激光共聚焦显微镜观察免疫荧光双重标记的前列腺癌内基质金属蛋白酶及其作用底物的表达

目的：探讨应用激光共聚焦显微镜观察免疫荧光双重标记的前列腺癌标本的可行性及优点。方法：应用激光扫描共聚焦显微镜同时检测前列腺癌中基质金属蛋白酶(MMPs)和其作用底物的表达情况。结果:在激光扫描共聚焦显微镜下,可以清晰地观察MMP-7和层粘连蛋白（LN）可共同表达于前列腺癌细胞及基质中的基底膜、血管平滑肌和神经纤维;MMP-9和Ⅳ型胶原的主要表达于细胞外基质中的基底膜。结论:结合应用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光双重标记技术能对蛋白进行精确的定位研究。     

肝癌细胞纤维肌动蛋白的共聚焦激光扫描显微镜光学切片观察

目的：建立培养细胞共聚焦激光扫描显微镜光学切片的方法。探讨肝癌细胞纤维肌动蛋白（F-actin)的空间结构。方法：采用共聚焦激光扫描显微镜光学切片技术结合异硫酸氢荧光素-鬼笔环肽（FTTC-phalloidin)标记纤维肌动蛋白和碘化丙啶（PI）标记细胞核的荧光探针双重标记技术对肝癌细胞纤维肌动蛋白进行形态学观察和图像分析。结果：肝癌细胞内纤维肌动蛋白微丝形成束状纤维。粗壮而密集,平行排列或纵横交错成网状贯穿整个细胞和细胞突起。结论：（1）共聚焦激光扫描显微镜的光学切片技术结合FTTC-phalloidin和PI荧光探针双重标记技术是观察和分析细胞骨架系统三维立体结构的良好方法;（2）肝癌细胞内纤维肌动蛋白微丝粗壮、形成束状或网状结构。     

bFGF影响大鼠成骨样细胞ROS17/2.8连接蛋白43的表达

目的　研究大鼠成骨样细胞 ROS17/ 2 .8上连接蛋白 Cx43的表达及定量检测 b FGF对 Cx43表达的影响 .方法　应用特应性 m Ab、免疫组织化学染色法在光镜水平观察RSO17/ 2 .8细胞上的 Cx43表达 ,用激光共聚焦显微镜进行荧光标记观察和定量检测 b FGF以 10 ,2 0和 40 μg· L- 1不同浓度分别处理 ROS17/ 2 .8细胞 ,激光共聚焦显微镜检测在1,2 ,6 ,12和 2 4h时的 Cx43荧光强度 ,得出强度与时间、剂量依赖曲线图 .结果　光镜下和激光共聚焦显微镜下均见Cx43在细胞膜表面有阳性表达 ,经 b FGF处理后 ,细胞 Cx43的表达有所增强 ,以 2 0 μg·L- 1浓度时 Cx43强度最高 ;从时间看 ,6 h时 Cx43强度最大 .结论　 Cx43是成骨样细胞ROS17/ 2 .8的主要表达的连接蛋白 ,其主要表达在细胞膜区域 .b FGF对 Cx43表达有时间、剂量依赖性影响     

连接蛋白43在急性心肌缺血时不均一降解的实验研究

目的探讨急性心肌缺血时心肌细胞连接蛋白43(Cx43)含量和分布模式的改变.方法20只犬随机分为4组,通过结扎冠状动脉造成分别为0、1、3、6 h的急性心肌缺血,应用激光共聚焦显微镜技术和双重标记的荧光免疫组织化学方法对缺血心肌Cx43含量和分布的改变进行定量研究.结果①对照组Cx43象素密度2.25±0.12;1 h缺血组Cx43象素密度1.75±0.15,较对照组减少了22.2%;3 h缺血组1.35±0.21,减少了40.0%;6 h缺血组1.04±0.14,减少了53.8%,各组间差异有统计学意义;②对照组心肌细胞端对端连接处Cx43含量约为侧对侧连接处的1.36倍,缺血6h后,侧对侧连接处Cx43含量反而为端对端连接处的1.6倍;③对照组各层心肌细胞Cx43含量差异无统计学意义,缺血后中间层心肌Cx43含量较其他层心肌Cx43含量下降更明显,差异有统计学意义.结论急性短时间心肌缺血时Cx43已开始大量降解,分布也发生明显的改变,各层心肌Cx43降解程度明显不同.     

德国Leica Sp2激光扫描共聚焦显微镜

激光扫描共聚焦显微镜是以激光作为激发光源,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置,对荧光标记样本进行断层扫描,获得高分辨率的光学切片,并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理的一套观察、分析和输出系统。激光扫描共聚焦显微镜具有非常广阔的应用领域和应用前景。     

膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜同步实时控制系统的建立及其在心肌细胞膜钙离子通道研究中的应用

膜片钳技术和激光扫描共聚焦显微镜技术是膜上钙离子通道的功能－形态研究中两种最常用的技术。膜片钳技术能获得膜上钙离子通道的离子电流,但不能够对离子的移动进行实时定位,不能定量分析离子浓度。激光扫描共聚焦显微镜技术可以对钙离子的移动进行实时定位,但不能对单个离子通道的离子移动信号（如单通道电流）进行分析。本文的研究通过在激光扫描共聚焦显微镜上加装膜片钳装置,采用计算机自动控制技术建立膜片钳与激光扫描共聚焦显微镜的同步实时控制系统,并应用于膜上钙离子通道的研究,实现了在利用膜片钳进行全细胞记录观测和测定膜上钙离子通道电流及其开闭时程的同时,利用激光扫描共聚焦显微镜的实时线扫、面扫描技术同步获得了钙火花的显微结构形态图像,测定钙离子的位点变化。该方法可以同时记录钙离子电流信号和胞浆内Ca2＋浓度的变化信息,解决了显微形态与功能同步实时分析的问题,有助于进一步了解膜上钙离子通道的内部机制。     

乳鼠心成纤维细胞波形蛋白和线粒体表达的激光扫描共聚焦显微镜观察

目的：激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察培养的乳鼠心成纤维细胞中细胞骨架波形蛋白（vimentum,Vim)、线粒体（mitochondrial,Mi)以及相互关系，方法：分离纯化乳鼠心成纤维细胞，免疫荧光双标记技术进行了Vim和Mi的标记，激光扫描共聚焦显微镜观察。结果：培养的乳鼠心成纤维细胞中Vim位于细胞的胞质中，呈粗细不等的绿色线条状或丝状分布，标记明显，许多细丝交织形成网状结构，Mi标记为红色颗粒状，遍布于细胞质中，Mi的颗粒大小不等，形态不一，可聚集成团，并有明显的沿着Vim分布的趋势。结论LSCM观察培养的心成纤维细胞中Vim呈细丝交织形成立体的网状结构，Mi有沿着细胞骨架Vim分布的趋势。     

应用激光扫描共聚焦显微镜对脑脊液转移B细胞型淋巴瘤细胞线粒体的研究

近期激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal mioroscope,LSCM)具有对细胞进行光学切片,荧光定量、定位分析等其它方法不具备的功能[1,2],本研究将应用于脑脊液淋巴瘤细胞线粒体研究.     

一种检测巨噬细胞内NADPH氧化酶活性的新方法

目的建立一种检测活细胞内ＮＡＤＰＨ氧化酶活性的新方法。方法用超氧离子物荧光探针ＨＥ标记巨噬细胞后,在激光扫描共聚焦显微镜下,用最适发射波长为５３０ｍｍ的检测器１检测巨噬细胞内ＨＥ的荧光强度变化。结果检测器１可检测单个和多个巨噬细胞内ＨＥ的荧光强度变化,ＰＭＡ刺激后巨噬细胞内ＨＦ荧光强度增强,ＮＡＤＰＨ氧化酶活性升高;地塞米松使巨噬细胞内ＨＥ荧光强度减弱,ＮＡＤＰＨ氧化酶活性降低：经地塞米松处理０．５ ｈ, ＰＭＡ刺激引起的巨噬细胞内 ＨＥ荧光强度增强幅度减小, ＮＡＤＰＨ氧化酶活性变化减小。结论激光扫描共聚焦显微术结合荧光标记技术可原位实时观察活细胞内ＮＡＤＰＨ氧化酶活性的变化。     

激光扫描共聚焦显微镜实验教学的探索

激光扫描共聚焦显微镜的应用越来越广泛，文中简述了激光扫描共聚焦显微镜原理、特点，并对激光扫描共聚焦显微镜应用于实验教学的模式进行了一定的探索。     

辛伐他丁减少Connexin43表达和兔粥样硬化斑块形成

目的:证明辛伐他丁可以通过减少缝隙连接蛋白43(Connexin43, Cx43)的表达影响粥样斑块的形成及稳定性. 方法:高脂饲料喂养建立粥样硬化模型,治疗组给予辛伐他丁口服,活体内的Cx43和巨嗜细胞检测使用免疫组织化学方法,培养平滑肌细胞的Cx43检测使用免疫印记方法,Cx43的半定量使用计算机图像处理. 结果:药物干预的培养细胞和模型治疗组中Cx43的表达均明显减少,斑块的组成中,炎症细胞减少50%,胶原纤维平滑肌细胞含量增加. 结论: Cx43介导的细胞间通讯在粥样硬化形成中起重要作用,同时辛伐他丁减少Cx43的表达可以增加斑块的稳定性,Cx43成为动脉粥样硬化治疗中一个新的治疗靶点.     

Effects of all-trans-retinoic acid on the expression and tyrosine phosphorylation of gap junction connexin 43 in HeLa cell line and its significance

Gapjunctionalintercellularcommunication(GJIC)areperformedbyintercellularhemichannelswhichareformedby6basicproteinsubunitsnamedconnexin(Cx)expressedinneighboringcells［1］.Sixconnexinsformaroundacentralpore,throughwhichadjacentcellscanexchangelow-molecular-weightmoleculesofinformationandenergydirectly.Atleast16membersoftheconnexinsuperanti-oncogenefamilyhavebeenidentified,whicharedividedinto2groupsaccordingtotheiraminoacidsequences.GJICmediatedviagapjunctionsplaysimportantrolesintissuehomeos…     

心房肌间隙连接重构与风湿性瓣膜病患者心房颤动的关系

目的　探讨风湿性瓣膜病慢性心房颤动 (房颤 )患者心房肌组织中连接蛋白 4 0 (Cx4 0 )和连接蛋白 4 3(Cx4 3)蛋白质表达和分布的变化与慢性房颤的关系。方法　 32例风湿性心脏病患者 ,其中慢性房颤患者 2 1例 ,窦性心律者 11例 ,瓣膜置换术时取右心耳组织。用免疫荧光双标共聚焦显微镜和Western印迹观察Cx4 0和Cx4 3蛋白质表达和分布的改变。结果　激光共聚焦显微镜计算的Cx4 0荧光斑面积反映了蛋白表达水平 ,慢性房颤组为 0 6 7μm2 / μm3 ± 0 0 9μm2 / μm3 ,显著低于窦性心律组的 1 4 5 μm2 / μm3 ± 0 16 μm2 / μm3 (P <0 0 1) ,且细胞端端连接减少较侧侧连接处严重 ,分布呈现不均一性。Cx4 3总体表达水平未变 ,慢性房颤组为 1 38μm2 / μm3 ± 0 14 μm2 / μm3 ,窦性心律组为 1 5 3μm2 / μm3 ± 0 2 7μm2 / μm3 ,但侧侧分布增加而横向分布减少。Western印迹反映的Cx4 0和Cx4 3蛋白质表达水平与激光共聚焦观察结果一致。结论　心房肌Cx4 0和Cx4 3蛋白质水平降低和再分布可能与风湿性瓣膜病慢性房颤的发生和维持有关。     

真核表达载体pcDNA3.0-Cx43的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的：构建携带间隙连接蛋白connexin43(Cx43)cDNA的真核表达载体,转染骨髓基质干细胞,观察间隙连接蛋白Cx43在骨髓基质干细胞中的过量表达．方法：目的基因Cx43 cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pcDNA3．0,转染大鼠骨髓基质干细胞,用G418筛选得到Cx43基因高表达的细胞;对照组为pcDNA3．0直接转染骨髓基质干细胞．结果：酶切电泳结果显示按设计构建的载体pcDNA3．0-Cx43,经G418筛选得到不同抗性的骨髓基质干细胞,免疫细胞化学显示有Cx43蛋白的表达．结论：Cx43可以在骨髓基质干细胞中表达．     

应用PCR测定Cx43转基因小鼠的基因型

目的：应用聚合酶链反应(PCR)技术，检测Cx43(connexin 43)转基因小鼠的基因型。方法：采用CMV43转基因小鼠和Cx43剔除小鼠分别与野生型小鼠杂交繁殖，切取子代小鼠尾巴制备DNA，应用PCR技术扩增DNA，观察目的基因的阳性率。结果：CMV43转基因小鼠子代66个，dhfr PCR检测阳性率为31．8％。Cx43基因剔除小鼠子代21个，分别与Cx43野生型引物和Cx43剔除引物进行PCR，两者均阳性( ／ )12个，百分率为57．1％，前者阳性而后者阴性(杂合子 ／-)7个，百分率为33．3％，两者均阴性(纯合子-／-)2个，百分率为9．6％。野生型小鼠经Cx43野生型引物PCR检测结果均为阳性。结论：PCR技术用于Cx43转基因小鼠基因型的检测敏感度高，特异性强，易操作，可用作Cx43转基因小鼠心血管畸形模型研究的初选方法。     

Hedgehog通路对乳腺癌细胞增殖和凋亡的作用及其对Cx32和Cx43表达的影响

目的: 研究Hedgehog通路对乳腺癌细胞增殖、凋亡及间隙连接蛋白32(Cx32)和间隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响,探讨其在乳腺癌细胞增殖和转移中的作用机制。方法: 取对数生长期乳腺癌MCF-7细胞分为环巴胺组和空白对照组,环巴胺组分别以5、10、20、30和40 μmol·L^-1环巴胺处理MCF-7细胞24、48和72 h,应用MTT法测定各组MCF-7细胞增殖抑制率。以0(阴性对照组)和25 μmol·L^-1环巴胺处理MCF-7细胞48 h后,AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率及Cx32、Cx43胞膜阳性表达率。结果: 与空白对照组比较,各剂量环巴胺组MCF-7细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05),且随环巴胺剂量增加和作用时间延长其增殖抑制作用增强;与空白对照组比较,25 μmol·L^-1环巴胺组48 h时,MCF-7细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。与阴性对照组比较,25 μmol·L^-1环巴胺组48 h时,MCF-7细胞胞膜Cx32和Cx43阳性表达率明显升高(P<0.05)。结论: Hedgehog通路可抑制乳腺癌细胞凋亡,并调节Cx43和Cx32的胞膜表达。     

Changes in Phosphorylation of Connexin43 in Rats during Acute Myocardial Hypoxia and Effects of Antiarrhythmic Peptide on the Phosphorylation

In order to confirm the hypothesis that during acute hypoxia, the antiarrhythmic peptide (AAP10) could improve conductance by changing the phosphorylation state of connexin43 (Cx43), isolated perfused rat hearts were randomly divided into three groups: control, hypoxia and AAP10 (n=9 in each group). The change in Cx43 phosphorylation was tested by Western-blot; the distribu- tion of Cx43 was observed by confocal immunofluorescence microscopy. Western-blot analysis re- vealed that the expression of total Cx43 protein was significantly decreased during acute hypoxia, while nonphosphorylated Cx43 (NP-Cx43) was unchanged. AAP10 could increase the expression of total Cx43 protein, but had no effects on the NP-Cx43 protein. Immunofluorescence study showed that during acute hypoxia, both total Cx43 and NP-Cx43 proteins were greatly decreased, while AAP10 only increased the expression of total Cx43 protein, but had no effect of the NP-Cx43 protein expression. These findings suggested that the decrease of intercellular communication may be associ- ated with the reduction of phosphorylated Cx43 (p-Cx43) and translocation of NP-Cx43 from the surface of gap junction into intracellular pools during acute hypoxia. AAP10 can improve intercelluar communication by enhancing phosphorylation of Cx43.     

Cx基因组在大肠癌中的表达及突变

目的 :研究大肠癌基因组中Cx基因的表达 ,探讨诱导剂作用后Cx基因的表达及Cx4 3基因编码序列突变。方法 :Northern杂交、RT PCR和PCR 单链构象多肽分析。结果 :正常大肠粘膜有Cx32、Cx37、Cx4 3mRNA的高表达 ,大肠癌癌旁组织有较弱的Cx32、Cx37、Cx4 3基因表达 ,大肠癌组织中仅有Cx4 3基因微弱表达。维甲酸 (RA)、二甲基亚砜 (DMSO)对大肠癌基因组中Cx4 3基因有诱导作用 ,而其本身表达的Cx4 6基因在RA及佛波酯 (TPA)作用后明显减弱或消失。Cx4 3基因编码区未发现突变。结论 :Cx32可能是人大肠粘膜上皮细胞基因组中维持细胞间隙连接通讯功能的特异表达的Cx基因 ,Cx4 6可能是大肠癌Cx基因表达的一种变异。Cx4 3基因在人大肠癌中表达下调的原因不是其编码区的点突变     

Gap junctional protein connexin 43 in rat detrusor muscle with unstable bladder

Background Unstable bladder is one of the common clinical dysfunctions of the lower urinary tract. Gap junctions （GJs） are the plaques of aqueous channels that facilitate electrical and metabolic communication between the intracellular compartments of adjacent cells, exchange of nutrients and ions between connected cells and transfer of electrical signals In the present study we investigated the quantitative alterations of the GJ in the rat detrusor muscle and its functional changes related to the developing of unstable bladder （USB）. Methods Thirteen female Wistar rats （study group） with obstructive unstable bladder as determined by urodynamic study and 10 sham-operated rats （control group） were sacrificed at 6 weeks after surgery. Cystometric investigation, and the content and distribution of the GJ protein connexin 43 （Cx43） in the detrusors which were taken from the bladder of the rats were studied by Western blot and laser confocal microscopy with a double label immunohistochemistry technique. Results The expression of Cx43 was found adjacent to the detrusor with the laser confocal microscopy. The Cx43 expression increased markedly in the study group （pixel density 29.5±13.9, staining size （17.9±8.8） μm2） compared with the control group （pixel density 14.2±2.2, staining size （5.7±3.1） pm2, P 〈0.05）. Western blot analysis demonstrated that Cx43 in the study group （the average gray level was 31.066） was significantly higher than in the control group （the average gray level was 11.701, P 〈0.01 ）. Conclusion The increase of GJ leading to a intercellular excitatory communication is one of the important mechanisms related to developing unstable bladder.     

连接蛋白43基因敲除小鼠胚胎心脏流出道组织中转录因子的表达及意义

目的 研究连接蛋白43（Cx43）基因敲除小鼠胚胎心脏近端流出道组织中转录因子的改变,从分子水平探讨Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏近端流出道发育异常的原因。方法 以胎龄13．5d和14．5d的Cx43基因敲除、Cx43杂合子和Cx43野生型鼠胚心脏近端流出道部分为研究对象。分别提取总RNA,反转录成cDNA;并在体外转录为cRNA,同时进行生物素标记及片段化;再与Affymetrix 4302．0小鼠全基因组芯片进行杂交。杂交信号经扫描后,应用相关生物信息软件分析基因表达情况。用实时定量逆转录（RT）PCR的方法对基因芯片筛选出的与心脏发育相关的部分转录因子进行验证。结果 与Cx43野生型组相比,Cx43基因敲除组表达差异的基因中,有6个是与心脏发育相关的转录因子。实时定量RT—PCR验证了其中3个基因：Soxll、Foxpl和Tbx20。在胎龄13．5d,Cx43基因敲除鼠胚Sox11、Foxp1的表达量均明显低于Cx43野生型组（4．76±0．19 vs 5．34±0．25,5．08±0．28 vs 5．64±0．15,均P〈0．01）;Tbx20在各组间差异不明显。胎龄14．5d,各基因Sox11、Foxp1以及Tbx20的表达量在基因敲除组均明显低于Cx43野生型组（4．71±0．27 vs 5．00±0．19,5．25±0．31 vs 5．77±0．16,7．05±0．17 vs 7．43±0．25,均P〈0．05）。其变化趋势与基因芯片结果基本一致。结论 心脏特异性的转录因子Foxp1、Sox11和Tbx20等的表达异常可能与Cx43基因敲除小鼠流出道的异常发育有关。