硫氧环蛋白过氧化物酶3对血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大的影响

目的：观察硫氧环蛋白过氧化物酶3（Prdx-3）在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导心肌细胞肥大中的作用,并探讨其作用机制。方法体外培养心肌细胞（H9C2）随机分为对照组、AngⅡ组、AngⅡ+转染对照组和AngⅡ+Prdx-3转染组。脂质体转染法将Prdx-3表达质粒转染心肌细胞,Western blot法检测Prdx-3蛋白表达,Real-time PCR法检测脑钠素（BNP）mRNA表达,二氯荧光素二乙酸（DCFH-DA）检测活性氧（ROS）水平。结果 Prdx-3表达质粒转染心肌细胞后,Prdx-3蛋白表达值为（0.88±0.12）,高于转染对照组（0.38±0.05）,差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较,AngⅡ组BNP mRNA[（1.00±0.00）比（1.72±0.29）]、ROS[（3473±81）比（4439±111）]及Prdx-3蛋白表达水平[（0.33±0.05）比（0.72±0.14）]均明显增加,差异均有统计学意义（均P<0.05）。 AngⅡ+转染对照组和AngⅡ组的BNP mRNA [（1.72±0.29）比（1.94±0.34）]、ROS [（4439±111）比（4285±167）]及Prdx-3蛋白水平[（0.72±0.14）比（0.75±0.11）]比较,差异无统计学意义（P>0.05）。与AngⅡ组比较,AngⅡ+Prdx-3转染组BNP mRNA [（1.72±0.29）比（1.29±0.15）]和ROS水平[（4439±111）比（3648±254）]明显下降,但Prdx-3蛋白水平[（0.72±0.14）比（1.89±0.37）]显著增高,差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论 AngⅡ可通过ROS诱导心肌细胞肥大,而Prdx-3通过降低ROS抑制AngⅡ的作用。     

五甲基槲皮素对Ang Ⅱ致心肌肥厚和细胞凋亡的作用

目的 研究五甲基槲皮素(PMQ)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)致大鼠心肌肥厚和细胞凋亡的作用及机制.方法 30只SD大鼠随机分为5组.试验持续21 d.①空白组:每晨生理盐水灌胃;②PMQ组:每晨PMQ 50 mg/kg灌胃;③AngⅡ组:于第15天开始皮下注射AngⅡ 288μg/(kg·d);④PMQ+Ang Ⅱ组:PMQ和AngⅡ处理同前;⑤溶剂+AngⅡ组:每晨溶剂灌胃,AngⅡ处理同前.于第22天处死大鼠.测量心脏指数、左心指数,心肌超氧化物歧化物(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量,实时荧光定量(real time)PCR检测脑钠素(BNP)mRNA的表达,TUNEL法测心肌凋亡,免疫组化测Bax、Bcl-2蛋白的表达.结果 PMQ能明显抑制Ang Ⅱ所致的心肌肥厚[左心指数,(2.02±0.16)vs(2.34±0.10)mg/g]及BNP mRNA表达上调;抑制心肌细胞凋亡[凋亡指数,(0.72±0.18)vs(1.28±0.27)%]及凋亡相关蛋白Bax表达[平均吸光度(0.037 3±0.007 3)vs(0.054 0±0.006 8)]和Bax/Bcl-2的提高[(0.17±0.03)vs(0.25±0.04)].并降低SOD活力、增加MDA含量.结论 PMQ能对抗AngⅡ引起的心肌肥厚及细胞凋亡.此效应可能与其抗氧化作用有关.     

柚皮素减轻AngⅡ诱导的原代大鼠心肌细胞肥大作用

目的:探讨柚皮素(Naringenin)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的原代大鼠心肌细胞(NRVMs)肥大作用及其作用机制。方法:AngⅡ刺激NRVMs构建体外心肌肥大模型,分为Vehicle组、Naringenin组、AngⅡ组和AngⅡ+Naringenin组。CCK8检测心肌细胞活性,α-actinin免疫荧光染色检测心肌细胞横截面积,RT-PCR检测ANP、BNP mRNA表达水平,Western Blot检测JNK、ERK及P38蛋白磷酸化水平,Hoechst染色检测心肌细胞凋亡。结果:与对照组相比,AngⅡ组心肌细胞横截面积明显增大,ANP、BNP mRNA表达水平明显增加,给予柚皮素干预后心肌细胞面积减小,ANP、BNP mRNA表达水平降低;此外,柚皮素能够减轻AngⅡ诱导的ERK和P38蛋白磷酸化水平上调及心肌细胞凋亡。结论:柚皮素可以减轻AngⅡ刺激引起的心肌细胞肥大,其机制可能与抑制MAPK信号通路以及减轻心肌细胞凋亡有关。     

细胞因子信号转导抑制剂3在大鼠静脉移植物中的表达及意义

目的：检测细胞因子信号转导抑制剂3(SOCS3)在大鼠颈外静脉颈总动脉移植物和体外培养的动脉血管平滑肌细胞增殖模型中的表达,探讨其在静脉移植物再狭窄病理过程中的可能作用及机制。方法体内实验分两组,将36只雄性SD大鼠随机分成实验组和对照组,每组18只。实验组采用标准显微外科技术行颈外静脉颈总动脉翻转端吻合,对照组行假手术,分别于术后第1、3、7天取出移植静脉。体外培养的大鼠血管平滑肌细胞用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激,再用大鼠SOCS3基因重组腺病毒(pYrAd-rSOCS3)、对照病毒pYrAd-GFP转染,体外实验分四组：对照组,bFGF组,bFGF+pYrAd-GFP组,bFGF+pYrAd-rSOCS3组。应用Real time-PCR和Western boltting检测白介素6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、信号转导与转录激活因子(STAT3)、磷酸化的信号转导与转录激活因子(P-STAT3)、SOCS3 mRNA和蛋白表达水平。结果体内实验表明,与对照组比较,实验组静脉移植物中IL-6[(3.60±0.51)比(1.00±0.00);(1.52±0.37)比(0.35±0.05)]、MCP-1[(2.08±0.38)比(1.00±0.00);(1.90±0.31)比(0.85±0.17)]、TNF-α[(4.86±0.74)比(1.00±0.00);(1.66±0.30)比(0.29±0.07)]、IL-1β[(2.73±0.52)比(1.00±0.00);(0.74±0.17)比(0.19±0.04)]、ICAM-1[(1.97±0.35)比(1.00±0.00);(1.02±0.39)比(0.21±0.02)]、SOCS3[(1.93±0.38)比(1.00±0.00);(0.82±0.18)比(0.42±0.12)]mRNA和蛋白表达水平以及STAT3[(1.50±0.36)比(0.21±0.05)]、P-STAT3[(1.54±0.39)比(0.37±0.10)]蛋白表达水平均在1周内明显升高(P<0.05或P<0.01)。体外实验结果表明,与对照组比较,bFGF组中上述指标mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.05或P<0.01);与bFGF组比较,bFGF+pYrAd-rSOCS3组中SOCS3 mRNA和蛋白[(5.47±1.03)比(1.37±0.24);(1.79±0.38)比(1.28±0.32)]表达进一步上调(P<0.01、P<0.05),而IL-6[(1.28±0.25)比(1.57±0.31);(1.68±0.39)比(2.36±0.48)]、MCP-1[(1.17±0.23)比(2.08±0.37);(1.25±0.21)比(1.66±0.43)]、TNF-α[(1.37±0.23)比(3.06±0.52);(1.20±0.24)比(1.54±0.31)]、IL-1β[(1.48±0.21)比(1.71±0.19);(1.00±0.24)比(1.49±0.35)]、ICAM-1[(1.34±0.21)比(2.10±0.27);(0.99±0.21)比(1.41±0.32)]mRNA和蛋白表达水平以及STAT3[(0.77±0.13)比(1.30±0.27)]、P-STAT3[(1.18±0.36)比(1.74±0.36)]蛋白表达明显下调(P<0.05或P<0.01)。结论 SOCS3在静脉移植物病变的早期病理炎性反应中,可能通过抑制其下游信号通路的关键转录因子STAT3的激活及其磷酸化而发挥负向调节作用,可为冠状动脉旁路移植术后静脉移植物再狭窄的理论研究和临床防治提供一种新思路和新靶点。     

转染血管紧张素Ⅱ受体反义核苷酸对心肌细胞生长的作用

目的：评价转染AT1反义核苷酸（AT1A）对心肌细胞血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）受体亚型mRNA表达,及蛋白质和核酸合成的作用。方法：RT-PCR克隆AT1 cDNA序列（476bp),将克隆的AT1 cDNA反向插入PcDNA3.1(5.4kb),构建一完整的含AT1A的质粒（PAT1A）,并转染入培养的心肌细胞,RT-PCR和免疫印迹鉴定其转染后AT1 mRNA和蛋白表达。比较AngⅡ10^-7 mol/L刺激24h后的转染及非转染的心肌细胞AT1及AT2 mRNA表达（RT-PCR）、蛋白质和核酸合成（^3H-Leu及^3H-TdR掺入量）。结果：成功构建PAT1A。转染心肌细胞AT1mRNA和蛋白表达量显著减少,与正常对照心肌细胞相比差异有非常显著性（P＜0.01)。AngⅡ10^-7mol/L刺激24h后,与非转梁心肌细胞相比,转染组AT1 mRNA表达明显减少,AT2 mRNA表达明显增加（P＜0.01),但两组间^3H-Leu及^3H-TdR掺入量差异均无显著性（P＞0.05)。结论：经AT1A封闭后,心肌细胞AT1mRNA表达显著抑制,同时AT2 mRNA上调。单纯封闭AT1mRNA并不能有效阻断AngⅡ介导的心肌细胞生长。     

C-sis对缺氧导致心肌细胞凋亡的抑制作用

目的 探讨C-sis对缺氧诱导心肌细胞凋亡的作用。方法 制备原代小鼠心肌细胞;将心肌细胞分为空白组、缺氧组、缺氧及空载质粒转染组和缺氧及pcDNA3.1/C-sis转染组;将空载质粒及pcDNA3.1/C-sis分别转染缺氧及空载质粒转染组和缺氧及pcDNA3.1/C-sis转染组心肌细胞;对缺氧组、缺氧及空载质粒转染组和缺氧及pcDNA3.1/C-sis转染组心肌细胞进行缺氧处理;倒置显微镜观察各组心肌细胞的搏动频率、异常搏动次数;全自动生化分析仪测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,采用MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白、C-sis蛋白表达水平。结果 与空白组相比,缺氧组心肌细胞搏动频率明显变慢[(99±5)次·min-1比(159±21)次·min-1,P<0.01],异常搏动次数明显增多[(16.9±1.4)次·min-1比(2.4±0.7)次·min-1,P<0.01],细胞培养液中LDH含量明显升高[(88.27±13.14)U·L-1比(23.54±5.81)U·L-1,P<0.01],细胞存活率降低[(57.54±4.84)%比(100.00±0.00)%,P<0.01],凋亡率升高[(39.26±4.05)%比(1.77±0.87)%,P<0.01],Caspase3和Bax蛋白表达明显升高[Caspase3:(2.27±0.94)比(0.22±0.11),P<0.01;Bax:(1.79±0.77)比(0.87±0.27),P<0.05],Bcl-2蛋白表达明显下降[(0.12±0.06)比(0.84±0.24),P<0.01]。而pcDNA3.1/C-sis质粒转染后C-sis表达明显升高,并抑制上述缺氧所致心肌细胞发生的一系列变化(P<0.01或P<0.05)。结论 C-sis能够抑制缺氧所致的心肌细胞凋亡。     

熊果酸抑制AngⅡ诱导大鼠心肌细胞肥大实验研究

目的 探讨熊果酸（ursolic acid,UA）对血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AngⅡ）诱导大鼠心肌细胞肥大的抑制作用及其可能机制。方法 按常规方法分离并培养新生大鼠心肌细胞。CCK-8法确定UA（2、4、8、16μmol/L）对心肌细胞的最佳作用浓度,利用AngⅡ诱导建立新生大鼠心肌细胞肥大模型。实验分对照组（control组）、AngⅡ组、UA干预组、LY294002（PI₃K/Akt通路抑制剂）干预组共4组。UA和LY294002均预处理心肌细胞30min。以心肌细胞表面积、β-肌球蛋白重链（β-MHC）mRNA和脑钠肽（BNP）mRNA表达作为心肌细胞肥大标志,同时使用蛋白免疫印迹法检测T-Akt（total Akt）和p-Akt（phospho-Akt）蛋白表达。结果 显微镜下观察各组心肌细胞生长良好。与control组相比,AngⅡ组和UA干预组大鼠心肌细胞表面积增加（P<0.05）,LY294002干预组心肌细胞表面积差异无统计学意义（P>0.05）;与AngⅡ组相比,UA干预组和LY294002干预组大鼠心肌细胞表面积减小（P<0.05）。与control组相比,AngⅡ组的p-Akt蛋白、BNP mRNA和β-MHC mRNA表达显著增加（P<0.05）;与AngⅡ组相比,UA干预组和LY294002干预组的p-Akt蛋白、BNP mRNA和β-MHC mRNA表达均降低（P<0.05）;UA干预组和LY294002干预组之间p-Akt蛋白、BNP mRNA和β-MHC mRNA表达均差异无统计学意义（P>0.05）;4个实验组间T-Akt蛋白水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论 （1）AngⅡ诱导的新生大鼠心肌细胞肥大模型中,心肌细胞表面积增加,BNP mRNA和β-MHC mRNA表达升高,同时伴有p-Akt蛋白表达增加,提示PI₃K/Akt通路在AngⅡ致心肌细胞肥大中起重要作用。（2）UA能减轻AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞肥大,使心肌细胞表面积减小,p-Akt蛋白、BNP mRNA和β-MHC mRNA表达减少,这与LY294002作用一致,提示UA可能是通过抑制PI₃K/Akt通路而发挥抗心肌肥大作用。     

miR-155下调心肌细胞ATR1α表达改善心肌细胞肥大

目的 研究微小RNA(miR)-155对心肌细胞肥大的影响,以及血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体1α亚型(angiotensinⅡreceptor subtype 1α,ATR1α)在其中的作用.方法 AngⅡ诱导体外培养大鼠心肌细胞H9C2 (2-1)肥大,将miR-155模拟物(mimics)和miR-155抑制物(inhibitors)转染入心肌细胞.测量心肌细胞表面积.实验分为对照组、AngⅡ组、模拟物组、miR-155抑制物组、AngⅡ加模拟物组、AngⅡ加抑制物组.实时荧光定量PCR检测心肌细胞miR-155的表达.逆转录PCR法检测心房钠尿肽(ANP)、p肌球蛋白重链(β-MHC)、ATR1α mRNA表达水平.Western blot法检测ATR1α蛋白表达水平.结果 与AngⅡ组比较,AngⅡ加模拟物组处理可降低心肌细胞ANP、β-MHC mRNA及ATR1a mRNA和蛋白表达水平(P＜0.05),心肌细胞表面积降低(P＜0.05);AngⅡ加抑制物组处理ATR1α mRNA和蛋白表达水平增加(P＜0.05),但ANP、β-MHC mRNA表达水平及心肌细胞表面积改变差异无统计学意义(P＞0.05),仅miR-155 mimics或miR-155 inhibitors处理各项指标均改变差异无统计学意义(P＞0.05).结论 miR-155过表达抑制心肌细胞肥大;ATR1α可能为其负性调控作用靶点.     

PI3K/AKT通路与TRPC6通道在Ang Ⅱ诱导足细胞损伤中的相互作用

目的 探讨磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路与瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(TRPC6)在血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的肾小球足细胞损伤过程中的作用及其可能机制.方法 体外培养小鼠肾小球足细胞,分别利用Ang Ⅱ、氯沙坦、PI3K/AKT通路抑制剂(LY294002)、TRPC6通道阻滞剂(SKF96365)进行处理,将细胞分为空白对照组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+氯沙坦组、氯沙坦组、Ang Ⅱ+LY294002组、LY294002组、Ang Ⅱ+SKF96365组、SKF96365组,采用qRT-PCR检测各分组细胞TRPC6 mRNA的变化.采用Western blot检测各分组细胞AKT、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、TRPC6蛋白质表达的变化.采用Hoechst 33258染色法检测各组足细胞凋亡情况.结果 与空白对照组相比,Ang Ⅱ组AKT磷酸化水平降低,TRPC6的表达升高,足细胞凋亡增加(P＜0.05).与Ang Ⅱ组相比:Ang Ⅱ+SKF96365组AKT磷酸化水平升高,TRPC6的表达下降,足细胞凋亡减少(P＜0.05);Ang Ⅱ+LY294002组AKT磷酸化水平减少,足细胞凋亡增加(P＜0.05);Ang Ⅱ+氯沙坦组AKT磷酸化水平升高,TRPC6的表达下降,足细胞凋亡减少(P＜0.05).结论 Ang Ⅱ可能通过激活TRPC6通道进而抑制PI3K/AKT通路的激活而导致足细胞损伤.     

MicroRNA-185对血管紧张素Ⅱ介导的心肌细胞肥大和凋亡的影响

目的探讨MicroRNA-185(miR-185)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)介导的心肌细胞肥大及凋亡的影响。方法将心肌细胞系H9c2细胞随机分为对照组、AngⅡ处理组、阴性对照组和miR-185过表达组。对照组细胞采用常规培养; AngⅡ处理组细胞常规培养,并给予AngⅡ处理;阴性对照组细胞使用含miR-185阴性对照(NC)的无血清培养基处理24 h后给予AngⅡ处理; miR-185过表达组细胞使用含miR-185模拟物(miR-185 mimic)的无血清培养基培处理24 h后给予AngⅡ处理。采用实时定量聚合酶链反应检测各组细胞中miR-185、心房钠尿肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)和细胞分裂周期蛋白42(CDC42) mRNA表达,应用细胞计数试剂盒-8检测各组细胞活性,细胞凋亡检测试剂盒测定各组细胞凋亡小体富计因子水平,Western blot法测定各组细胞中活化型多聚腺苷二磷酸核糖聚合梅(cleaved PARP)、活化型caspase 3和CDC42蛋白表达。结果与对照组比较,AngⅡ处理组和阴性对照组细胞中miR-185相对表达量、细胞活性显著降低(P <0. 05),ANP、BNP、β-MHC和CDC42 mRNA相对表达量、细胞凋亡小体富计因子及活化型PARP、活化型caspase 3和CDC42蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05)。阴性对照组与AngⅡ处理组细胞中miR-185和ANP、BNP、β-MHC、CDC42 mRNA相对表达量、细胞活性、凋亡小体富计因子及活化型PARP、活化型caspase 3、CDC42蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P> 0. 05)。与AngⅡ组和阴性对照组比较,miR-185过表达组细胞中miR-185相对表达量、细胞活性显著升高(P <0. 05),ANP、BNP、β-MHC和CDC42 mRNA相对表达量、细胞凋亡小体富计因子及活化型PARP、活化型caspase 3、CDC42蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05)。结论 miR-185可能通过下调心肌细胞中CDC42水平来减轻AngⅡ介导的心肌细胞损伤,抑制AngⅡ介导的心肌细胞肥大和凋亡,改善心肌细胞活性,从而发挥心肌保护作用。     

南方红豆杉水提物通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控HER2阳性胃癌移植瘤生长实验研究

目的探讨南方红豆杉水提物抑制PI3K/AKT信号通路相关靶点蛋白调控裸鼠HER2阳性胃癌移植瘤生长及其机制。方法建立荷瘤模型鼠,将80只BALB/c裸鼠接种人HER2阳性胃癌NCI-N87细胞株并采用随机数字表法分组给药及取瘤,采用Western blot法检测PI3K、pAKT、mTOR蛋白表达情况,实时荧光定量PCR法检测PI3K、AKT1、mTOR mRNA表达水平。结果Western blot法检测PI3K、pAKT、mTOR蛋白,红豆杉中、低剂量组下调PI3K蛋白表达更显著[(0.9123±0.0480)、(1.1440±0.1663)比(1.4160±0.0730),P均0.01],红豆杉各剂量联合赫赛汀后明显下调pAKT蛋白表达[(0.9401±0.0521)、(0.7899±0.0711)、(0.8313±0.0414)比(1.1988±0.2667),P0.05或P0.01],红豆杉高、低剂量下调mTOR蛋白表达[(1.0219±0.1769)、(1.0180±0.1290)比(1.3349±0.2045),P均0.01],联合赫赛汀后下调更明显[(0.7236±0.1709)、(0.8217±0.1262)、(0.8220±0.0809)比(1.3349±0.2045),P均0.01]。实时荧光定量PCR法检测结果显示,红豆杉低剂量组PI3K mRNA表达降低[(0.6906±0.0710)比(0.9018±0.0696),P0.05],红豆杉各剂量组联合赫赛汀后明显下调AKT1 mRNA表达[(0.6337±0.2248)、(0.5666±0.1758)、(0.7192±0.1219)比(1.0020±0.0773),P均0.01],红豆杉中、低剂量组mTOR mRNA表达显著降低[(0.8183±0.0664)、(0.7917±0.0699)比(1.0004±0.1182),P均0.05]。结论南方红豆杉水提物可部分下调PI3K、pAKT、mTOR蛋白及PI3K、AKT1、mTOR mRNA表达水平,联合赫赛汀可增强其抑制作用。     

KLF13上调对骨肉瘤细胞侵袭、迁移及p-AKT表达的影响

  目的  研究Kruppel样因子13(KLF13)对骨肉瘤细胞(MG-63)侵袭、迁移的影响及该过程中p-AKT蛋白表达变化。  方法  将MG-63细胞按照随机数字表法分为对照组、NC组和LV-KLF13-OE组;显微镜观察KLF13慢病毒颗粒转染情况;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测KLF13 mRNA表达情况;蛋白免疫印迹法检测KLF13、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(AKT)及磷酸化水平、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和膜棕榈糖基化蛋白2(MPP-2)的蛋白表达情况;细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞增殖情况;划痕实验检测迁移能力;小室法(Transwell)检测侵袭能力。  结果  MG-63细胞转染效率>75%;与对照组和NC组相比,LV-KLF13-OE组细胞KLF13 mRNA和蛋白、E-cadherin蛋白表达升高(F=1 544.143、588.000、235.391,均P＜0.001),MPP-2蛋白表达水平降低(F=260.053,P＜0.001);LV-KLF13-OE组细胞划痕愈合率[(20.07±8.18)%]、侵袭数量[(89.29±15.04)个]、p-AKT蛋白表达(0.21±0.02)水平低于对照组[(71.61±6.02)%、(221.33±20.09)个、1.12±0.12]和NC组[(74.93±7.21)%、(212.69±25.47)个、1.09±0.08,F=109.781、76.815、226.896, 均P＜0.001]。  结论  KLF13过表达可能通过下调p-AKT水平,抑制人骨肉瘤细胞迁移和侵袭。      

参附注射液对脓毒症大鼠心肌组织Bcl-2、Bax表达的影响

目的研究参附注射对脓毒症大鼠心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响,阐明参附注射液抗脓毒症心肌损伤的相关机制。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和参附组,每组8只。以盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)法建立脓毒症大鼠动物模型,观察各组大鼠心肌酶谱变化;凋亡原位末端标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡指数,RT-PCR法检测心肌细胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达。结果与假手术组比较,模型组、参附组心肌肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)均明显升高,差异有统计学意义[CK-MB:(4208.51±382.57)U/L、(3584.59±347.06)U/L比(2187.41±556.63)U/L,P0.05;CK:(3216.75±565.42)U/L、(1986.21±366.73)U/L比(1189.40±245.87)U/L,P0.05];与参附组比较,模型组心肌酶明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。三组均可见大鼠心肌细胞凋亡,与假手术组比较,模型组、参附组TUNEL平均光密度(MOD)升高,差异有统计学意义(0.24±0.11、0.18±0.09比0.09±0.05,P0.05);模型组升高最明显,与参附组比较差异有统计学意义(P0.05)。模型组、参附组大鼠心肌细胞Bcl-2 mRNA表达均较假手术组降低,差异有统计学意义[(3.83±0.07)×10~(-3)、(4.86±0.08)×10~(-3)比(5.75±0.09)×10~(-3),P0.05];参附组Bcl-2 mRNA表达高于模型组(P0.05)。模型组、参附组Bax mRNA表达均较假手术组升高[(7.12±0.08)×10~(-3)、(6.26±0.06)×10~(-3)比(4.61±0.05)×10~(-3),P0.05];参附组Bax mRNA表达低于模型组(P0.05)。结论参附注射液能减轻脓毒症大鼠的心肌损伤,其作用机制与上调Bcl-2 mRNA的表达,下调Bax mRNA表达,减少心肌细胞凋亡相关。     

Rho-Rock通路在血管紧张素Ⅱ诱导肝星状细胞收缩中的作用

目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)促进肝星状细胞(HSC)收缩时Rho激酶介导的非Ca2+依赖性信号转导通路的作用机制.方法 采用HSC-T6细胞系,给予AngⅡ 10 μmol/L处理,聚硅酮膜法直观检测HSC的收缩性;蛋白质印迹法检测肌球蛋白轻链(MLC)和磷酸化MLC表达水平.观察ArtsⅡ1型受体阻断剂伊贝沙坦、蛋白激酶C特异性抑制剂stauro、Rho激酶特异性抑制剂Y27632、肌球蛋白轻链激酶特异性抑制剂ML-7对磷酸化MLC表达水平的影响;逆转录聚合酶链反应检测Rho-Rock通路RhoA激酶2(Rock2)、RhoAGTP、Rho鸟核苷酸转化因子(RhoGEF)mRNA的表达.结果 AngⅡ可诱导HSC收缩;还可诱导磷酸化MLC蛋白水平的变化,并呈时间依赖性,15 min达到峰值后逐渐减低.AngⅡ+伊贝沙坦组和AngⅡ+Y27632组诱导的MLC蛋白磷酸化水平均低于AngⅡ组(1.12±0.09、1.22±0.10 vs 1.33±0.06,P=0.003);而AngⅡ+ML-7+stauro组磷酸化MLC蛋白水平(1.43±0.09)高于AngⅡ+Y27632组(P=0.003);AngⅡ+Y27632+ML-7+stauro组水平较低(0.64±0.04,P=0.000).Ang Ⅱ组Rock2、RhoAGTP、RhoGEF mRNA的表达均高于相应对照组(0.36±01vs0.12±0.01、0.80±0.01 vB 0.40±0.02、0.65±0.11 vs 0.33±0.09,均P＜0.05),AngⅡ+伊贝沙坦组3种元件的表达均低于Ang Ⅱ组.Ang Ⅱ+Y27632组Rock2与RhoGEFmRNA的表达(0.15±0.01、0.28±0.08)较Ang Ⅱ组低,RhoA GTP的表达(1.14±0.02)则较高.AngⅡ+ML-7+stauro组3种元件的表达均高于对照组,AngⅡ+Y27632+ML-7+stauro 3组3种元件的表达(0.23±0.01、0.83±0.02、0.69±0.08)均高于AngⅡ+ML-7+stauro组(均P＜0.05).结论 Ang Ⅱ可以通过Rho-Rock通路来诱导HSC的收缩.     

甘露糖结合凝集素对肠上皮细胞屏障功能的影响

目的 观察甘露糖结合凝集素(mannose binding lectin,MBL)对人结肠癌细胞株Caco-2屏障功能的影响并探讨其分子机制.方法 体内实验:取14只C57小鼠,按随机数字表法分为假手术组和LPS组(经腹腔注射LPS,构建肠炎症损伤模型),通过免疫组化和Real-time PCR观察MBL的变化情况,HE染色观察肠黏膜的损伤情况.体外实验:Caco-2细胞分为对照组、空转染组和MBL shRNA组(应用MBL干扰质粒转染Caco-2细胞),采用Real-time PCR、Western blot检测紧密连接蛋白的表达情况,并检测其跨上皮电阻(TER).结果 体内实验TER显示LPS组肠黏膜通透性(80.32 ±5.43)比假手术组(140.45 ±4.78)明显增加(P＜0.01),HE染色显示LPS处理后肠黏膜完整性比假手术组降低,免疫组化和Real-time PCR检测结果显示LPS处理组MBL表达升高(P＜0.05).在体外实验中,我们成功构建MBL shRNA质粒模型,MBL shRNA组细胞中MBL的蛋白和mRNA表达[(0.34±0.09),(0.42±0.12)]较对照组及空转染组明显降低(P＜0.05).MBL shRNA组的紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的蛋白[(0.43±0.10)、(0.53±0.11)]和mRNA水平[(0.43±0.08)、(0.45±0.10)]明显低于其余组(P＜ 0.05);MBL shRNA组TER值(80.33 ±7.64)降低较其余组明显(P＜0.05).结论 下调MBL基因可减少肠上皮细胞紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1 mRNA及蛋白水平的表达,减弱肠上皮细胞的屏障保护功能.     

P38丝裂原活化蛋白激酶短发夹RNA对H9C-2心肌细胞基因表达的影响

目的 探讨P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)的短发夹环RNA(shRNA)质粒对H9C-2心肌细胞增殖变化的影响并探讨其发生机制.方法 构建3种P38MAPK shRNA质粒并测序鉴定,将其转染入H9C-2心肌细胞中,应用RT-PCR和Western blotting检测心脏细胞P38MAPK mRNA和蛋白的表达.结果 P38MAPK shRNA质粒分布在心肌细胞的胞浆及细胞核中,与心肌细胞组比较,AngⅡ组和shRNA阴性组的P38MAPK mRNA和蛋白水平显著升高(P ＜0.01,P＜0.01);与AngⅡ组比较,shRNA1、shRNA2和shRNA3组的P38MAPK mRNA和蛋白水平明显降低(P ＜0.05,P＜0.05,P＜0.01).结论 P38MAPK shRNA质粒成功转染心肌细胞,P38MAPK shRNA3质粒能最有效地抑制心肌细胞P38MAPK的表达.     

山茱萸提取物对乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭和转移的抑制作用及机制研究

目的探讨山茱萸提取物对人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭和转移的抑制作用及机制。方法设MDA-MB-231细胞组、顺铂组(100.0μg/mL)、山茱萸提取物低剂量组(100.0μg/mL)、高剂量组(200.0μg/mL);以上各组每孔设6个平行样,培养72h。培养结束后,MTT法测定细胞活力,结晶紫染色测定单克隆形成数目,刮擦伤口愈合试验测定细胞迁移,Transwell室测定细胞侵袭,RT-PCR法及Western blot法测定胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)基因和蛋白水平。结果与MDA-MB-231细胞组比较,顺铂组、山茱萸提取物低、高剂量组人乳腺癌MDA-MB-231细胞吸光度(OD值)[(0.34±0.02)、(0.62±0.04)、(0.18±0.04)比(0.91±0.03)]、存活率[(25.54±0.15)%、(44.65±1.35)%、(16.41±2.36)%比(93.54±0.24)%]、单克隆形成数目[(186.63±12.65)个、(325.98±17.65)个、(108.63±12.63)个比(715.63±15.63)个]、迁移率[(45.63±9.65)%、(63.25±8.99)%、(23.96±11.32)%比(85.65±10.32)%]、穿膜数[(105.63±32.54)个、(298.63±28.65)个、(54.96±16.66)个比(542.63±29.65)个]、IGF-1R、Akt mRNA [(1.62±0.16)、(3.59±0.21)、(1.11±0.18)比(6.54±0.18),(1.48±0.19)、(3.69±0.21)、(0.89±0.25)比(5.69±0.14)]和蛋白[(1.89±0.19)、(3.62±0.15)、(1.24±0.23)比(6.99±0.18),(2.65±0.23)、(3.49±0.18)、(1.05±0.24)比(6.36±0.19)]表达降低(P<0.05)。与顺铂组比较,山茱萸提取物低剂量组人乳腺癌MDA-MB-231细胞OD值[(0.62±0.04)比(0.34±0.02)]、存活率[(44.65±1.35)%比(25.54±0.15)%]、单克隆形成数目[(325.98±17.65)个比(186.63±12.65)个]、迁移率[(63.25±8.99)%比(45.63±9.65)%]、穿膜数[(298.63±28.65)个比(105.63±32.54)个]、IGF-1R、Akt mRNA [(3.59±0.21)比(1.62±0.16)、(3.69±0.21)比(1.48±0.19)]和蛋白[(3.62±0.15)比(1.89±0.19)、(3.49±0.18)比(2.65±0.23)]表达升高(P<0.05),山茱萸提取物高剂量组OD值[(0.18±0.04)比(0.34±0.02)]、存活率[(16.41±2.36)%比(25.54±0.15)%]、单克隆形成数目[(108.63±12.63)个比(186.63±12.65)个]、迁移率[(23.96±11.32)%比(45.63±9.65)%]、穿膜数[(54.96±16.66)个比(105.63±32.54)个]、IGF-1R、Akt mRNA[(1.11±0.18)比(1.62±0.16)、(0.89±0.25)比(1.48±0.19)]和蛋白[(1.24±0.23)比(1.89±0.19)、(1.05±0.24)比(2.65±0.23)]表达降低(P<0.05)。与山茱萸提取物低剂量组比较,山茱萸提取物高剂量组OD值[(0.18±0.04)比(0.62±0.04)]、存活率[(16.41±2.36)%比(44.65±1.35)%]、单克隆形成数目[(108.63±12.63)个比(325.98±17.65)个]、迁移率[(23.96±11.32)%比(63.25±8.99)%]、穿膜数[(54.96±16.66)个比(298.63±28.65)个]、IGF-1R、Akt mRNA[(1.11±0.18)比(3.59±0.21)、(0.89±0.25)比(3.69±0.21)]和蛋白[(1.24±0.23)比(3.62±0.15)、(1.05±0.24)比(3.49±0.18)]表达降低(P<0.05)。结论山茱萸提取物对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、侵袭、转移具有明显抑制作用,200.0μg/mL的山茱萸提取物效果尤为明显;其机制可能与山茱萸提取物抑制IGF-1R、Akt mRNA和蛋白的表达进而抑制IGF-1R/Akt信号通路的激活有关。     

蜈蚣酸性蛋白对AngⅡ诱导心肌细胞凋亡的影响

目的 研究蜈蚣酸性蛋白(CAP)对血管紧张素-Ⅱ(AngⅡ)诱导培养心肌细胞凋亡的影响及机制.方法 在培养原代乳鼠心肌细胞的基础上,通过MTT法观察CAP对培养心肌细胞活力的影响;采用激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况;使用半胱胺酸-天门冬胺酸酶(caspase-3)活性检测试剂盒,分光光度法检测心肌细胞凋亡过程中caspase-3活性的变化;并采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定相关基因c-fos mRNA表达.结果 AngⅡ模型组与空白对照组比较,心肌细胞活力明显降低,凋亡明显增加;Caspase-3活性显著增加;c-fos mRNA的表达显著增加.CAP高、低剂量组与AngⅡ模型组比较,心肌细胞活力明显增加,凋亡明显降低;Caspase-3活性显著降低,c-fos mRNA的表达显著降低.结论 CAP对AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡具有明显的抑制作用,其机制与降低Caspase-3活性以及下调c-fos mRNA表达有关.     

炙甘草汤对糖尿病性心肌病模型大鼠心功能的影响

目的研究炙甘草汤对糖尿病性心肌病(DCM)模型大鼠心功能的改善作用及相关机制。方法将40只雄性SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、DCM模型组、炙甘草汤低、高剂量组,每组10只。通过高脂饮料饮食+链尿佐霉素(STZ)注射制备DCM模型,炙甘草汤低、高剂量组分别给予1mL/100g、2mL/100g炙甘草汤灌胃,正常对照组及DCM模型组给予等量双蒸水灌胃,至STZ注射后12周,检测血清BNP及超声心动图评估心功能,Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax评估心肌凋亡水平,自噬相关蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ,P62,Beclin-1评估心肌自噬水平。结果与DCM模型组比较,炙甘草汤低、高剂量组均显著降低大鼠血清BNP水平[(358.39±60.86)pg/mL、(313.92±61.71)pg/mL比(443.11±51.88)pg/mL,P0.05]、左心室收缩末期内径(LVESD)[(4.86±0.61)mm、(4.28±0.39)mm比(6.04±0.51)mm,P0.05)]及左心室舒张末期内径(LVEDD)[(7.52±0.56)mm、(6.87±0.63)mm比(8.04±0.57)mm,P 0.05)],升高左室射血分数(EF)[(52.30±5.66)%、(61.14±5.28)%比(46.48±3.81)%,P0.05)]及左室短轴缩短率(FS)[(29.42±4.78)%、(35.33±4.01)%比(24.62±3.88)%,P0.05)]。Western blot检测结果显示,炙甘草汤低、高剂量组大鼠心肌组织较DCM模型组抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调[(0.49±0.02)、(1.03±0.05)比(0.48±0.29),P0.05],促凋亡蛋白Bax表达下调[(0.67±0.04)、(0.52±0.03)比(0.93±0.02),P0.05],自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达上调[(0.58±0.06)、(0.61±0.05)比(0.29±0.02),P0.05],P62表达下调[(0.76±0.06)、(0.40±0.02)比(1.23±0.08),P0.05],Beclin-1表达上调[(0.83±0.03)、(0.88±0.03)比(0.80±0.03),P0.05]。与炙甘草汤低剂量组比较,高剂量组上述指标改善更明显(P0.05)。结论炙甘草汤能改善DCM模型大鼠心功能,可能与其抑制心肌细胞凋亡,增强心肌细胞自噬相关。     

阿托伐他汀对心肌肥大的抑制作用及FoxO1表达的影响

目的探讨阿托伐他汀(atorvastatin)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肥大心肌细胞的抑制作用及对转录因子FoxO1表达的影响。方法将H9C2细胞分为3组,对照组:未给予任何干预;心肌肥大组:给予AngⅡ(10-7 mol/L)刺激细胞;阿托伐他汀组:预先给予atorvastatin(10-5 mol/L),30min后AngⅡ(10-7 mol/L)刺激细胞。western-blotand real time PCR检测H9C2细胞FoxO1蛋白及mRNA含量,脑钠肽(brain natriuretic pepide,BNP)作为判断心肌肥大的指标。结果 AngⅡ诱导心肌细胞肥大后FoxO1表达较正常心肌细胞明显降低(P<0.05),而给予阿托伐他汀干预的肥大心肌细胞其FoxO1表达较肥大心肌明显升高(P<0.05)。结论阿托伐他汀可能通过上调FoxO1表达,从而抑制心肌肥大。