永生化神经前体细胞治疗大鼠局灶性脑缺血的实验研究

目的 探讨永生化神经前体细胞(INPC)移植对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响及移植细胞在模型大鼠脑内的存活以及分化情况.方法 雄性SD大鼠24只,均采用线栓法建立大脑中动脉缺血(MCAO)模型,随机分为2组(每组12只):脑缺血对照组、INPC移植组.缺血后3 d通过立体定位注射方法分别将等体积的磷酸盐缓冲液、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的INPC悬液注射到2组大鼠纹状体缺血半暗带区.缺血再灌注后对大鼠进行神经损害严重程度评分(NSS).细胞移植后1和4周分别随机处死2组大鼠各6只,取脑组织制作冰冻切片,通过免疫荧光双标技术检测BrdU、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)双阳性细胞和BrdU、神经元特异性烯醇化酶(NSE)双阳性细胞,观察INPC在移植区域的存活及分化情况.结果 脑缺血对照组与INPC移植组比较,细胞移植前后各时点的NSS评分差异均无统计学意义(均P＞0.05).INPC移植组细胞移植后1及4周,均可在移植针道附近及缺血灶周围检测到聚集较明显的BrdU免疫荧光染色阳性的植入细胞,并观察到BrdU染色阳性细胞扩散至全脑,免疫荧光双标技术检测见部分细胞为BrdU、GFAP双阳性的星形胶质细胞或BrdU、NSE双阳性神经元.结论 INPC可在局灶性脑缺血大鼠脑内存活并分化为神经元和星形胶质细胞.     

神经干细胞的分离培养和鉴定及体外长期培养

目的探索新生SD大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及体外长期培养的方法。方法分离新生SD大鼠海马组织,用无血清培养技术培养神经干细胞,免疫组织化学荧光技术检测其巢蛋白(Nestin)的表达;并用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入试验,免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况。诱导神经干细胞分化,分别用神经元特异性核抗原(NeuN)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、2,3-环核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)抗体进行免疫组织化学荧光染色鉴定分化细胞。结果获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并能分化为神经元和神经胶质细胞,且经传代培养10代以上仍具干细胞特性。结论成功培养出胚胎大鼠神经干细胞,培养出的细胞具有增殖、自我更新及多潜能分化能力,可分化为神经元及神经胶质细胞并可作为神经干细胞移植实验研究的供体细胞。     

成年小鼠视网膜穆勒细胞向神经干细胞转化的实验研究

【摘要】 目的 探讨Muller细胞在视网膜损伤后能够转化为神经干细胞，并经诱导后可以分化、新生视网膜中多 种类型的神经元，研究该培养细胞是否具有多能向分化能力。方法 取72只雌性成年SD小鼠建立视神经切断模型，采用酶解法对SD小鼠视网膜Muller细胞进行消化传代提纯。取第4代胰酶消化过的视网膜Muller细胞，用含有碱性成纤 维细胞生长因子(FGF-2)、表皮生长因子(EGF)的改良的Eagle培养基(DMEM)-F12培养基培养5d,用含有0. 5μmol/L RA、lμg/L BDNF与0.5%胎牛血清的DMEM培养基进行10d诱导分化，采用免疫荧光染色法对去分化及再分化后的 细胞进行鉴定。结果 免疫荧光染色鉴定3?4代培养的Muller细胞结果显示，特异性标记物谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸转运体(GLAST)抗体表达阳性，呈现红色，荧光染色GS和GLAST抗体表达阳性细胞比例分别为(92. 76± 4.28)%与(95. 28±2. 79)%。对去分化后的Muller细胞球给予免疫荧光染色鉴定，结果显示特异性标记物巢蛋白(Nes- tin)表达阳柱，呈现红色，荧光染色阳性细胞比例为(95. 37± 1.46) %。免疫荧光染色鉴定去分化后的Muller细胞球，结果显示神经胶质细胞特异性标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳柱，呈绿色，荧光染色阳性细胞比例为(10. 28± 3.37)%。细胞抗5溴-2脱氧尿昔(BrdU)的表达阳性，呈现红色，荧光染色阳性细胞比例为(90. 44±4. 23) %。免疫荧 光染色鉴定诱导分化后的Muller细胞球，结果显示神经节细胞的特异性标记物Thyl. 1表达阳性，呈现绿色，主要为轴突 和细胞质，荧光染色阳性细胞比例为(21. 25±4. 62)%。结论 视网膜Muller细胞是一种视网膜干细胞潜在来源细胞， 细胞因子刺激能够使体外培养的视网膜Muller细胞获得干细胞特征。     

人神经干细胞体外诱导分化及在体裸鼠胃肠道的移植

目的:探索人神经干细胞体外诱导分化,以及在体移植人裸鼠(免疫缺陷小鼠)幽门部后的存活及分化状况.方法:取10周左右流产人胚胎神经干细胞,体外悬浮培养、传代和诱导分化,用免疫荧光方法检测神经干细胞标志物神经上皮干细胞蛋白(nestin)、肠道神经细胞标志蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5,PGP9.5)和神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP);取体外悬浮培养3个月的人神经干细胞移植入裸鼠的幽门部,检测神经十细胞在幽门局部的存活和分化状况.结果:免疫荧光染色显示体外培养的人神经干细胞nestin阳性,诱导分化后PGP9.5和GFAP阳性.将人神经干细胞移植入裸鼠幽门部后连续检测到第6周,可见细胞存活,但免疫荧光染色未能榆测到神经细胞和神经胶质细胞的分化标志.结论:人神经干细胞可以成功地在体外培养、传代和诱导分化,移植入裸鼠幽门部后可在局部存活,对干细胞移植治疗胃肠道神经系统失调性疾病进行了初步探索.     

小鼠视网膜干细胞的分离与鉴定

目的小鼠视网膜干细胞的分离与鉴定。方法①对胎龄17d昆明小鼠眼睫状体部(CMZ)细胞进行分离与体外培养；②通过免疫荧光方法研究视网膜干细胞的增殖及分化特性。结果①在bFGF作用下，所培养细胞可形成悬浮生长的细胞团，经多次传代，细胞增殖能力未见衰减。BrdU标记结果显示悬浮细胞团主要是由分裂增殖的细胞组成。而且培养细胞可表达神经干细胞的特异性抗原Nestin及胚胎发育早期视网膜内原始细胞的特异性抗原Chx-10。②培养细胞经5％胎牛血清诱导可向成熟细胞分化，分别表达神经元与神经胶质细胞的特异性抗原NSE、GFAP。免疫荧光检测显示分化细胞可分别表达感光细胞、双极细胞以及节细胞的特异性抗原Opsin、PKC及β-tubulin。结论小鼠睫状体部存在视网膜干细胞。     

建立稳定表达猪LIF蛋白的小鼠STO细胞系

目的:在STO小鼠成纤维细胞中表达猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),并尝试使用其作为饲养层培养大鼠诱导多能性干细胞(iPS细胞)?方法:通过脂质体转染的技术,将已构建的猪LIF基因真核表达载体pCAG-pLIF转染至小鼠STO细胞中,获得能够稳定表达猪LIF的转基因STO细胞(STO-pLIF细胞)?通过RT-PCR?qPCR?Western blot等方法检测STO-pLIF细胞中猪LIF基因的表达量,选择高效表达猪LIF的STO-pLIF细胞作为饲养层,培养大鼠iPS细胞?通过生长曲线检测?碱性磷酸酶染色?干细胞多能因子的RT-PCR和免疫荧光染色等方法,检验STO-pLIF细胞饲养层在大鼠iPS细胞培养方面的功能?结果:STO-pLIF细胞中LIF RNA和蛋白表达水平均上调(P < 0.05),而该细胞系作为饲养层所培养的大鼠iPS细胞在形态?多能性因子表达方面更接近于传统培养的大鼠iPS细胞,与无外源添加LIF所培养的大鼠iPS存在差异(P < 0.05)?结论:成功获得了稳定表达猪LIF基因的STO-pLIF细胞,并证明该细胞作为饲养层在大鼠iPS细胞培养中具有一定优势?     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

目的 对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)进行分离培养与鉴定,并使其诱导分化为神经细胞.方法 采用密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法分离培养BMSCs,观察细胞形态变化及生长、增殖情况;对细胞进行表面标志物CD14、CD34、CD44、CD29免疫荧光染色及向骨、软骨和脂肪分化能力的鉴定;选用第3代细胞,经全反式维甲酸(retinoic acid,RA)和脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophy factor,BDNF)联合诱导后,免疫荧光染色检测神经前体细胞标记物Nestin及神经细胞标记物NSE的表达情况.结果 体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样,CD44和CD29的阳性率在90%以上,具有明显的向骨、软骨和脂肪分化的能力,经诱导后可分化为神经细胞.结论 成功建立了体外分离扩增BMSCs的培养体系,所获得的细胞纯度高、生物学特征稳定,并可在体外诱导分化为神经细胞,从而为下一步细胞移植治疗脑缺血动物模型提供种子细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及其向视网膜神经样细胞诱导分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)体外培养和扩增及其向视网膜神经细胞诱导分化的可能性。方法取SD大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外培养。培养视网膜神经细胞,收集视网膜细胞培养上清液,配制成条件分化液。将培养的rMSCs先经神经选择诱导后再换用条件分化液诱导,并对诱导的细胞进行免疫荧光鉴定。结果体外培养的rMSCs生长较好并扩增迅速,经2种分化液诱导后可先分化为神经先祖细胞,继而分化为视网膜神经样细胞。分别应用nestin、NeuN、GFAP、Thy1.1行免疫荧光检测,细胞呈阳性反应。结论rMSCs能于体外培养存活和扩增,并且在一定条件下可被诱导分化为视网膜神经样细胞,体外自制分化条件及模拟眼内环境行骨髓间充质干细胞的诱导,将为进一步的眼内移植提供理论依据。     

骨髓间充质干细胞移植至血管性痴呆大鼠模型的初步研究

目的：建立体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,体外诱导BMSCs向神经元样细胞方向分化、鉴定并移植至血管性痴呆大鼠模型的方法.方法：体外分离培养SD大鼠BMSCs,采用贴壁筛选法分离纯化BMSCs,显微镜下观察不同时期BMSCs的细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物表达鉴定BMSCs,用含10 μg/L bFGF的L-DMEM及含200μmoVLBHA、2％ DMSO的无血清L-DMEM诱导BMSCs向神经元样细胞分化;免疫细胞化学检测分化细胞的巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达,以确定其分化特性;用尿嘧啶脱氧核苷（BrdU）标记分化好的细胞,移植到改良Pulsinelli＇s四血管复制的血管性痴呆（VaD）模型大鼠侧脑室内,免疫组织化学检测BrdU表达以反映移植BMSCs在大鼠脑内的生长情况,Moms水迷宫检测大鼠学习记忆能力.结果：大鼠BMSCs可通过贴壁筛选法成功分离并在体外大量扩增,流式细胞仪检测显示BMSCs第5代表面标志可达90％以上,细胞表型CD90、CD29、CD44表达阳性,CD45表达阴性;bFGF/BHA诱导BMSCs分化后有Nestin和NSE表达,分化细胞具有神经细胞的形态;与对照组相比,模型组大鼠逃避潜伏期明显延长,第1次穿越平台时间延长,穿越平台次数减少,差异有统计学意义（P ＜0.05）;BrdU成功标记诱导后的BMSCs,并可在移植大鼠脑内检测到BrdU标记阳性细胞.结论：体外成功分离、培养大鼠BMSCs,生长稳定、可多次传代,bFGF/BHA可诱导BMSCs分化为神经元细胞,BMSCs成功移植到VaD大鼠,BMSCs有望为神经疾病细胞移植治疗提供丰富、易得的细胞来源.     

血管性痴呆大鼠海马神经干细胞移植

目的 探讨新生大鼠脊髓神经干细胞(NSC)移植至血管性痴呆(VD)大鼠海马后在体内的存活、迁移和分化。方法 用无血清培养和单克隆技术从新生大鼠脊髓分离具有单细胞克隆能力的细胞群并连续传代培养，鉴定为NSC后，将其用BrdU标记后移植入VD大鼠海马内，利用免疫荧光化学技术检测移植后细胞的生存、迁移和分化。结果 从脊髓分离的细胞群具有NSC的特性，这些细胞在移植入VD大鼠海马8周后能检测到其存在并向四周迁移，并且分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论 从脊髓分离的细胞是脊髓NSC，将其移植到VD大鼠海马内能生存、迁移和分化。     

4种全能性基因转入人胚胎成纤维细胞诱导多能性干细胞系的建立及其鉴定

目的：利用人类胚胎成纤维细胞（human embryonic fibroblast cells,hEFs）获得诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）系并对其全能性进行鉴定。方法：本研究采用慢病毒感染的方法将含有Oct4,Sox2,Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导hEFs,获得iPSCs,并对其进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）染色,以及检测表面标记,端粒酶活性,EB分化和畸胎瘤形成等,同时进行核型分析以及短串联重复序列（short tandem repeat,STR）分析。结果：所获得的iPSCs表达多能性细胞的表面标记,具有高的端粒酶活性,可在体内体外向内中外三胚层分化,与hESCs相似。经STR分析证实,iPSCs确实来源于hEFs而非胚胎干细胞的污染。结论：4种全能性基因转入hEFs可诱导获得与胚胎干细胞相似的iPSCs,有助于进一步的表观遗传学重编程以及干细胞多能性维持的研究。     

猪诱导多能干细胞可定向分化为前脑GABA能神经元前体

目的 探讨猪诱导多能干细胞（iPSCs）体外定向分化为GABA能神经元前体的方法体系。方法 猪iPSCs诱导分化为GABA能神经元前体遵循两个阶段,第1阶段,猪iPSCs悬浮培养,第3天时形成类胚体,采用神经诱导培养基NIM（SB431542、DMH1、FGF2）继续诱导,第12天分化为原始神经上皮细胞。第2阶段,使用含Pur、B27的NIM培养基悬浮培养形成神经球,至第21天时形成GABA能神经元前体。CM-DiI标记后,定向移植帕金森（PD）模型大鼠黑质纹状体,检测其在宿主脑内存活、迁移及分化状况。结果 猪iPSCs在饲养层细胞上稳定传代,表达多能性标记OCT4、Nanog、SSEA1和TRA-160,并且核型分析显示没有其他物种来源细胞污染。第12天经诱导分化获得原始神经上皮细胞能够形成玫瑰花环结构,并表达其表面标记物（PAX6、SOX2 和 Nestin）与神经微管蛋白标志物 Tuj1。第 21 天诱导细胞高表达 GABA 能神经元前体的表面特异性抗原NKX2.1和前脑标志物FOXG1。移植8周后,体内可分化为GABA能神经元与多巴胺能神经元,明显改善PD大鼠运动行为。结论 结合无血清培养基筛选法逐步定向诱导猪iPSCs高效分化为前脑GABA能神经元前体,移植后能够显著改善PD大鼠的运动功能障碍,为诱导GABA能神经元前体移植治疗神经损伤疾病奠定基础。     

癫痫大鼠海马区增殖的内源性神经前体细胞演变过程的研究

目的 追踪观察匹罗卡品诱导癫痫模型大鼠海马区增殖的内源性神经前体细胞的分化及演变过程，从而探讨痫性发作对增殖的内源性神经前体细胞的影响。方法 氯化锂和匹罗卡品联合诱导大鼠癫痫模型，正常对照组注射生理盐水，干预后14d腹腔注射5-溴脱氧尿苷嘧啶（BrdU）标记海马DG区增殖的内源性神经前体细胞；用免疫组化方法分别观察标记后5、14、28d海马DG区BrdU／神经元核性蛋白（NeuN）、BrdU／胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达；TUNEL标记方法观察BrdU／TUNEL的表达。结果 与正常对照组相比，癫痫模型组大鼠海马区出现的BrdU阳性细胞明显增多，增殖的细胞大多数分化为神经元（约70％），只有少数分化为星形胶质细胞。随标记时间延长，存活的增殖细胞逐渐减少，部分BrdU阳性细胞表现为TUNEL阳性。结论 癫痫发生后出现了神经前体细胞的增殖，增殖的细胞大多数分化为神经元。但只有少部分细胞存活下来参与海马结构的重组。     

诱导性多潜能干细胞滋养层制备条件的实验研究

目的制备小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblasts,MEFs）滋养层,用于诱导性多潜能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs）的体外培养。方法取13.5～15.5天胎龄的胎鼠,采用组织消化法分离原代培养成纤维细胞,对MEFs的生长形态、生长曲线进行观察。采用10μg/ml丝裂霉素C预处理P2～P3代MEFs 2～3h制备出细胞滋养层,在该滋养层上进行iPSCs培养,观察iPSCs的集落生成情况,并行碱性磷酸酶细胞染色。结果 MEFs经丝裂霉素C预处理后细胞既不增殖,也不会死亡,仍保持分泌多种生长因子的能力。iPSCs在MEFs滋养层上生长良好,类似于胚胎干细胞一样能形成＂鸟巢＂状集落,并可维持iPSCs正常形态,抑制其分化而不影响活力,碱性磷酸酶染色阳性。结论利用诱导性多潜能干细胞滋养层方法制备的细胞滋养层,能有效支持iPSCs的生长,为进一步开展iPSCs的研究提供了理论依据和实验基础。     

表皮生长因子对大鼠胚胎神经干细胞增殖分化的影响

目的：建立神经干细胞分离、培养的技术方法，探讨表皮生长因子(EGF)对大鼠胚胎神经干细胞增殖、分化的影响。方法：从大鼠胚胎大脑组织中分离、培养神经干细胞，并用EGF和血清诱导其分化，采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞增殖和分化的神经样细胞。结果：大鼠胚胎神经干细胞在无细胞因子和血清的培养基中无新生细胞形成，但能在EGF和血清的诱导下产生nestin和BrdU阳性细胞，细胞贴壁后分化为神经元和星形胶质样细胞。结论：EGF和血清能促进神经干细胞增殖，并诱导其向神经元样和星形胶质样细胞分化。     

海马放射状胶质细胞体外诱导激活后PEBP蛋白的表达变化

目的：探讨切割穹窿海马伞的侧海马提取液对放射状胶质细胞中磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）表达的影响。方法：将培养的海马放射状胶质细胞接种于培养板中,分成对照组和诱导组,对照组中加入含5%正常海马提取液的DMEM/F12细胞培养液,诱导组中加入含5%切割穹窿海马伞侧海马提取液的DMEM/F12培养液。培养7 d后,通过免疫荧光标记法观察PEBP在放射状胶质细胞中的表达,并提取总蛋白,采用Western blot的方法观察对照组及诱导组中PEBP蛋白的表达变化。结果：PEBP蛋白在放射状胶质细胞中能够表达,诱导组的表达比对照组明显增加（P〈0.05）。结论：PEBP的表达增加可能与切割侧海马提取液＂激活＂的放射状胶质细胞向神经元分化有关。     

胰岛素样生长因子-1对神经干细胞增殖分化的影响

目的 寻找影响神经元和胶质细胞分化的外在因素，探素胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对神经干细胞（NSCs）增殖和分化的影响。方法 从E14的SD大鼠大脑中分离神经干细胞，分别用IGF-1、EGF和bFGF处理，台盼蓝染色确定活细胞数量，BrdU标记并分析细胞增殖能力，免疫细胞化学法鉴定神经干细胞、新生细胞和分化细胞。结果 分离得到的细胞表现出NSCs特性，用IGF-1、EGF和bFGF处理后均显示增殖效应，并能分化为神经元和胶质细胞样细胞。结论 IGF-1能促进NSCs增殖，并诱导其向神经元样和胶质细胞样细胞分化。     

Experimental Study of Cell Migration and Functional Differentiation of Transplanted Neural Stem Cells Co-labeled with Superparamagnetic Iron Oxide and Brdu in an Ischemic Rat Model

Objective To explore the migration of transplanted neural stem cells co-labeled with superparamagnetic iron oxide （SPIO） and bromodeoxyuridine （Brdu） using the 4.7T MR system and to study the cell differentiation with immuno-histochemical method in ischemic rats. Methods Rat neural stem cells （NSCs） co-labelled with SPIO mediated by poly-L-lysine and bromodeoxyuridine （BrdU） were transplanted into the unaffected side of rat brain with middle cerebral artery occlusion （MCAO）. At weeks 1, 2, 3, 4, 5, and 6 after MCAO, migration of the labelled cells was monitored by MRI. At week 6 the rats were killed and their brain tissue was cut according to the migration site of transplanted ceils indicated by MRI and subjected to Prussian blue staining and immunohistochemical staining to observe the migration and differentiation of the transplanted NSCs. Results Three weeks after transplantation, the linear hypointensity area derived from the migration of labelled NSCs was observed by MRI in the corpus callosum adjacent to the injection site. Six weeks after the transplantation, the linear hypointensity area was moved toward the midline along the corpus callosum. MRI findings were confirmed by Prussian blue staining and immunohistochemical staining of the specimen at week 6 after the transplantation. Flourescence co-labelled immunohistochemical methods demonstrated that the transplanted NSCs could differentiate into astrocytes and neurons. Conclusion MRI can monitor the migration of SPIO-labelled NSCs after transplantation in a dynamical and non-invasive manner. NSCs transplanted into ischemic rats can differentiate into astrocytes and neurons during the process of migration.     

神经干细胞移植治疗损伤脊髓的实验研究

目的 探讨异体胚胎神经干细胞(neural stem cell，NSC：)移植修复治疗损伤脊髓的疗效。方法 由胚胎SD鼠大脑海马区脑组织培养出NSC，经传代、5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记后植入按Allen法制成的SD鼠的损伤脊髓内，术后观察鼠的行为改变、斜板试验及改良运动功能Tarlov评分评价功能恢复；体感诱发电位(SEP)和磁刺激运动诱发电位(MEP)监测脊髓感觉及运动电位传递；光镜及电镜观察植入区组织结构；以示踪剂麦胚凝集素。辣根过氧化物酶(WGA-HRP)显色观察轴突的生长及功能恢复；以免疫组化方法检测神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和饱和硫蛋白(S100)阳性细胞。结果 NSC在损伤脊髓中能成活并分化为神经元及神经胶质细胞，有轴突形成，分化倾向于神经元，能迁移1cm距离。WGA—HRF，能被运输到挫伤以外区域，运动电位能传递到损伤区远端，行为学观察受试组优于对照组。结果 异体胚胎NSC能在损伤区替代受损的神经元及神经胶质细胞，形成神经轴突联系，使损伤的脊髓功能得到一定程度的恢复。