局灶性脑缺血后室管膜/室下区细胞迁移到梗塞区周围并分化为神经元和星形胶质细胞

目的研究局灶性脑缺血后室管膜/室下区细胞的迁移分化,揭示梗塞区周围新生细胞的来源.方法大脑中动脉阻塞前,将10μl 0.2%的荧光染料DiI注射于体质量250～350 g的雄性SD大鼠侧脑室以预标记室管膜/室下区细胞.脑缺血后,采用累积式的BrdU标记方法标记新生细胞并通过双重免疫荧光染色确定细胞分化.标记的细胞通过激光共聚焦显微镜观察.结果在非缺血对照大鼠,DiI标记细胞定居于室管膜/室下区.局灶性脑缺血后,DiI标记细胞出现于胼胝体,邻近的纹状体和皮质.此外,缺血14 d后,梗塞区周围纹状体和皮质内可见一些DiI/BrdU/GFAP或DiI/BrdU/NeuN三重标记阳性细胞.结论局灶性脑缺血后,室管膜/室下区细胞迁移到梗塞区周围并分化成神经元和星形胶质细胞,这一发现对于理解成体神经干细胞的起源和开发促进脑损伤后内源性神经发生的新措施具有重要意义.     

局灶性脑缺血后室管膜 /室下区细胞迁移到梗塞区周围并分化为神经元和星形胶质细胞

目的 研究局灶性脑缺血后室管膜/室下区细胞的迁移分化,揭示梗塞区周围新生细胞的来源。方法 大脑中动脉阻塞前,将10μl0.2%的荧光染料DiI注射于体质量250~350g的雄性SD大鼠侧脑室以预标记室管膜/室下区细胞。脑缺血后,采用累积式的BrdU标记方法标记新生细胞并通过双重免疫荧光染色确定细胞分化。标记的细胞通过激光共聚焦显微镜观察。结果 在非缺血对照大鼠,DiI标记细胞定居于室管膜/室下区。局灶性脑缺血后,DiI标记细胞出现于胼胝体,邻近的纹状体和皮质。此外,缺血14d后,梗塞区周围纹状体和皮质内可见一些DiI/BrdU/GFAP或DiI/BrdU/NeuN三重标记阳性细胞。结论 局灶性脑缺血后,室管膜/室下区细胞迁移到梗塞区周围并分化成神经元和星形胶质细胞,这一发现对于理解成体神经干细胞的起源和开发促进脑损伤后内源性神经发生的新措施具有重要意义。     

成年大鼠脑出血后室管膜下区、血肿周围神经前体细胞增殖研究

目的 研究成年大鼠脑出血后室管膜下区、血肿周围组织神经前体细胞增殖的规律.方法 立体定向注射胶原酶建立大鼠纹状体脑出血模型.脉冲法或连续法腹腔注射Brdu标记增殖细胞.在脑出血后第2、7、14及28天处死大鼠,行Brdu免疫组化染色.对室管膜下区、血肿周围的Brdu免疫阳性细胞作细胞记数.结果 脉冲法Brdu标记.大鼠脑出血后第2天双侧室管膜下区和血肿周围Brdu阳性细胞数增加,第7天时达高峰,第14天仍可见较多的增殖细胞;连续法Brdu标记.在脑出血后第14天时室管膜下区和血肿周围可见较多Brdu阳性细胞,第28天时室管膜下区Brdu阳性细胞数降至对照水平.但血肿周围仍可见较多的Brdu阳性细胞.结论 成年大鼠脑出血后可诱导双侧室管膜下区和血肿周围神经前体细胞增殖增加;室管膜下区增殖细胞可能向血肿周围迁移.     

经股后肌群注射DiI逆行示踪标记神经元胞体的实验研究

目的 探讨经股后肌群注射DiI行逆行示踪以精确显示支配神经元胞体在脊髓的时空分布情况.方法 新生昆明小鼠65只,经左后肢股后肌群注射DiI,在注射2、4、6、8、12、24 h和2、4、7、14、28 d及2、3个月后观测背根神经节和腰段脊髓示踪荧光的分布和强度.结果 ①示踪细胞分布在左侧L2～S2脊髓段和相应的背根神经节,主要集中在L4～L6段;②注射DiI 6 h后,在背根神经节和脊髓前角可见发微弱红色荧光的神经元;③标记的神经元数量逐渐增多,4 d达到高峰;④6～24 h每个标记神经元荧光逐渐增强,24 h后达到高峰;⑤3个月后荧光强度无显著降低.结论 经股后肌群注射DiI作逆行示踪,可快速、准确、持久地标记背根神经节感觉神经元和脊髓运动神经元,且适当延长示踪时间可提高神经元的标记率.     

CD133、Nestin在成年SD大鼠室管膜下区的表达

目的探讨CD133、Nestin在成年SD大鼠室管膜下区的表达。方法应用免疫组织化学法检测成年SD大鼠室管膜下区CD133和Nestin的表达。结果成年SD大鼠室管膜下区存在大量CD133、Nestin阳性细胞,其主要分布于侧脑室外侧壁,尤其以上外侧壁为甚。侧脑室内侧壁CD133阳性区域厚度为(15.22±1.12)μm,外侧壁厚度为(45.02±1.31)μm,最厚处以侧脑室上外侧壁为甚,为(88.33±5.09)μm。其中侧脑室内侧壁Nestin阳性区域厚度为(17.4±1.31)μm,外侧壁厚度为(48.10±1.37)μm,外侧壁厚度为(101.76±3.75)μm。经统计学分析,室管膜下区各部位CD133阳性区域厚度值显著小于Nestin阳性细胞区域。结论成年SD大鼠室管膜下区存在CD133、Nestin表达阳性的神经干细胞,CD133、Nestin在室管膜下区分布不均,主要聚集于侧脑室外侧壁,尤其上外侧壁。     

三种示踪技术标记人脂肪组织来源干细胞的对照研究

摘要：目的比较3种不同的荧光示踪技术标记人脂肪组织来源干细胞(ASCs）的效率,以寻找脂肪组织来源干细胞最佳的
标记示踪方法。方法吸脂术获取人脂肪组织,胶原酶消化法后体外贴壁法培养,获得的长梭形细胞经鉴定为脂肪组织
来源干细胞。分别使用5 μl DiI,10 μg/ml的脱氧尿苷BrdU 及50 MOI的携带绿色荧光蛋白（GFP）的重组腺病毒进行标
记,荧光显微镜观察不同时间点及不同代数的脂肪干细胞的标记效率及形态变化。结果成功分离获得ASCs,经鉴定其
表达间充质干细胞表面标志,并能被成功实现成脂、成骨及成软骨的诱导分化。DiI 标记ASCs 48 h 后,荧光显微镜下观察
可见100%细胞浆呈现红色荧光,胞核未染,保持了良好的正常形态。但细胞传代后荧光衰减迅速。10 μg/ml BrdU标记
ASCs 48 h后,90%的胞核呈绿色荧光,传代后胞核荧光逐渐衰减。携带GFP重组腺病毒转染ASCs 24 h后胞浆内即可见
绿色荧光,5 d后90%以上的细胞呈现绿色荧光。反复传代后未见明显的荧光衰减。结论DiI,BrdU 及携带GFP的重组
腺病毒均能有效的标记人脂肪组织来源干细胞。DiI 示踪技术为细胞膜标记,BrdU为细胞核标记,两项技术均操作简单,
但传代后衰减迅速,适合于短期标记示踪。携带GFP的腺病毒标记方法较为复杂,但反复传代后仍不衰减,适合于长期的
标记示踪观察。
     

大鼠下丘脑室旁核及其邻近区域至室管膜的传出联系

用20只Wistar大鼠以PHA—L免疫组织化学顺行追踪技术研究了下丘脑室旁核及其邻近区域对脑室系统室管膜的传出联系。在脑室系统某些部位的室管膜层或其下方见有丰富的标记纤维并见许多膨结和终末膨突。这些纤维似乎参与形成室管膜上、下丛,构成脑—脑脊液神经体液回路的重要环节。     

大鼠各脑室室管膜和脉络丛超微结构观察

为了探讨各脑室壁室管膜细胞和脉络丛组织的超微结构特点，取成年大鼠侧脑室、Ⅲ，Ⅳ脑室和中脑水管上皮细胞及侧脑室脉络丛组织制成超薄切片，ＪＥＭ－１００ＣＸⅡ透射电镜下观察。结果表明（１）脑室不同部位室管膜上皮细胞的排列层次稍有区别。以其电子密度高低不同，可分为底部有长的胸突伸入神经细胞之间。（２）脉络丛：表面覆盖着单层立方柱状上皮，游离面有丰富的锤状微绒络丛中轴的孔毛细血管，血管周围间明显，本研究为探     

成年大鼠侧脑室注射与脑实质注射腺病毒表达载体转染脑细胞的比较研究

目的比较观察脑室注射和脑实质注射腺病毒表达载体转染脑细胞的范围及表达产物的程度。方法分别将Ad5CMV LacZ表达载体（20μl,病毒滴度为1．01×10^5pfu／ml）注入成年SD大鼠右侧脑室、尾壳核、内侧隔核-斜角带复合体和背侧海马,在注射后3～28d将大鼠脑制作成为切片,进行X-gal组织化学反应,观察被转染和表达的细胞形态和数目。结果在侧脑室内注射后3d,右侧侧脑室室管膜细胞及其下层开始有病毒载体转染和表达,继之向对侧侧脑室、第三脑室和第四脑室转染和表达产物,脊髓中央管壁偶尔有被转染和表达的细胞;而将等体积和等滴度的AdSCMV LacZ载体注入尾壳核、内侧隔核-斜角带复合体和背侧海马,则均出现直径约2～5mm的转染范围,表达产物的细胞离注射原位最远处约为5—6mm,细胞表达产物很局限并相对集中;而侧脑室注射病毒载体可以随脑脊液流动而使转染范围广,但被转染细胞主要集中在室管膜及其下层,离脑室壁最远处也只在0．5—2mm范围内。结论侧脑室注射病毒表达载体便于基因治疗弥漫性脑疾病;而脑实质注射病毒表达载体则利于基因治疗局部性脑疾病。     

NMDA和AMPA型谷氨酸受体亚基在成年大鼠前脑室管膜及室管膜下区的分布

目的:观察前脑室管膜及室管膜下区N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)和使君子酸(AMPA)型谷氨酸受体的分布. 方法:应用成年SD大鼠前脑切片免疫组织化学方法,显示NMDA和AMPA受体六种亚基的细胞定位. 结果:在室管膜及室管膜下区有NMDA受体亚基NR1,NR2C及AMPA受体亚基GluR1,GluR2/3,GluR4免疫反应阳性产物的分布,免疫阳性产物则均匀地分布在细胞质或细胞膜. 半定量分析表明NR1和GluR4阳性细胞的数目和染色密度均高于NR2C,GluR1和GluR2/3阳性细胞. 结论:结合以往研究,NMDA和AMPA受体亚基在大鼠前脑室管膜及室管膜下区定位结果提示NMDA和AMPA受体可能参与该区域神经发生等功能活动的调节.     

川芎嗪对大鼠局灶性脑缺血后侧脑室室下区细胞增殖的作用

目的 观察川芎嗪对大鼠局灶性脑缺血后侧脑室室下区（SVZ）细胞增殖的作用。方法 SD雄性大鼠随机分为假手术组、缺血模型组和川芎嗪组。线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞模型，川芎嗪组术后2h腹腔注射川芎嗪（80mg／kg，1次／d），各组术后4h腹腔注射5-溴脱氧尿核苷（BrdU，50mg／kg，1次／d）。术后7、14、21d取材，采用免疫组织化学染色观察SVZ BrdU阳性细胞数和Doublecortin（DCX）的表达。结果 缺血模型组术后7d时SVZBrdU阳性细胞较假手术组明显增加（P〈0．01），并持续至14d，21d减少；川芎嗪组14dSVZ BrdU阳性细胞达峰值，21d有所减少，与缺血模型组比较，7、14dBrdU阳性细胞均明显增加（P〈0．01）。缺血模型组7d时SVZ有DCX阳性表达，14d达最多，21d表达减少，与假手术组相应时间点比较均明显增加（P〈0．01）；川芎嗪组随缺血时间延长SVZDCX表达明显增强，21d仍处于高水平，与缺血模型组比较，14、21dDCX表达明显增强（P〈0．01）。结论 川芎嗪对成年大鼠局灶性脑缺血诱导的SVZ神经干细胞／祖细胞增殖可能有促进作用。     

脑室下层细胞形态及分布的研究

目的 观察侧脑室脑室下层细胞的形态及分布。方法 制作成年大鼠侧脑室脑室下层的超薄切片和全脑连续石蜡切片。结果 脑室下层细胞主要分布在侧脑室外侧壁，从侧脑室出现平面延续到尾壳核消失平面。其中的神经元前体细胞的质游离核糖体较多，核大，核内的染色质疏松。结论脑室下层以细胞和尾壳核及伏隔核相邻，其中的细胞多数具有未成熟形态特点。     

胚鼠黑质细胞悬液移植于帕金森病模型鼠侧脑室的实验研究

将胚鼠中脑腹侧组织制成细胞悬液移植于帕金森病(PD)模型鼠侧脑室,动态观察受体鼠在移植前后的行为变化。移植后16周应用诱发荧光及免疫细胞化学等方法,对移植物在受体鼠脑内的存活及生长情况进行了研究。结果,受体鼠旋转行为明显改善,侧脑室内可见黄绿色荧光细胞及酪氨酸羟化酶(TH)免疫反应阳性细胞,有的发出突起伸向室管膜及迁于尾核区.提示:移植的胚鼠黑质细胞生长良好,似作为触液神经元发挥其作用。     

和厚朴酚对人宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨和厚朴酚抑制人宫颈癌Hela细胞增殖及诱导其凋亡的作用。方法利用MTT检测和厚朴酚在不同浓度和时间下对Hela细胞增殖的影响;用流式细胞术、Hoechst 33258荧光染色和DNA ladder检测和厚朴酚作用下Hela细胞的凋亡。结果MTT结果显示和厚朴酚可明显抑制Hela细胞的增殖,且抑制率存在剂量和时间依赖性;流式结果表明10μg/mL和20μg/mL和厚朴酚作用细胞24h后,凋亡细胞的比例分别为22.5%和62.2%,而对照组为8.7%;和厚朴酚处理过的Hela细胞,经Hoechst33258染色后细胞、细胞核出现明显的凋亡形态学变化,在DNA琼脂糖凝胶上可见特征性的梯状条带。结论和厚朴酚具有抑制Hela细胞增殖和诱导凋亡的作用。     

EphB2-Fc融合蛋白促进实验性大脑皮层梗死后内源性神经干细胞的活化

目的探讨脑室内注入EphB2-Fc融合蛋白对大脑皮层梗死后内源性神经干细胞活化的影响。方法采用易卒中型肾血管性高血压大鼠,建立大脑中动脉闭塞模型（MCAO）,并将其随机分成：（1）假手术组,（2）脑梗死组,（3）梗死＋IgG—Fc组,（4）梗死＋EphB2-Fc组,每组24只。MCAO术后第4天,EphB2-Fc组大鼠经侧脑室注入20μl浓度为200μg／ml的EphB2-Fc融合蛋白,IgG—Fc组大鼠注入等量等浓度的IgG—Fc。MCAO术后第1和第4周,将各组大鼠处死取脑,用免疫组化和原位杂交检测各组大鼠不同时点梗死侧EphB2及其mRNA、巢蛋白（nestin）和多聚唾液酸-神经细胞黏附分子（PSA—NCAM）表达,Western蛋白印迹检测各组大鼠不同时点梗死侧EphB2和nestin蛋白量的变化。结果MCAO术后1周,脑梗死组梗死侧大脑皮层和侧脑室下区EphB2及其mRNA的表达低于假手术组,梗死＋EphB2-Fc组高于梗死＋IgG—Fc组（均P〈0．05）,脑梗死组与梗死＋IgG—Fc组间差异无统计学意义（P〉0．05）;脑梗死组梗死侧侧脑室下区nestin、PSA—NCAM的表达高于假手术组,梗死＋EphB2一Fc组高于梗死＋IgG—Fc组（均P〈0．05）,并可见PSA—NCAM阳性细胞沿胼胝体向梗死灶迁移。MCAO术后4周,各组间梗死侧EphB2及其mRNA表达水平差异无统计学意义（均P〉0．05）,各组脑梗死大鼠梗死侧nestin、PSA—NCAM表达水平下降,各组间nestin表达水平差异无统计学意义,但脑梗死组PSA—NCAM表达水平仍高于假手术组。结论阻断内源性EphB2的活化可促进实验性大脑皮层梗死后脑室下区神经干细胞的增殖和迁移。     

白藜芦醇诱导佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡

目的：探讨白藜芦醇对佐剂性关节炎( AA)大鼠滑膜细胞增殖和凋亡的影响。方法0．1 ml弗氏完全佐剂注射SD大鼠左后足跖皮内复制AA模型,28 d后,采用组织块培养法分离、培养大鼠踝关节滑膜细胞, CCK-8法检测白藜芦醇对滑膜细胞增殖的影响;Hoechst 33258荧光染色、琼脂糖凝胶电泳观察滑膜细胞凋亡情况。结果 CCK-8法表明白藜芦醇可以抑制滑膜细胞增殖,并且呈剂量依赖性趋势;高浓度白藜芦醇(20、50μmol/L )能诱导滑膜细胞凋亡, Ho-echst 33258染色观察到细胞核出现凋亡小体,电泳呈现出阶梯状条带。结论白藜芦醇可能会通过抑制AA大鼠滑膜细胞的增生,促进滑膜细胞的凋亡而达到治疗类风湿性关节炎的作用。     

提高BrdU标记成年大鼠在体脑神经干细胞增殖和分化效率的研究

目的探讨合理利用BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）单标成年在体脑神经干细胞增殖以及双标成年在体脑神经干细胞分化的策略。方法在BrdU通过腹腔注射6h后或在BrdU腹腔注射后14～21d将大鼠灌注固定,继之用邻片进行H—E染色以作定位,分别对脑组织切片进行BrdU单标或BrdU＋NT（神经丝,成熟神经元的标志物）、BrdU＋GFAP（胶质原纤维酸性蛋白,成熟星形胶质细胞的标记物）以及BrdU＋GC（半乳糖脑苷脂,成熟少突胶质细胞的标记物）的双标免疫组织化学反应,光镜下观察和计数单标或双标的阳性细胞。结果BrdU单标阳性细胞多见于侧脑室的SVZ（室管膜下区）和SGZ（齿状回颗粒下区）,而BrdU＋NT阳性细胞多位于嗅球和齿状回的颗粒细胞层,BrdU＋GFAP阳性细胞多见于SVZ或SGZ;BrdU＋GC阳性细胞数最少,散在分布于以上四个部位内。结论在进行BrdU标记脑神经干细胞前应该制定优化组合方案,以获得最佳的单标和双标的识别效果。