方法的建立及初步应用

【摘要】目的 建立鸡胚致死孤儿病毒（CELO）和鸡减蛋综合症病毒（EDS）的多重PCR检测方法并进行初步应用。方法 参照GenBank提供的基因序列,设计了2对特异性引物分别扩增CELO长纤突蛋白和EDS六邻体蛋白的基因序列,建立检测CELO和EDS的多重PCR方法,考察该方法的特异性和敏感性,并使用该方法检测流感疫苗主种子批病毒是否存在外源性禽腺病毒的污染。结果 该多重PCR方法成功扩增得到了两条特异性目的条带,并经测序验证。该方法特异性好,灵敏度显示核酸最低检测量可达10-4ug/ml。使用该方法检测12批次流感疫苗主种子批病毒,外源性禽腺病毒的检测结果均为阴性。结论 成功建立鸡胚致死孤儿病毒和鸡减蛋综合症病毒的多重PCR检测方法,灵敏度高,特异性好。在流感疫苗主种子批病毒的外源性禽腺病毒的检测中具有很高的使用价值和应用前景。     

细菌性感染性腹泻常见病原菌的多重PCR检测

目的:建立一种能同时检测细菌性感染性腹泻标本中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的多重聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法:根据沙门菌的invA基因序列、志贺菌的ipaH基因序列、金黄色葡萄球菌的nuc基因序列、副溶血性弧菌的tdh基因序列设计特异性引物,通过多重PCR反应对样品中上述4种病原茵的目标基因进行扩增,同时优化反应体系。结果:本方法的特异性和灵敏性良好,该方法能检测的灵敏度分别为103.56pg的沙门菌DNA,94.85pg的志贺菌DNA,14.1pg的金黄色葡萄球菌DNA,115.32pg的副溶血性弧菌DNA。结论:该方法特异性和灵敏度高,检测周期短,适用于细菌性感染性腹泻标本中多种致病菌的快速检测,具有较好的应用前景。     

人SAMHD1基因核心启动子区域的初步鉴定和分析

目的 鉴定人不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1 (SAMHD1)基因的核心启动子区域,研究SAMHD1的转录调控机制.方法 从HepG2细胞中提取基因组DNA,PCR扩增SAMHD1基因翻译起始位点上游937、667、553、399 bp片段.将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体,双酶切鉴定后将DNA条带切胶回收,再连入pGL3-Basic载体中,双酶切及DNA测序鉴定.将包含有4个片段的荧光素酶表达载体与pRL-TK共转染HepG2细胞,荧光素酶报告基因活性检测并分析4个片段的启动子活性.5'RACE鉴定SAMHD1在HepG2细胞中的转录起始位点.结果 电泳结果显示已经从HepG细胞中提取出基因组DNA.PCR扩增后电泳结果显示已经扩增出937、667、553、399 bp片段.双酶切后电泳结果显示成功将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体.双酶切及DNA测序鉴定已成功构建荧光素酶表达载体pGL3-937、pGL3-667、pGL3-553和pGL3-399.荧光素酶报告基因活性检测显示SAMHD1核心启动子区域位于0～-399区域(ATG前一个碱基为-1).5'RACE结果显示SAMHD1在HepG2细胞中转录起始位点位于-101.结论 SAMHD1的核心启动子位于翻译起始位点上游-101～-399区域,为深入研究肝细胞中SAMHD1转录调控机制奠定了基础.     

十三种致病菌多重PCR技术检测

目的探讨致病菌多重PCR检测方法。方法利用13种在突发公共事件中可能出现在饮用水水源水体中的致病细菌的特异性序列为靶序列,设计了14对特异性引物并分成3组进行多重PCR反应,建立并优化了多重PCR检测体系。结果通过实验确定适宜的退火温度为66~68℃;3组检测引物的添加比例分别为:第1组引物添加比例为Shi∶Sa∶O157∶Ec∶Sen=1∶1∶1∶2∶3~1∶1∶1∶3∶4,第2组引物添加比例为Lm∶Lp∶Kp∶Hp=1∶1∶4∶1,而第3组引物添加比例为MT∶VC∶BA∶YP∶16S=8∶1∶8∶4∶4;混合引物的用量为0.6~0.8μL。多重PCR的基因组DNA检测灵敏度可达到2×10-2ng/μL;配合浓缩集菌设备,使用研究中建立的多重PCR体系,肠炎沙门菌培养液的检测下限可以达到103cfu/mL。结论该多重PCR检测方法操作简单,速度快,灵敏度高,稳定性和重复性好,具有较广阔的应用前景和较大的经济与社会效益。     

Clinical Identification of Common Species of Dermatophytes by PCR and PCR-RFLP

Summary: To find a fast and efficient way of identifying seven common dermatophytes in clinical practice, we used the techniques of polymerase chain reaction (PCR) and PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) targeting Topoisomerase Ⅱ gene. The DNA of 7 dermatophytes, along with Candida albicans, Aspergillus terreus and Aspergillus flavus were amplified by consensus primer dPsD1. They were then subjected to a second PCR with primers dPsD2 and species-specific primers PsT and PsME separately. 6 of the products generated by dPsD2 were digested with restriction enzyme Hinc Ⅱ. DNA fragments of 3390 bp and 2380 bp was amplified by using consensus primer dPsD1 and dPsD2 from the genomic DNA of each dermatophyte species separately. By combining the results of the two species-specific primer sets (PsT and PsME), all species of dermatophyte yielded unique sizes-set of PCR products expect for T. mentagrophytes and T. tonsurans.From the restriction profiles of Hine Ⅱ , 6 of the 7 dermatophytoses were diagnosed to species levelincluding T. mentagrophytes and T. tonsurans. By combining the results of the PCR and PCR-RFLP, the 7 common dermatophytes can be identified to species level. It is conclude that the multiplex PCR and PCR-RFLP identification targeting the DNA topoisomerase Ⅱ gene is rapid and efficient.