乏氧对EC9706细胞多药耐药相关蛋白表达的影响

目的:研究乏氧对人食管鳞状细胞癌EC9706细胞株的多药耐药相关蛋白(MRP)表达的影响,探讨乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)在乏氧引起肿瘤细胞多药耐药中的作用.方法:采用化学性低氧诱导剂氯化钴(CoCl2)体外培养人食管鳞状细胞癌EC9706细胞株,用RNAi沉默HIF-1α基因表达,应用半定量RT-PCR检测HIF-1α基因沉默效果.应用RT-PCR、免疫细胞化学技术检测RNA干扰前后乏氧条件下MRP1蛋白及RNA水平表达的变化.结果:乏氧后EC9706细胞中MRP1 mRNA和蛋白的表达均增加(P<0.05).针对HIF-1α基因的siRNA干扰技术,能有效沉默HIF-1α基因的表达.同样乏氧条件,转染HIF-1α siRNA后EC9706细胞较未转染及转染Control siRNA组细胞相比,MRP1 mRNA和蛋白的表达均减少(P<0.05).结论:HIF-1α上调食管鳞状细胞癌细胞中MRP1的表达可能是乏氧条件下化疗耐药的机制之一;HIF-1α可望成为新的食管鳞状细胞癌治疗的靶点.     

五味子乙素对转染多药耐药1基因的MCF-7细胞的多药耐药逆转作用

目的 探讨五味子乙素(SchB)对转染多药耐药1基因(MDR1)的人乳腺癌细胞MCF-7的多药耐药逆转作用及相关机制。方法 将人MDR1基因导入MCF-7细胞,形成耐药细胞株MCF-7／MDR1;用该细胞株为模型评价SchB的体外逆转多药耐药作用,用MTT法进行化疗药物单独或与SchB联合作用时对耐药细胞的IC50比较,计算逆转倍数。结果 转染细胞MCF-7／MDR表现为P糖蛋白高表达,对阿霉素、长春新碱、紫杉醇、高三尖杉酯的抗药性均增加;SchB(25μmol／L)显著减少阿霉素、长春新碱、紫杉醇和高三尖杉酯对MCF-7／MDR细胞的IC50,逆转倍数达6．03-23．94倍;SchB(25μmol／L)使MCF-7／MDR细胞对若丹明123的胞内积聚增加约5倍。效果与维拉帕米10μmol／L浓度时相当;但SchB(25μmol／L)不影响MCF-7／MDR细胞的P-糖蛋白表达。结论 SchB能有效逆转转染MDR1的MCF-7细胞的多药耐药,其机制可能是抑制了P-糖蛋白的药物外排生物学活性。     

药物诱导与耐药基因转染两种方法建立的人食管癌顺铂耐药细胞系的比较

目的比较药物诱导和耐药基因转染两种方法所建立的人食管癌顺铂耐药细胞系的不同特点。方法顺铂(cDDP)中等浓度、间歇作用法历时9个月建立食管癌耐药细胞系Ec9706/cDDP;同时采用脂质体转染法将人野生型DNA聚合酶β(polβ)的重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-AC3转染入食管癌细胞Ec9706,经G418筛选得到稳定转染细胞系Ec9706-AC3。荧光显微镜观察转染效果,普通倒置显微镜观察细胞形态变化。绘制生长曲线,计算群体倍增时间。RT-PCR方法检测细胞中polβmRNA的表达水平,MTT法测细胞对顺铂的敏感性,并观察冻存复苏、撤药培养对耐药性的影响。结果两种方法所获耐药细胞与亲本细胞相比形态无明显变化,polβmRNA表达均增加。Ec9706/cDDP耐药指数为15.70±1.16,冻存复苏对耐药指数影响不大,而撤药培养可使耐药性降低,细胞群体倍增时间延长;Ec9706-AC3细胞耐药指数为1.78±0.67,不受冻存复苏、撤药培养的影响,细胞群体倍增时间不变。结论用不同方法成功建立两种人食管癌顺铂耐药细胞,不同方法获得的耐药细胞生物学特性有所不同。     

Beta-微管蛋白ⅢASODN对Ec9706/P-1细胞凋亡的影响

目的:观察β-微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ,TUBB3)反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide,ASODN)对Ec9706/P-1细胞凋亡的影响。方法:以体外诱导的人食管癌紫杉醇耐药细胞株Ec9706/P-1为模型,设ASODN组和无关序列寡核苷酸(Nonsense oligonucleotide,NSODN)组,应用免疫细胞化学方法检测NF-κBppabp65、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达;采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测NF-κBppabp65、bcl-2和caspase-3 mRNA的表达;采用DNA凝胶电泳和吖啶橙荧光染色法检测细胞凋亡变化。结果:免疫细胞化学方法显示ASODN组NF-κBppabp65蛋白表达率与NSODN组比较差异无统计学意义(P>0.05),ASODN组Bcl-2蛋白表达率与NSODN组比较差异有统计学意义(P<0.05),ASODN组Caspase-3蛋白表达率与NSODN组比较,差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR法显示ASODN组caspase-3 mRNA条带亮度强于NSODN组,bcl-2 mRNA条带亮度低于NSODN组,ASODN组NF-κBppab mRNA条带亮度与NSODN组相近;DNA凝胶电泳显示紫杉醇作用后ASODN组有凋亡特征的DNA改变,而NSODN组细胞却未出现;吖啶橙荧光染色法表明ASODN组凋亡率与NSODN组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TUBB3反义寡核苷酸增加了紫杉醇对Ec9706/P-1细胞的诱导凋亡能力,证明了Bcl-2和Caspase-3的表达变化很可能是产生紫杉醇耐药的主要机制之一。     

葡萄糖神经酰胺合酶基因在多药耐药肿瘤细胞株KBV200的表达及其与肿瘤多药耐药性的关系

目的 观察葡萄糖神经酰胺合酶(glucosylcerarnide synthase,GCS)基因在人口腔表皮样癌多药耐药细胞株KBV_(200)的表达及其与肿瘤多药耐药性(MDR)的关系。方法 采用RT-PCR分析KBV_(200)及其亲本KB细胞株GCS基因表达的差异,运用MTT法分析KBV_(200)经糖脂合成酶抑制剂苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(DL-PPMP)及钙离子通道阻滞剂异搏定处理前后细胞MDR的变化,应用RT-PCR技术检测KBV_(200)细胞耐药逆转后GCS及mdrl基因的表达。结果 KBV_(200)细胞GCS和mdrl基因的表达明显强于KB细胞,而KB细胞mdrl基因表达为阴性。5～25μmol/L DL-PPMP均可抑制KBV_(200)GCS mRNA表达,25 μmol/L时抑制强度最大;10 μmol/L异搏定即可抑制KBV_(200)GCS mRNA表达,15 μmol/L时抑制作用明显。DL-PPMP和异搏定均可抑制mdrl基因的表达,KBV_(200)经25μmol/L DL-PPMP作用48h后细胞内mdrl表达为阴性。结论 异搏定和DL-PPMP对GCS和marl基因表达的抑制调节呈浓度依赖性,它们可通过抑制GCS和mdrl基因表达,逆转KBV_(200)对长春新碱的耐药。KBV_(200)GCS基因的表达与MDR存在正相关,GCS基因可能在肿瘤的多药耐药过程中起着重要作用。     

人多药耐药基因1在CHO细胞中的表达及功能研究

目的:构建人多药耐药基因(MDR1)的真核表达载体,转染CHO细胞,研究MDR1基因在真核细胞中的表达及功能.方法:将MDR1全长基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1( ),利用阳离子脂质体转染CHO细胞,RT-PCR检测MDR1转染阳性细胞,并用G418筛选稳定表达MDR1基因的细胞,通过测定细胞对Rh123的外排作用以及对阿霉素的耐受性确定MDR1基因在正常细胞中的功能.结果:酶切鉴定和测序结果证明构建的重组表达载体pcDNA-MDR1序列正确.RT-PCR分析以及荧光显微镜观察结果表明:该重组表达载体已在CHO细胞中有效转录并稳定表达.Rh123外排和MTT药敏实验结果显示:转染pcDNA-MDR1的CHO细胞对Rh123外排作用显著高于未转染的CHO细胞,并且转染后的CHO细胞对阿霉素的耐药性也有显著提高.结论:成功构建了稳定表达MDR1并具有多药耐药功能的细胞株,有望成为多药耐药性药物研究的细胞模型.     

多药耐药相关蛋白-2在白血病耐药细胞株K562/A02的表达

目的:研究多药耐药相关蛋白-2（MRP-2）与白血病细胞耐药的关系,并探讨其在白血病多药耐药中的意义。方法：应用RT-PCR方法检测白血病细胞株K562与耐药细胞株K562/A02中MRP-2 mRNA的差异表达,然后将MRP-2反义及正义寡核苷酸片段分别用脂质体转染至耐药细胞株K562/A02,采用MTT法、流式细胞术及RT-PCR法检测转染后细胞内阿霉素的荧光强度、耐药指数及MRP-2 mRNA的表达情况。结果：耐药细胞株K562/A02中MRP-2 mRNA表达水平明显高于白血病细胞株K562（P<0.05）。MRP-2反义寡核苷酸片段转染后耐药细胞株K562/A02细胞内的阿霉素浓度升高,耐药指数较未转染细胞明显降低（P<0.05）;转染后耐药细胞株K562/A02细胞MRP-2 mRNA表达水平较未转染细胞下降了67.5%,两者比较差异具有显著性（P<0.05）。结论：MRP-2的高表达导致白血病耐药细胞内化疗药物浓度降低,可能是其导致白血病多药耐药的机制之一。     

人多药耐药基因1(mdr1)的克隆及重组腺病毒制备

目的:构建表达多药耐药基因1(MDR1)的重组腺病毒表达系统.方法:用基因工程技术将多药耐药基因1的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,然后在细菌内与pAdEasy同源重组,经脂质体转染293细胞包装、扩增腺病毒颗粒.将重组腺病毒Ad5-mdr1感染小鼠单个核细胞,通过荧光显微镜及流式细胞仪进行检测.结果:酶切鉴定及PCR结果证明多药耐药基因重组腺病毒载体构建成功,构建的人多药耐药基因1(mdr1)重组腺病毒载体的效价达到8.3×1011 pfu/ml.对小鼠单个核细胞的感染效率可达10%～15%,转染小鼠单个核细胞细胞48h后,可检测到mdr1基因的表达.结论:成功构建了表达多药耐药基因1的重组腺病毒载体,为后续对mdr1的相关研究创造了条件.     

Notch1在调节小细胞肺癌多药耐药中的作用

目的探讨Notch1在小细胞肺癌多药耐药中的作用。方法首先通过QRT-PCR和Western-blot从基因和蛋白水平检测小细胞肺癌敏感细胞株(H69)和耐药细胞株(H69AR)中Notch1的差异表达;应用siRNA抑制耐药细胞株H69AR中的Notch1的表达,通过CCK8检测细胞对各种化疗(ADM,DDP,VP-16)的敏感性,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。结果 Notch1在H69AR中的表达明显高于H69,抑制耐药细胞株中Notch1的表达能够增加细胞对化疗药物的敏感性,促进细胞的凋亡。结论 Notch1可能参与了调节小细胞肺癌对多药耐药性。     

siRNA逆转乳腺癌多药耐药的研究

目的研究siRNA(small interfering RNA)对乳腺癌多药耐药性的逆转作用。方法设计针对MRP基因的siRNA,转染乳腺癌MCF-7/adr细胞,用实时荧光定量PCR分析MRP mRNA的表达;流式细胞仪检测MRP蛋白表达和细胞内柔红霉素积累量。结果该siRNA能使耐药细胞株MCF-7/adr中MRP基因的mRNA及蛋白表达水平分别下调(58.16±1.36)%、(51.87±1.90)%(P<0.05),细胞内柔红霉素积累量显著增加(P<0.01)。结论siRNA可逆转乳腺癌的多药耐药。     

糖尿病患者多药耐药基因mdr1的表达

目的：体外观察糖尿病患者肝细胞诱导发生胰岛素抵抗（IR）中多药耐药基因mdr1的表达。方法：采用高浓度胰岛素诱发肝源性细胞HepG2建立IR细胞模型（HepG2 IR细胞）,GOD-POD微量化法测定葡萄糖消耗量,RT-PCR检测胰HepG2 IR细胞mdr1基因和胰岛素受体（InsR）mRNA的表达,流式细胞术（FCM）检测P-糖蛋白（P-gp）和InsR蛋白水平。结果：胰岛素诱发HepG2发生IR后,HepG2 IR细胞葡萄糖消耗量降低约10%～45%,InsR基因mRNA表达显著下调、受体表达量降低50.2%～82.9%。胰岛素诱导HepG2细胞产生抗性的过程中,耐药基因mdr1基因表达同步显著增强,mRNA转录增高0.7～2.1倍,P-gp表达阳性细胞增加0.6～1.7倍、表达强度增高。结论：胰岛素诱发的肝脏胰岛素抵抗细胞mdr1基因和P-gp的表达显著增强,提示耐药基因可能与胰岛素抵抗相关联。     

Bcl-2蛋白表达在人肾细胞癌株多药耐药中的作用

目的探讨Bcl-2基因在人肾细胞癌株多药耐药中的作用。方法应用流式细胞仪(AnnexinV染色)检测及免疫组织化学技术,分别对阿霉素诱导的GRC-1和RCC-925的细胞凋亡及其Bcl-2蛋白表达进行研究。结果阿霉素浓度为0.1及1.0mg/L时,GRC-1细胞凋亡百分数(12.3±4.4)%及(35.9±1.9)%与RCC-925细胞凋亡百分数(35.7±11.9)%及(66.9±14.9)%之间存在显著性差异(P<0.01),高度耐药细胞株GRC-1的细胞凋亡明显受到抑制;GRC-1中Bcl-2蛋白表达水平明显高于低度耐药细胞株RCC-925(P<0.001)。结论Bcl-2蛋白在人肾细胞癌株多药耐药中高表达,可能是导致其细胞凋亡受抑制的原因,与人肾细胞癌株多药耐药的产生相关。     

多药耐药基因mdr_1在食管癌组织中的表达及其意义

目的 :检测食管癌基因mdr1mRNA表达 ,探讨其与食管癌临床病理间的关系。方法 :应用逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)对 5 1例术前未作治疗的食管癌 ,2 0例正常食管组织的mdr1mRNA进行检测并于食管癌患者的病理类型、部位、浸润转移作对比研究。结果 :5 1例食管癌癌组织中mdr1mRNA阳性表达率为 6 2 .7% (32 /5 1) ,正常食管组织表达率为 10 .0 % (2 /2 0 ) ,二者差异有显著性 (P <0 .0 1)。mdr1mRNA食管癌的分化程度、发生部位、病理类型、浸润转移无关 (P >0 .0 5 )。结论 :食管癌组织中mdr1mRNA的存在着高表达 ,可作为食管癌化疗耐药的指标     

白血病耐药细胞中多药耐药基因MDR1与核转录因子κB的关系

目的:研究核转录因子κB与多药耐药基因MDR1在白血病化疗耐药中的作用,阐明核转录因子κB(NF-κB)与白血病多药耐药的关系及相关分子机制。方法：白血病细胞K562和阿霉素(ADM)诱导的耐药细胞K562/ADM分别应用ADM（0、0.25、0.50、1.00和2.00 μg·L^-1）或丝裂霉素(MIT)（0、2、4、8和16 mg·L^-1）　作用48 h,通过MTT法检测细胞生存率,计算细胞耐药指数;RT-PCR方法检测MDR1和IκB mRNA表达;Western blotting方法检测P-gp和P65的蛋白表达。结果：ADM和MIT分别作用后,与空白对照组比较,白血病细胞K562细胞生存率下降(P<0.01),呈剂量依赖性;ADM和MIT对耐药细胞K562/ADM生存率作用不明显;在mRNA水平上,与K562细胞比较,K562/ADM细胞的MDR1 mRNA高表达(P<0.01)。与空白对照组比较,ADM 0.50和1.00　 μg·L^-1>或MIT 4和8 mg·L^-1分别作用K562细胞和K562/ADM细胞,IκBα mRNA表达均下降(P<0.01),并呈剂量依赖性;在蛋白水平上,与K562细胞比较,K562/ADM细胞的P-gp蛋白高表达(P<0.01)。与空白对照组比较,ADM 0.50和1.00 μg·L^-1或MIT 4和8 mg·L^-1分别作用K562/ADM细胞,P-gp蛋白表达量升高(P<0.01),同时P65蛋白表达量升高,且呈药物剂量依赖性(P<0.01)。结论：MDR1基因及P-gp蛋白的高表达很可能是白血病细胞K562多药耐药性形成的关键机制,而NF-κB的激活可能参与了多药耐药的调控。     

人肺腺癌紫杉醇耐药细胞株的建立及其特性研究

目的 建立耐紫杉醇的人肺腺癌A549(A549/Taxol)细胞株,并初步研究其生物学特性.方法 应用抗肿瘤药紫杉醇以体外浓度递增和短时作用法筛选A549细胞株.用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞的耐药指数及对多种抗癌药物的敏感性;免疫细胞化学法检测P-糖蛋白(P170)、β-tubulin等耐药相关蛋白的表达情况.结果 A549/Taxol细胞的紫杉醇半数抑制浓度(IC50 )是亲代A549细胞的512.8倍,群体倍增时间是亲代细胞的1.28倍,对紫杉醇、丝裂霉素、长春新碱、诺维本的耐药指数依次为512.8、66.48、4.88和 2.06;而对顺铂、健择无交叉耐药.A549/Taxol细胞高表达P170,β-tubulin表达水平高于其亲代细胞系.结论 成功建立了一株耐紫杉醇的A549/Taxol,并呈多药耐药特性.     

肺腺癌细胞MRP基因甲基化与多药耐药的相关性

目的探讨肺腺癌SPCA-1细胞中多药耐药相关蛋白(MRP)基因甲基化状态与MRPmRNA、MRP表达的关系.方法应用限制性内切酶Ec047Ⅲ和PCR法检测人胚肺WI-38细胞、肺腺癌SPCA-1细胞及经阿霉素诱导的耐药细胞MRP基因甲基化状态;原位杂交法检测MRPmRNA表达;免疫组化法测定MRP表达.结果 WI-38细胞MRP基因启动子区处于高甲基化状态,SPCA-1肺腺癌细胞和经阿霉素诱导的耐药细胞MRP基因启动子区处于低甲基化状态.WI-38细胞、SPCA-1肺腺癌细胞、不同浓度阿霉素诱导的耐药SPCA-1细胞MRPmRNA和MRP表达的阳性率和强阳性率,经组间多重比较均有显著性差异. 结论 SPCA-1肺腺癌细胞MRP基因启动子区处于低甲基化状态,尤其5'端调控区低甲基化是导致转录活性增加的重要结构基础,参与肺癌耐药的发生.     

纳米微粒介导反义寡脱氧核苷酸逆转乳腺癌细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨纳米微粒介导耐药基因mdr-1、mrp反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)转染对多药耐药乳腺癌MCF-7/ADR细胞的影响.方法 采用纳米微粒介导mdr-1、mrp-ASODN转染耐药细胞株MCF-7/ADR,RT-PCR、Western blot检测转染48 h后细胞耐药基因mdr-1、mrp的表达;MTT法检测经转染后MCF-7/ADR细胞对阿霉素(ADR)、表柔比星(epimbicin)、5-氟脲嘧啶(5-FU)和紫杉醇(paditaxel)的敏感性.结果 纳米微粒介导mdr-1、mrpASODN转染48 h后,MCF-7/ADR细胞的mdr-1、mrp在mRNA和蛋白质表达水平上均显著降低(P<0.05);细胞对ADR、表柔比星、5-氟脲嘧啶和紫杉醇的耐药指数均显著降低(P<0.05).结论 耐药基因反义寡脱氧核苷酸能在体外抑制耐药基因的表达,从而提高细胞的药物敏感性;纳米微粒具有较好的体外介导反义寡脱氧核苷酸转染效果.     

肺腺癌细胞MRP基因甲基化与多药耐药的相关性

目的探讨肺腺癌SPCA-1细胞中多药耐药相关蛋白(MRP)基因甲基化状态与MRPmRNA、MRP表达的关系.方法应用限制性内切酶Ec047Ⅲ和PCR法检测人胚肺WI-38细胞、肺腺癌SPCA-1细胞及经阿霉素诱导的耐药细胞MRP基因甲基化状态;原位杂交法检测MRPmRNA表达;免疫组化法测定MRP表达.结果 WI-38细胞MRP基因启动子区处于高甲基化状态,SPCA-1肺腺癌细胞和经阿霉素诱导的耐药细胞MRP基因启动子区处于低甲基化状态.WI-38细胞、SPCA-1肺腺癌细胞、不同浓度阿霉素诱导的耐药SPCA-1细胞MRPmRNA和MRP表达的阳性率和强阳性率,经组间多重比较均有显著性差异. 结论 SPCA-1肺腺癌细胞MRP基因启动子区处于低甲基化状态,尤其5'端调控区低甲基化是导致转录活性增加的重要结构基础,参与肺癌耐药的发生.     

Y-盒结合蛋白1对白血病K562细胞多药耐药基因-1表达的调控

目的:观察多柔比星诱导K562细胞多药耐药基因-1(mdr1)基因表达过程中Y-盒结合蛋白1(YB-1)表达和核易位的变化情况,初步探讨YB-1蛋白对mdr1基因的转录调控。方法:多柔比星间歇性长期作用于K562细胞,剂量逐渐增加。RT-PCR检测mdr1,YB-1基因表达,流式细胞仪检测mdr1基因编码的P糖蛋白(P-gp)表达,蛋白质印迹检测YB-1蛋白核易位。通过RNA干扰技术使K562细胞中YB-1基因表达沉默,多柔比星处理YB-1基因沉默细胞,RT-PCR、流式细胞仪分别检测mdr1 mRNA和P-gp的表达。结果:经多柔比星作用后K562细胞mdr1基因转录上调,P-gp表达增加,同时YB-1基因转录也增强,且出现明显的核易位。YB-1基因沉默后,mdr1基因诱导性表达减少。结论:多柔比星诱导K562细胞mdr1基因表达的过程中,YB-1对于mdr1基因的转录活化起一定的作用。     

小儿恶性肿瘤化疗前后外周血多药耐药基因、多药耐药相关蛋白基因、肺耐药蛋白基因的变化及临床意义

目的探讨实体恶性肿瘤化疗患儿外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中多药耐药基因(multi-drug resistance1,MDR1)、多药耐药相关蛋白基因(multi-drug resistance-associated protein1,MRP1)、肺耐药蛋白基因(lung resistance protein,LRP)的表达量及其与临床化疗的关系。方法应用实时荧光定量PCR(real-time fluores-cence quantitative PCR,FQ-PCR)技术,检测患儿化疗前后外周血和手术切除新鲜冻存组织,以及对照组外周血中MDR1、MRP1、LRP的mRNA表达量。结果所有化疗患儿外周血MDR1表达量与同期手术切除的肿瘤组织MDR1表达量存在正相关(r=0.894,P=0.000);化疗前后外周血MDR1表达量变化与肿瘤大小变化间存在负相关:神经母细胞瘤(r=-0.733,P=0.000),卵黄囊瘤(r=-0.874,P=0.000),淋巴瘤(r=-0.617,P=0.005);化疗前外周血MDR1表达量与首次化疗后相应肿瘤标志物变化大小呈负相关:神经母细胞瘤尿香草杏仁酸(VMA)(r=-0.440,P=0.046),卵黄囊瘤甲胎蛋白(AFP)(r=-0.831,P=0.000),淋巴瘤乳酸脱氢酶(LDH)(r=-0.495,P=0.031)。随着化疗次数的增加MDR1表达量增加(P0.05)。结论动态检测患儿化疗前后PBMCs中MDR1mRNA水平对化疗疗效及预后的判定有一定的指导意义,可在一定程度上指导化疗方案的修订。