恒河猴外周血单核巨噬细胞体外培养方法的建立

目的 建立一种简单、经济、高效的培养恒河猴外周血单核巨噬细胞(monocyte-derived macrophage,MDM)的方法。方法 用肝素钠抗凝管采集成年恒河猴(Macaca mulatta)全血,密度梯度离心法分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。同时用无抗凝剂采血管采集同一只猴外周血,自凝后分离血清。将猴PBMCs置于CellBIND Surface的96孔(0.8×10⁶个细胞/孔)或48孔培养板(3×10⁶个细胞/孔)中,用含不同百分比的猴自体血清或胎牛血清(fetal calf serum,FCS)的RPMI 1640培养液培养24 h后洗弃未贴壁细胞,加入含有猴自体血清或FCS的新鲜培养基继续培养7 d后观察细胞形态学。分化良好的猴单核巨噬细胞贴壁能力强,占据板底大部分区域。胞体形态多样,多数呈长梭形。用巨噬细胞标记受体(CD14)抗体染色判断细胞纯度。并用细菌内毒素(LPS)刺激分化的巨噬细胞,检测巨噬细胞炎性因子的表达。此外,用猴艾滋病毒(SIVmac17E-Br、SIVmac251)和人-猴嵌合体艾滋病毒(SHIV KU-1)感染分化良好的猴巨噬细胞,检测病毒在猴巨噬细胞中的复制。结果 在含2%猴自体血清的RPMI 1640培养条件下,大多数(>85%)猴单核细胞能在24 h内贴壁,体外分化5～7 d后,猴巨噬细胞纯度大于96%。相比而言,含较高浓度(4%,8%或10%)猴自体血清或FCS的RPMI 1640 培养基对猴单核细胞的贴壁和分化作用较差。分化良好的猴巨噬细胞对LPS刺激敏感,可产生多种巨噬细胞炎性因子。此外,这些细胞对SIV或SHIV均易感,产生感染性病毒。结论 含2%猴自体血清的RPMI 1640培养基适于原代猴单核细胞的贴壁和分化。该方法简单、花费少,无需生长因子,且分化效果好,是培养猴艾滋病毒及开展相关免疫学实验的重要手段。     

SIVmac251感染增强恒河猴巨噬细胞对galectin-3诱导凋亡的敏感性

目的研究SIVmac251感染对galectin-3诱导恒河猴巨噬细胞凋亡的影响。方法从健康猴和SIVmac251感染猴外周血分离单核细胞,用GM—CSF与IL-6诱导单核细胞分化成巨噬细胞。巨噬细胞与galectin．3共孵育5．5h后,细胞经PE—annexinV／PerCP-7AAD染色,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果无galectin-3诱导条件下健康猴与SIVmac251感染猴巨噬细胞中annexinV阳性细胞的百分率分别为5．08％与4．87％。Galectin．3诱导条件下健康猴巨噬细胞中annexinV阳性细胞的百分率升至17．62％,SIVmac251感染猴巨噬细胞中annexinV阳性细胞的百分率升至45．56％,两者差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论SIVmac251感染增强恒河猴巨噬细胞对galectin-3诱导凋亡的敏感性。     

共聚焦显微镜监测小鼠腹腔巨噬细胞膜电位

1 材料和方法 处死小鼠,腹腔内注射 5 mL 冷 Hanks 液,轻揉腹部,抽吸细胞悬液约 4 mL。细胞洗两次后,加含 10％ 小牛血清的 RPMI 1640 培养基 10 mL,接种于 96 孔板中, 每孔 01 mL,37℃ 静置 60 min,使巨噬细胞贴壁。用无血清培养液冲洗培养孔三次,去除未贴壁细胞,剩下贴壁的巨噬细胞。加入 01 mL 5 μmol/L 的 DBAC4(3)（美国分子探针公司产品,用无水乙醇溶解,用无血清培养液稀释）,室温温育 10 min。将 96 孔板置于共聚焦显微镜（美国 Meridian 公司 Ultima 型）的载物台上,调整到最佳扫描参数后开始动态扫描。在扫…     

树突状细胞体外培养体系的优化

目的：探讨无血清专用培养基从人外周血单个核细胞（DC）分离培养树突状细胞的优化方法。方法：取正常成人新鲜血液，经密度梯度离心法，利用连续贴壁的方法获得单个核细胞，采用无血清培养基经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白介素-4（rhIL-4）和肿瘤坏死因子-α（TNF—α）诱导产生成熟DC，倒置显微镜观察树突状细胞结构，流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平。结果：连续贴壁法无血清专用培养基体外分离培养人外周血DC，所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离含10％胎牛血清RPMI培养基培养的DC。培养1周的DC高表达CD83、HLA-DR、CD80、CD86、CD83^＋HLA—DR^＋及CD80^＋CD86^＋。结论：采用无血清专用培养基连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源的DC。     

树突状细胞体外培养体系的优化

目的:探讨无血清专用培养基从人外周血单个核细胞(DC)分离培养树突状细胞的优化方法。方法:取正常成人新鲜血液,经密度梯度离心法,利用连续贴壁的方法获得单个核细胞,采用无血清培养基经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4(rhIL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导产生成熟DC,倒置显微镜观察树突状细胞结构,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平。结果:连续贴壁法无血清专用培养基体外分离培养人外周血DC,所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离含10%胎牛血清RPMI培养基培养的DC。培养1周的DC高表达CD83、HLA-DR、CD80、CD86、CD83 HLA-DR 及CD80 CD86 。结论:采用无血清专用培养基连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源的DC。     

自体树突状细胞用于慢性粒细胞白血病骨髓净化的初步研究

目的 考察慢性粒细胞白血病（CML）树突状细胞（DC）刺激自体骨髓T细胞,清除白血病细胞的作用。方法 采用3例CML病人（2例慢性期和1例急变期）外周血,分离单个核细胞（PBMNC）,经塑料贴壁后在含自体血浆、重组人白介素4（rhIL－4)、重组人粒－单集落刺激因子（rhGM－CSF）和重组人肿瘤坏死因子（rhTNFα）的RPMI－1640培养液。37℃CO2孵箱培养10天,或用免疫磁珠从PBMNC分离DC,在含自体血浆、rhGMCSF和rhTNFα的RPMI1640培养液培养3天,收获的细胞即DC加到含rhIL－2的Dexter骨髓长期培养体系,置37℃,5％CO2孵箱培养7天,观察前后骨髓细胞的免疫表型和P210阳性细胞比例。结果 从CML病人外周血获得的DC大多数表达P210。在含rhIL－2的Dexter体系加入DC能进一步增加体系中的T细胞数。在2例慢性期病人体系中的P210。在含rhIL－2的Dexter体系加入DC能进一步增加体系中的T细胞数。在2例慢性期病人体系中的P210阳性细胞减少,但在急性期病例,体系中P210细胞明显增加。结论 CML病人的DC表达P210,能刺激自体骨髓中T细胞增生,在慢性期病人,这些自体DC活化的骨髓T细胞有清除白血病细胞的作用。     

SHIV1157ipd3N4细胞适应株的制备及其生物特性

目的 体外制备SHIV1157ipd3N4病毒中国恒河猴细胞适应株,在细胞水平和中国恒河猴体内评价其生物学特性.方法 用SHIV1157ipd3N4病毒阴道感染中国恒河猴,在血浆病毒载量高峰期采血分离外周血单核淋巴细胞(PBMCs),与正常中国恒河猴PBMCs共培养.定期测定培养液中的P24抗原水平.当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存.测定病毒RNA载量、P24抗原浓度和TCID50.静脉感染中国恒河猴,研究该批次SHIV1157ipd3N4在体内的病毒学、免疫学指标变化及变异情况,分析其基本的生物学特性.结果 本研究共制备了243 mL SHIV1157ipd3N4病毒原液,gp120序列分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变.病毒载量为1.586×108 copies/mL,P24抗原水平为1.16×103 pg/mL,TZM-bl细胞测定病毒的TCID50为3.16×103/mL.1 mL SHIV1157ipd3N4静脉成功感染中国恒河猴G1004V,高峰期病毒载量达到1.0×106 copies/mL以上.结论 此次制备的SHIV1157ipd3N4细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIV1157ipd3N4/中国恒河猴模型.     

多发性骨髓瘤患者外周血树突状细胞分离、培养及鉴定

目的 研究多发性骨髓瘤（MM）患者外周血树突状细胞（DC）的分离、培养和鉴定。方法 用塑料贴壁的外周血单个核细胞（PBMNC）来源或者免疫磁珠阴性选择分离途径，建立体外培养技术，从MM患者外周血中获取DC。结果 （1）在含粒-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4的无血清培养基（AIM-V）中，37℃、体积分数为0．05的CO2培养箱中培养5～7d，可获得具有典型DC形态学特征的细胞。2种分离途径得率比较无统计学意义（n=5，P〉0．05）。（2）同种混合淋巴细胞反应及自体抗原呈递试验证实，MM患者外周血来源DC具有很强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力及呈递自体抗原的能力。外周血来源DC培养5～7d后流式细胞仪分析表明，部分细胞表达成熟DC特征性标记CD1a。部分表达共刺激分子CD80及CD86，高表达HLA-DR分子，几乎不表达单核细胞特异性标记CD14。重组人白细胞介素-3或／及重组人干细胞因子加入培养体系并不增加MM患者外周血DC得率。免疫表型也无明显改变。提示DC来源于PBMNC中单核细胞，而非CD34^＋造血祖细胞。结论 贴壁分离法及免疫磁珠法均可获取充足数量的DC。     

外周血单个核细胞与HepG2.215细胞共培养体系的研究

目的 建立外周血单个核细胞与HepG2.215细胞共培养体系,探讨不同培养基及效靶比对共培养体系的影响.方法 分离正常人外周血单个核细胞,加人植物血凝素(PHA),置于不同的培养基(DMEM,RPMI1640)中进行培养,采用不同效靶比((5:1、10:1、20:1、40:1)构建PBMCs与HepG2.215细胞共培...     

SHIV病毒在猴体内的复制与传代

目的为建立SHIV艾滋病动物模型提供毒力较强的病毒株,将新合成的SHIV XJ02170病毒适应猴体,并增强其毒力。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查和PCR检测。选出13只无SIV,STLV1,SRV D和B病毒感染的猴。第一批实验,将SHIV前病毒DNA质粒经肌肉注射到猴体内,每只500μg;SHIV病毒液,经静脉注射到猴体内,每只2ml。病毒质粒和病毒液各接种2只猴。当第一批猴体检出病毒后,10ml感染猴的全血,抗凝后静脉注射到第二批猴体内,当第二批猴检出病毒后再将10ml感染猴的全血静脉注射到第三批猴体内,连续传代4次。每批实验均定期采集血液标本,分别用肝素和EDTA抗凝,进行病毒分离;病毒基因PCR检测;CD4,CD8测定;病毒抗体检测。结果SHIV XJ02170病毒和SHIV XJ02170前病毒DNA质粒在猴体内的传代中均能分离出病毒;从传代猴的血浆和外周血单核细胞(PBMC)中检出了病毒DNA和RNA基因;CD4,CD8测定结果显示有暂时性倒置现象,后变为正常倒置与正常交替出现;在传代的猴血清中检测出特异性HIV病毒抗体。结论SHIV XJ02170病毒与SHIV XJ02170前病毒DNA质粒,均能在恒河猴体内复制。     

Construction and characterization of a new simian/human immunodeficiency viruses clone carrying an env gene derived from a CRF07_BC strain

Background The CRF07_BC recombinant strain has been one of the most predominantly circulated HIV-1 strains in China, it is therefore necessary and urgent to develop a relevant animal model to evaluate candidate vaccines targeting HIV-1 CRF07 BC. A highly replication-competent simian/human immunodeficiency viruses （SHIV） construct containing the Chinese CRF07_BC HIV-1 env gene with the ability to infect Chinese rhesus monkeys would serve as an important tool in the development of HIV vaccines. The aim of this study was to examine whether SHIV XJDC6431 with the env fragment from a Chinese HIV-1 isolate virus could infect the human and monkey peripheral blood mononuclear cell （PBMC）, establish infection in Chinese rhesus macaque. Methods A SHIV strain was constructed by replacing the rev/env genes of SHIV KB9 with the corresponding fragment derived from the HIV-1 CRF07_BC strain. The infectious activity of the SHIV clones was determined in vitro in PBMCs from both non-human primate animals and humans. Finally, one Chinese rhesus macaques （Macaca mulatta） was infected with one SHIV via intravenous infusion. Results One SHIV clone designated as SHIV XJDC6431, was generated that could infect macaque and human PBMC. The virus produced from this clone also efficiently infected the CCR5-expressing GHOST cell lines, indicating that it uses CCR5 as its coreceptor. Finally, the virus was intravenously inoculated into one Chinese rhesus macaque. Eventually, the animal became infected as shown by the occurrence of viremia within 3 of infection. The viral load reached 105 copies of viral RNA per ml of plasma during the acute phase of infection and lasted for 10 weeks post infection. Conclusions We conclude that SHIV XJDC6431 is an R5-tropic chimeric virus, which can establish infection not only in vitro but also in vivo in the Chinese rhesus macaque. Although the animal inoculated with SHIV XJDC6431 became infected without developing a pathologic phenotype, the virus efficiently replicated with a persistent level of viral load in the plasma. This suggested that the SHIV could be used as a tool to test candidate AIDS vaccines targeting the Chinese HIV-1 CRF 07BC recombinant strain.     

中国猕猴CD4~+ CD25~+调节性T细胞抑制抗结核分枝杆菌特异性T淋巴细胞免疫反应

目的:体外观察中国猕猴CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)对T淋巴细胞产生的抗PPD抗原特异性扩增的影响。方法:分离6只3月内人工感染过结核分枝杆菌卡介苗的雄性中国猕猴外周血单个核细胞(PB-MCs),免疫磁珠法分选纯化出Tregs,并用PKH26红标记。将去除Tregs的剩余PBMCs标记上CFSE,然后单独或与纯化的Tregs混合,分别给予结核杆菌纯化蛋白衍生物(PPD)或CD3/CD28单克隆抗体刺激,体外培养7d,用流式细胞术分析含或不含Tregs的PBMCs中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和Vγ2Vδ2T淋巴细胞对PPD抗原和CD3/CD28抗体刺激的反应。结果:PPD不仅能引起CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞扩增,而且引起Vγ2Vδ2T淋巴细胞也发生扩增。Tregs不仅能抑制CD3/CD28抗体诱导的CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和Vγ2Vδ2T淋巴细胞的抗原非特异性扩增,而且还可抑制PPD抗原刺激引起的CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和Vγ2Vδ2T淋巴细胞的抗原特异性扩增。结论:中国猕猴Tregs对T淋巴细胞产生的抗结核杆菌特异性免疫反应有负调节作用。     

RT-SHIV中国恒河猴适应株细胞水平生物学特性分析

目的 体外增值、制备动物感染来源的RT-SHIV病毒中国恒河猴适应株,比较PBMCs和CEMx174两种细胞制备出病毒的差异,同时用TZM-bl、CEMx174、PBMC三种细胞滴定测定病毒TCID50.方法 用RT-SHIV病毒静脉感染中国恒河猴,定期采血测定血浆病毒载量,当病毒载量达高峰时采血分离外周血单核淋巴细胞(PBMCs),与正常恒河猴PBMCs或CEMx174细胞共培养,定期测定培养液中的P24抗原水平,当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存;测定病毒RNA载量、P24抗原浓度,滴定病毒的TCID50.结果 本研究共制备了78 mL PBMCs来源的RT-SHIV病毒和85 mL CEMx174细胞来源的RT-SHIV病毒.RT基因序列和原始序列的相似度为99%,仅在第254和265位的氨基酸发现突变.RT-SHIV(PBMC)和RT-SHIV(CEMx174)病毒载量分别为1.641×108 copies/mL和8.375×108 copies/mL,P24抗原水平分别为20.745 ng/mL和4.28 ng/mL,TZM-bl、CEMx174、PBMC细胞测定病毒的TCID50分别为3.16×105 TCID50/mL和1×104 TCID50/mL,5×102 TCID50/mL和5×105 TCID50/mL,5×102 TCID50/mL和5×103 TCID50/mL.结论 PBMCs细胞来源制备的病毒较CEMx174制备的病毒具有更高的感染性.     

抗人B淋巴细胞单克隆抗体清除中国恒河猴体内B淋巴细胞效果观察

目的用抗人B淋巴细胞单克隆抗体(利妥昔单抗注射液,Rituximab)通过静脉滴注的方法敲除中国恒河猴体内B淋巴细胞,并观察其敲除效果,为建立B淋巴细胞缺失的恒河猴动物模型提供基础的实验数据。方法选取健康的中国恒河猴两只,静脉滴注抗人B淋巴细胞单克隆抗体,定期采集外周血、腹股沟淋巴结和十二指肠黏膜组织,制备淋巴细胞悬液,应用流式细胞术的方法系统性测定B淋巴细胞及T淋巴细胞亚群的变化。结果静脉滴注利妥昔单抗注射液后24 h,中国恒河猴外周血中B淋巴细胞的缺失即能达到100%,持续约14 d;腹股沟淋巴结中B淋巴细胞在静注后7 d缺失100%;十二指肠黏膜组织中B淋巴细胞在静脉滴注后7 d缺失达到90%,维持28 d。并且在成功敲除B淋巴细胞的情况下,CD4+T及CD8+T淋巴细胞无明显波动,维持在一个稳定的水平。结论利妥昔单抗注射液能有效去除中国恒河猴体内B淋巴细胞,为建立B淋巴细胞缺失动物模型奠定基础。     

云南地区恒河猴MHC部分基因频率及多态性的分析

目的 不同种群恒河猴(Macaca mulatta)主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因的差异性,很大程度上影响了用其作为动物模型的实验研究结果的稳定性、可靠性和可重复性.清晰了解云南地区恒河猴种群免疫遗传学背景对于运用该种群开展各项研究非常重要.恒河猴基因Mamu(Macaea mulaua)-A*01就被公认与猴免疫缺陷病毒(SIV)的感染与延缓病程相联系.Mamu-Ⅱ类等位基因Marnu-DRB1*0306、0309有研究表明也与SIV感染后的病程发展有关.方法 针对目前研究热点的Mamu-A*01基因及Ⅱ类Mamu-DRB1*0306、0309基因,采用序列特异性引物-聚合酶链式反应方法(PCR-SSP),对云南地区的140只恒河猴(其中92只来源于云南景东野外自然繁殖群、48只来源于本灵长类中心自繁群)进行检测.并对阳性样本用部分测序结合单链构象多态性分析(SSCP)的方法加以验汪.结果 Mamu-A*01检测结果为阴性.Mamu-DRB1*0306、0309基因频率分别为32%及45%.结论 初步显示云南地区恒河猴种群Mamu-A*01基因可能缺失或基因频率很低,但存在Mamu-DRB1*0306、0309基因.初步证明SSCP方法代替大规模测序是可行的,为云南地区恒河猴在AIDS研究中的应用提供了部分依据,一定程度上填补了该种群的遗传背景资料.     

SHIVchn19p7中国恒河猴细胞适应株的制备和生物特性研究

目的体外制备SHIVchn19p7病毒中国恒河猴细胞适应株,建立病毒库。滴定该批次SHIVchn19p7病毒的TCID50。方法用SHIVchn19p4静脉感染中国恒河猴,并进行恒河猴体内传代。定期采血测定血浆病毒载量,当病毒载量达高峰时采血分离外周血单核淋巴细胞(PBMCs),与正常恒河猴PBMCs共培养。定期测定培养液中的P24抗原水平。当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存。测定病毒RNA载量、P24抗原浓度。10倍系列稀释SHIVchn19p7病毒,加入TZM-bl细胞,测定TZM-bl细胞中Lucifres值,计算病毒的TCID50。结果本研究共制备了240mL,SHIVchn19p7病毒,gp120序列测定分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变。病毒载量为4.44×105copies/mL,P24抗原水平为3.57×102pg/mL,TZM-bl细胞测定病毒的TCID50为2.08×104mL。结论此次制备的SHIVchn19p7细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIVchn19p7/中国恒河猴模型。     

SHIV_(SF162P3)中国恒河猴细胞适应株的制备和鉴定

目的体外制备SHIVSF162P3中国恒河猴细胞适应株,建立病毒库,为模型制备提供生物学特性稳定的感染用病毒。方法用SHIVSF162P3体外感染中国恒河猴外周血单个核细胞(PBMCs),定期测定培养液中的P24抗原水平。当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存。测定病毒RNA载量、P24抗原浓度和TCID50。利用病毒RNAenv区(M33262,6846bp～8481bp,共1636bp)序列分析的方法分析毒株在制备过程中的变异情况。静脉途径感染中国恒河猴G0801V,观察血浆病毒载量、外周血CD4+/CD8的变化情况。结果本研究共制备了275mLSHIVSF162P3病毒,病毒载量为4.389×107copies/mL,P24抗原水平为5.64×102pg/mL,TZM-bl细胞滴定TCID50为8.37×104/mL。gp120序列测定分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变。感染猴G0801V高峰期病毒载量超过1×108copies/mL,急性期CD4+/CD8+倒置。结论此次制备的SHIVSF162P3细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIVSF162P3/中国恒河猴模型。