HIV—1SF2株env基因（gp42）的克隆构建及其原核表达

目的 克隆并在大肠杆菌中表达HIVgp41。方法 应用PCR技术，纯化HIV－1SF2株外膜蛋白基因（gp41），并重组入原核高效表达载体pBV220，在大肠杆菌HB101中进行表达。结果 SDS－PAGE电泳结果表明，在44000处有一条蛋白表达带。Westernblot证明，44000蛋白带可与HIV－1阳性血清发生特异性反应。结论 该重组表达gp41的融合蛋白，可为HIV－1gp41。     

重组HIV-1跨膜蛋白gp41在大肠杆菌中的表达

①目的 构建重组HIV－1 SF2株跨膜蛋白gp41基因片段的原核表达克隆并在大肠杆菌中表达。②方法 通过聚合酶链反应（PCR）扩增目的基因,然后用限制性内切酶将其与原核表达载体pMAL-p2定向连接,构建成重组质粒转入大肠杆菌DH5α菌中。经IPTG诱导,SDS－PAGE电泳分析有无重组蛋白表达。③结果 获得了重组的原核表达质粒及其表达产物。④结论 在pMAL-p2中构建的HIV－1 gp41重组质粒可在大肠杆菌中表达。     

HIV-1 gp160多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的免疫原性分析

目的:HIV感染引起的AIDS已经成为严重影响人类健康和社会发展的全球性疾病。酶联免疫吸附试验和免疫印迹检验组合则被认为是HIV检测的"金标准"。因此本实验构建gp160的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达,为HIV抗体测定提供特异、价廉的抗原。方法:选定HIV-1 gp160基因中三个片段包含较多抗原表位的区域,设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这三个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性,SDS-PAGE和Western Blot测定融合蛋白的抗原特异性。结果:构建的HIV-1 gp160多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长969bp。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白分子量为37kDa,以包涵体的形式存在。结论:应用western blot测定10例正常人和12例HIV/AIDS病人血浆显示HIV-1 gp160多表位融合蛋白具有良好的抗原特异性。成功构建了高表达HIV-1 gp160多表位蛋白的原核表达系统,纯化的融合蛋白有较强的抗原特异性。     

HIV-1 CRF07_BC gp41重组抗原在不同体系表达效率的比较

目的获得HIV-1 CRF07_BC株gp41重组抗原表达效率最佳的体系。方法采用基因工程技术将gp41重组蛋白基因分别构建到pThioHis A,pThioHis A-1(不含标签),PBV220,PGEX-6p-1原核表达载体。转化大肠杆菌BL21和Rosetta两种宿主菌,通过IPTG诱导表达并经WB鉴定。结果 4种原核表达质粒构建完成,蛋白成功表达。PGEX-6p-1表达量明显高于pThioHis A载体;而无标签载体组中,PBV220表达量优于pThioHis A-1。BL21和Rosetta宿主菌对表达体系无影响。结论 HIV-1 CRF07_BC株gp41重组抗原在大肠杆菌中以包涵体形式存在,构建在PGEX-6p-1和PBV220载体上gp41重组蛋白表达效率较高,为gp41疫苗的研究和血清学检测提供充足的抗原。     

p53蛋白和P-gp、TopoⅡ蛋白在食管鳞状细胞癌的表达及意义

目的　研究食管鳞状细胞癌 P- gp、Topo 蛋白与抑癌基因 p5 3的表达以及与食管癌生物学行为之间的关系。　方法　用免疫组织化学方法对 5 0例食管癌组织标本 P- gp、Topo 蛋白及 p5 3表达进行检测。　结果　食管癌组织中 p5 3阳性率为 6 4 % ,P- gp阳性率为 4 2 % ,p5 3阳性组的 P- gp表达率 (5 3.1% )显著高于阴性组(2 2 .2 % ,P<0 .0 5 ) ,p5 3表达与 P- gp有关。 p5 3与 Topo 蛋白表达之间关系无显著意义。 P- gp、Topo 表达与患者年龄、性别、肿瘤分化程度以及淋巴结转移无关。　结论　 p5 3表达可引起多药耐药 MDR- 1编码产物表达增高 ,从而使食管癌细胞获得多药耐药 MDR- 1表型 ;P- gp虽可作为化疗敏感性的预测 ,但不能作为判断预后的独立指标。     

HIV跨膜蛋白gp41和gp36原核表达及抗原性研究

目的 构建HIV跨膜蛋白gp41和gp36原核表达载体,诱导表达HIV抗原,为HIV快速诊断和蛋白疫苗研究提供材料基础.方法 用PCR方法对HIV-1包膜蛋白gp41和HIV-2包膜蛋白gp36基因序列进行全长、截短扩增,分别或以融合表达方式克隆入原核表达载体pQE30、pET32a(+)及pGST-MOLUC,重组质粒经异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达,并经Ni-NAT或谷胱甘肽-Sepharose-4B层析柱亲和纯化HIV跨膜糖蛋白抗原,对获得的纯化抗原进行Western blot检测,利用HIV抗原制备ELISA检测试剂盒,并分析HIV临床样本. 结果 成功构建了HIV包膜蛋白的原核表达载体,利用亲和层析纯化得到了纯度较高的HIV包膜蛋白;Western blot分析结果证实表达纯化的HIV跨膜蛋白gp41(aa.538～718)、gp36(aa.533～764)以及gp41-gp36均能和HIV阳性血清反应;ELISA试剂盒检测临床样本显示,特异性达95%以上,灵敏度达100%.结论 获得了有生物学活性的HIV截短包膜蛋白,并可用于HIV快速检测试剂盒的研发.     

p53蛋白和多药耐药基因相关蛋白在非小细胞肺癌的表达及意义

目的　探讨非小细胞肺癌 p5 3和 P-糖蛋白 (P- gp) ,谷胱甘肽 S-转移酶 π(GST) ,拓朴异构酶 (Topo )蛋白的表达及其临床意义。　方法　应用免疫组织化学方法检测 5 0例非小细胞肺癌 p5 3、P- gp、GST和 Topo 蛋白表达情况。　结果　肺癌组织中 ,p5 3阳性率为 70 % (35 / 5 0 ) ,P- gp阳性率为 6 2 % (31/ 5 0 ) ,p5 3阳性组的 P- gp表达率为 71.4 % (2 5 / 35 )高于 p5 3阴性组的 4 0 % (6 / 15 ) (P<0 .0 5 )。 P- gp阳性表达鳞癌和腺癌分别为 4 6 % (11/2 4 )和 77% (2 0 / 2 6 ) ,两者差异有显著性 (P<0 .0 5 )。　结论　 p5 3表达可引起多药耐药 MDR- 1编码产物表达增高 ,使肺癌细胞获得多药耐药 MDR- 1表型。 P- gp、GST、Topo 不能作为判断预后的独立指标     

人免疫缺陷病毒Ⅰ型外膜糖蛋白gp~(120)和gp~(160)在重组痘苗病毒中的表达及其抗原性研究

人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）是严重威胁人类健康的病原体，其主要抗原是病毒外膜糖蛋白gp160（gp120＋gp41）。本文报道运用遗传工程技术，在噬菌体T7启动子或痘苗病毒启动子P7．5控制下，在重组痘苗病毒系统中构建和表达HIV－1gp120和gp160。进一步研究表明，在此系统中表达的重组HIV－1gp120和gp160以糖蛋白形式存在，保留着病毒在自然状况下的抗原表位构象，可同病毒特异性中和单克隆抗体反应，可作为重要的候选重组疫苗蛋白。     

HIV-1 gag-gp120嵌合基因重组杆状病毒载体的构建

目的 :构建含有 HIV- 1(中国株 ) gag- gp12 0嵌合基因的重组杆状病毒表达载体。方法 :利用基因重组技术将 B亚型中国株 HIV- 1的结构基因 gag与 gp12 0嵌合后再通过大肠杆菌 /杆状病毒系统构建重组杆状病毒载体。结果 :酶切电泳显示基因重组正确 ,电镜显示重组杆状病毒大量扩增。结论 :含有B亚型 HIV- 1(中国株 ) gag- gp12 0嵌合基因的重组杆状病毒表达载体构建成功 ,为进一步研究Gag- gp12 0嵌合蛋白的表达及其生物学活性奠定了基础。     

乳腺癌组织多药耐药相关类蛋白与p53表达的研究

目的　了解多药耐药相关类蛋白P gp、GST π、TOPOIIα和突变型 p53蛋白在乳腺癌化疗耐药机制中的作用及相互间关系。方法　用免疫组化SP法对 91例未经抗肿瘤治疗的原发性乳腺癌和 18例术后经化疗复治的乳腺癌组织中检测P gp、GST π、TOPOⅡα、p53蛋白表达。 结果　P gp在原发性乳腺癌中阳性率为 4 0 % ,术后经化疗复治的乳腺癌中阳性率为 6 1%。两组P gp阳性率和表达强度有显著性差异 (P =0 0 2 5)。GST π在原发性乳腺癌中阳性率为 75% ,癌旁正常和增生乳腺小叶相应地有程度不等的阳性表达。术后经化疗复治的乳腺癌中阳性率为 83% ,与原发性癌相比有增高趋势 ,但差异无显著性意义。GST π和P gp在乳腺癌组织共同表达且呈正相关 (P =0 0 2 8)。TOPOⅡα在原发性乳腺癌中阳性率为 4 2 % ,其中浸润性导管癌组阳性率为 4 8% ,而分化好的癌及导管内癌伴早浸的表达水平明显低 (P =0 0 2 7)。癌组织级别越高 ,TOPOⅡα表达水平也越高 (P <0 0 0 1) ,TOPOⅡα表达与肿瘤大小、临床分期有关 (P值分别为 0 0 4 0和 0 0 2 2 )。术后经化疗复治的乳腺癌中阳性率为17% ,与原发性癌相比显著降低 (P =0 0 4 5)。P gp、GST π与TOPOⅡα表达均无相关性 (P >0 0 5)。突变型 p53蛋白在原发性乳腺癌中阳性率为     

人源化卵巢癌单链抗体基因的构建与表达

目的：通过基因工程技术获得完全人源化的卵巢癌患者自身的单链抗体并在毕氏酵母中获得表达，为人源化单链抗体(ScFv)在卵巢癌的诊断与治疗的应用提供实验基础。方法：用TRIZOL法自卵巢癌患者的淋巴细胞中提取RNA,利用SOEingPCR方法分别获得V_H、V_L基因，构建真核表达载体pPICZα/ScFv。电转化毕赤酵母菌株X-33。用PCR法筛选转染阳性克隆,SDS-PAGE法鉴定甲醇诱导的培养上清液中的ScFv的表达,筛选高表达工程菌。结果：构建ScFv基因,V_H与V_L连接后得到700 bp左右的条带，ScFv基因在毕赤酵母中获得表达，在26 000处出现目的条带。结论：获得ScFv基因及其真核表达载体以及高效表达ScFv的毕赤酵母工程菌。     

IFN-γ与HIV-1gp120融合蛋白的表达及其免疫调节作用

目的：研究gamma干扰素（IFN-γ）对人类免疫缺陷病毒（HIV-1）gp120蛋白免疫小鼠后效果的调节作用。方法：利用分子生物学技术，构建表达中国流行株HIV-1gp120N端片段基因的原核质粒pet44b-gp120，及共表达HIV-1gp120N端片段基因与IFN-γ基因的原核质粒pet44b-gp120／IFN-γ，在E．coli BL21（DE3）细胞中进行低温诱导蛋白表达，然后经纯化后免疫BALB／c小鼠。实验设皮下注射gp120／IFN-γ组、gp120组和PBS三组，以检测HIV-1gp120诱导的T细胞增殖能力，CTL杀伤作用以及Th1型细胞因子（IL-2，IFN-γ）和Th2型细胞因子（IL-4，IL-10）的表达情况。结果：通过PAGE和Western blot检测，证实上述两种蛋白在DE3细胞中得到表达。免疫学实验表明，针对HIV-1gp120的特异性T淋巴细胞增殖作用、特异性CTL杀伤作用，以及Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ表达在三组之间均有显著性差异（P〈0．05），gp120／IFN-γ组高于gp120组，gp120组高于PBS组（P〈0．05）。反映体液免疫反应的Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达在三组之间没有显著性差异（P〉0．05）。结论：协同应用IFN-γ基因可明显加强HIV-1gp120基因的细胞免疫反应。     

琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIV gp41抗原适配体

目的 通过消减SELEX技术筛选得到高特异性、强亲和力的HIV gp41抗原适配体,为HIV的早期诊断提供了新的检测技术.方法 以琼脂磁珠为载体,HIV gp41抗原为靶标分子,利用消减SELEX技术和实时定量-PCR技术,筛选得到HIV gp41抗原适配体.结果 通过6轮筛选,筛选得到的次级ssDNA库通过PCR扩增得到dsDNA,dsDNA与pMDTM 18载体链接,进行克隆、测序,获得4条HIV gp41抗原适配体.获得的4条适配体亲和力(Kd)均在纳摩尔水平,其中15号适配体的亲和力最强,特异性检测表明筛选得到的适配体几乎只与HIV gp41抗原结合,不与其他非特异性蛋白结合.结论 利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与HIV gp41抗原特异性结合的适配体,所获得的适配体具有拮抗HIV gp41抗原的能力.     

男性HIV感染者HIV-1抗体蛋白印迹带型分析

摘要：目的分析HIV-1型抗体阳性者蛋白印迹带型，了解男性艾滋病病毒感染者（HIV）带型分布特征。方法检测2000。2007年艾滋病感染者HIV-1抗体蛋白印迹带型特征并进行统计分析。结果男性艾滋病感染者HIV-1抗体蛋白印迹带型gp160、gp120、p24阳性率分别为97．0％-100％，gp41、p66、p51、p31为92．3％-94．5％，p55、p17分别为63．2％和77．1％。男性感染者在21-岁组和41—83岁组带型阳性率差异无统计学意义（P〉0．05）；男性感染者P31、P55、P17带阳性率注射吸毒组高于性途径感染组，差异有统计学意义（P〈0．05，P〈0．005，P〈0．005），其余带型阳性率差异均无统计学意义（P〉0．05）；性途径感染者男性和女性带型阳性率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论男性HIV感染者HIV-1抗体P31、P55、P17带阳性率，注射吸毒感染者高于性途径感染者，与别的学者报道有差别，有待对人群中病毒亚型分布的研究。     

作用于HIV gp120的进入抑制剂研究进展

HIV-1病毒为包膜病毒,其感染靶细胞的第一步是由HIV包膜蛋白表面亚基gp120与靶细胞上的CD4分子和辅助受体(趋化因子受体CCR5或CXCR4等)结合,导致gp41的构型发生改变,启动病毒包膜与靶细胞膜的融合.与gp120相结合的一些抗体、蛋白、多糖、多肽和小分子化合物,都可能影响HIV-1病毒包膜和靶细胞膜融合...     

链霉菌胞外多糖、灵芝多糖和米糠多糖对HIV gp41六股螺旋束核心结构形成的影响

目的 对链霉菌胞外多糖、灵芝多糖和米糠多糖体外抑制HIV gp41六股螺旋束核心结构的形成进行比较研究.方法 采用作用于HIV gp41的HIV融合抑制剂的高通量筛选方法(夹心ELISA法)检测3种多糖对HIV gp41六股螺旋束核心结构形成的抑制作用.结果 和结论链霉菌胞外能有效抑制HIV胞膜糖蛋白gp41六股α-螺旋束核心结构的形成,其半效抑制浓度(IC50)为(145.48±7.25)mg/L-1,而灵芝多糖和米糠多糖不具有这种抑制活性.     

恶性疟原虫自噬相关蛋白8基因原核重组表达及多克隆抗体制备

目的 通过pET-41 Ek/LIC载体在大肠杆菌工程菌中重组表达恶性疟原虫自噬相关蛋白8（PfAtg8）基因的重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,并用蛋白免疫法制备小鼠抗自噬相关蛋白8（PfAtg8）的多克隆抗体,并验证其效价。 方法 体外培养恶性疟原虫3D7株,并提取DNA,PCR扩增PfAtg8序列全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）PLysS工程菌中诱导表达重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,蛋白免疫法制备鼠抗PfAtg8的多克隆抗体并用Western blots和酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）进行效价验证。 结果 PCR扩增PfAtg8基因并插入pET-41 Ek/LIC载体,转化入大肠杆菌。诱导表达并纯化重组蛋白,进而利用该蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,经验证该抗体可对重组蛋白进行特异性识别,且效价可达1∶100 000。结论 成功表达、纯化了GST-PfAtg8-6×His重组蛋白,并免疫小鼠获得多克隆抗体血清。     

我国首例与HIV感染者长期无保护性接触未引发感染的报告

目的：通过某女HIV感染的确认及其丈夫HIV感染的排除,报告我国首例与HIV感染长期无保护性接触而未引发HIV感染的案例。方法：初筛实验用酶联免疫吸附（ELISA）实验及明胶颗粒凝集（PA）实验检测HIV－1抗体及HIV－2抗体,确认实验用蛋白免疫印迹（WB）实验检测HIV－1抗体及HIV－2抗体。结果：某女,ELISA实验结果HIV－1抗体阳性,HIV－2抗体阴性,复检结果相同,PA实验结果HIV－1阳性,WB实验出现HIV－1特异性条带gp160,gp120,p66,p55,gp41,p31,p24,p17,无HIV－2特异性条带出现,结果为HIV－1抗体阳性,HIV－2抗体阴性,某男,ELISA实验结果：HIV－1抗体与HIV－2抗体均为阴性,PA实验结果为阴性,3mo及6mo后复查,ELISA,PA实验结果仍为阴性,结论：某女为HIV感染,某男可排除HIV感染的可能性,某男与感染长期无保护性接触未感染HIV,也未因与感染长期共同生活而感染HIV。