GDF-5基因重组腺病毒修复人退变髓核细胞的实验研究

【摘要】 目的 探讨腺病毒介导的GDF 5基因对人退变髓核细胞外基质表达的影响,探求一种基因治疗新途径。方法 利用腺病毒载体将GDF 5基因导入退变髓核细胞,设置为空白对照组（Control组）、阴性对照组（GFP组）、实验组（GDF 5组）3组,并分为3、7、14、21天四个观察时间点,分别检测3组髓核细胞sGAG、Hyp的含量,免疫染色、Safranine O染色观察细胞外基质合成情况,Real time PCR检测Aggrecan、Collagen II mRNA表达水平。结果 GDF 5组髓核细胞sGAG/DNA、Hyp/DNA均在14、21天较Control组和GFP组明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）,而Control组与GFP组之间任意观察时间点比较差异均无统计学意义（P＞0.05）;免疫染色、Safranine O染色结果显示GDF 5组髓核细胞的蛋白多糖、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖在14、21天均呈强阳性染色,Control组和GFP组呈弱阳性染色。Real time PCR结果显示GDF 5组Aggrecan、Collagen II mRNA的表达在14、21天较Control组和GFP组明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 腺病毒介导的GDF 5能明显促进人退变髓核细胞Aggrecan、Collagen II mRNA的表达,并增加蛋白多糖、Ⅱ型胶原的合成,对细胞外基质具有明确的修复作用,是一种有效的基因治疗新方法。     

小鼠成纤维细胞诱导为诱导性多能干细胞的研究

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)由于具有无限增殖和多向分化的特性[1],因此在再生医学和药物发现与评价等领域极具应用价值[2].但是ESCs细胞在细胞来源、免疫排斥和法律等方面存在诸多限制.诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)技术的出现使人们从上述争论中解脱出来[3,4],由于iPSC在干细胞标志物表达、表观遗传学以及分化潜能方面与ESCs细胞极其相似,所以iPSC成为细胞治疗以及组织器官再生最有前景的种子细胞.笔者采用慢病毒介导的Oct4、Sox2、c - Myc和Klf4基因诱导小鼠尾部成纤维细胞(TIF)为iPSC,成功诱导并鉴定1株iPSC,为组织工程和再生医学提供了种子细胞.     

右美托咪定对骨巨细胞瘤细胞增殖、侵袭及迁移的影响

目的探究右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)对骨巨细胞瘤细胞增殖、侵袭及迁移的影响.方法将细胞分Control、DEX 0.01、0.1及1μmol/L组.BrdU检测细胞增殖,transwell检测细胞侵袭,划痕实验检测细胞迁移,免疫印迹检测Ki67、PCNA、Bcl-2、VEGF、MMP-2、MMP-9、NF-κB p65及其下游蛋白表达水平、p38 MAPK表达及其下游蛋白磷酸化比值.结果与Control组比较,DEX 0.1、1μmol/L组BrdU阳性细胞百分比、侵袭细胞数、划痕闭合率和Ki67、PCNA、Bcl-2、VEGF、MMP-2、MMP-9表达水平显著降低,抑制p38 MAPK、NF-κB信号通路的激活.结论DEX通过调控p38 MAPK及NF-κB表达抑制骨巨细胞瘤细胞增殖、侵袭及迁移.     

移植同种异体髓核细胞对兔椎间盘退变早期干预的实验研究

目的 在诱导椎间盘退变的早期移植同种异体兔髓核细胞（ NPC）,观察NPC对退变椎间盘的修复效果。方法 体外分离、培养NPC,并通过组织化学染色、免疫组织化学和免疫荧光染色对其进行鉴定。采用穿刺抽吸法建立兔椎间盘退行性变模型,造模同期进行细胞移植治疗。将27只5月龄日本大耳白兔随机分为3组：正常对照组（n=9）、NPC移植组（NPC组,n=9）及DMEM培养基组（DMEM组,n=9）。每只实验动物的L3-4、L4-5和L5-6作为实验干预椎间盘。术后4、8、12周分别利用标准化T2加权像信号强度（%ST2WI）、病理组织学、退变分数、免疫组化染色、免疫荧光染色以及二型胶原（Collagen Ⅱ）和蛋白聚糖（aggrecan）mRNA表达水平评价修复效果。结果 术后12周,DMEM组的%ST2WI值、CollagenⅡ和aggrecan 的mRNA表达量均明显低于其它两组（P＜0.05）,正常对照组和NPC组无明显差异（P＞0.05）;正常对照组和NPC组退变分数明显低于DMEM组（P＜0.05）,正常对照组和NPC组无明显差异（P＞0.05）;正常对照组、NPC组的Collagen Ⅱ免疫组化和aggrecan免疫荧光染色均显示强阳性,而DMEM组随着时间的推移阳性逐渐减弱。 结论 在退变早期移植同种异体的兔NPC能有效修复椎间盘组织的髓核退变。     

槲皮素对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响及分子机制

目的 探讨槲皮素对人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）增殖和成骨分化以及对特异AT序列结合蛋白2（SATB2）基因表达的影响。方法 噻唑蓝（MTT）法检测不同浓度槲皮素对hBMSCs增殖活性的影响，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒检测ALP活性，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测成骨分化生物标志物Runt相关转录因子2（Runx2）、骨钙素（BGLAP）和分泌磷酸蛋白1（SPP1）mRNA的表达，qRT-PCR和蛋白免疫印迹（Western blot）检测SATB2 mRNA和蛋白表达变化，在hBMSCs转染SATB2特异性siRNA或SATB2过表达载体质粒，分析敲低或过表达SATB2对槲皮素干预的hBMSCs增殖和成骨分化的影响。结果 在一定范围内槲皮素呈浓度依赖性促进hBMSCs增殖，5 μmol/L时促进细胞增殖效果最佳，选择5 μmol/L的槲皮素用于后续研究。5 μmol/L的槲皮素能够有效促进ALP活性以及Runx2、BGLAP和SPP1 mRNA的表达，并且能够上调SATB2 mRNA和蛋白表达。敲低SATB2能够阻碍槲皮素对hBMSCs增殖和成骨分化的促进作用，而过表达SATB2能够增强槲皮素对hBMSCs增殖和成骨分化的促进作用。结论 槲皮素可通过上调SATB2基因的表达促进hBMSCs增殖和成骨分化。     

组织工程软骨的研究新进展

创伤、炎症、退行性变等各种原因导致的软骨损伤是临床上的常见病。由于软骨的自我修复能力极为有限,因此损伤软骨的修复一直是临床上亟待解决的问题。目前,传统治疗方法仍存在各种缺陷,组织工程技术则为损伤软骨的修复治疗带来了新的希望,被视为能从根本上解决损伤软骨的修复的方法之一。随着技术的发展,近年来组织工程软骨的研究取得了长足的进步,并相继有一些产品进入临床研究阶段。本文就组织工程技术在软骨修复领域中的研究新进展作一综述。     

椎间盘退行性变的基因治疗进展

椎间盘退行性变疾病是临床的常见病和多发病,主要表现为椎间盘突出症、椎体不稳和椎管狭窄等。主要生物化学改变为基质降解、水分丢失、细胞衰老凋亡、加速退变的细胞因子出现等。体内外研究证实早期的基因治疗为延缓、阻止甚至逆转椎间盘退行性变提供了可能,其中选择有效的目的基因和合适的载体是其关键。基因治疗椎间盘退行性变克服了直接注射活性细胞因子短期生物学调节作用的缺点,然而在基因长期持续有效表达及其安全性方面尚存在许多问题有待解决。     

应用UTMD技术联合脂质体转染介导人肝癌细胞表达miRNA-122的研究

目的:探讨应用超声靶向微泡破坏(UTMD)技术和脂质体介导质粒miRNA-122在人肝癌HCCLM3细胞表达后细胞增殖、迁移和侵袭能力以及耐药性的变化。方法:构建pLMP-miR-122质粒。将对数期肝癌细胞株HCCLM3分组转染:A组(对照组)、B组(脂质体+质粒组)、C组(超声微泡+质粒+超声辐照组)、D组(脂质体+超声微泡+质粒+超声辐照组)。采用荧光定量PCR法检测pre-miRNA-122表达水平比较各组细胞转染效率,以CCK-8法检测细胞活性,应用划痕实验和Transwell实验检测细胞的体外迁移和侵袭能力,蛋白质免疫印迹检测蛋白表达情况。结果:HCCLM3细胞miRNA-122过表达后,细胞的增殖、迁移、侵袭能力与对照组比较均显著受到抑制,且对化疗药物敏感性增加,抗凋亡蛋白Bcl2表达下调。结论:UTMD技术结合脂质体转染法可以提高质粒转染人肝癌细胞HCCLM3效率,并且miRNA-122上调后可以明显抑制HCCLM3增殖、迁移和侵袭能力,有可能成为肝癌基因治疗的新靶点。