牛γ-干扰素在大肠杆菌中的表达及抗原性鉴定

目的 在大肠杆菌中高效表达牛γ-干扰素(bovine interferon-γ,BovIFN-γ),并对其生物活性进行初步鉴定.方法 依据GenBank上基因序列人工合成BovIFN-γ基因,PCR方法扩增该基因,将其插入PET-28a载体构建原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21中,在IPTG诱导下表达BovIFN-γ,并进行Western blot鉴定.Ni-NTA亲和层析法和电洗脱方法纯化表达的重组蛋白,用Western blot和商品化的BovIFN-γ检测试剂盒进行重组蛋白的抗原性检测.结果 成功构建了BovIFN-γ原核表达载体PET-28a- BIFN-γ,并在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的32％,表达产物主要以可溶性形式存在于菌体裂解液上清中;重组蛋白可与BovIFN-γ单克隆抗体反应,Ni-NTA亲和层析法纯化的重组蛋白抗原活性比电洗脱方法纯化的抗原活性高.结论 在大肠杆菌中成功表达了可溶性的BovIFN-γ蛋白,可与BovIFN-γ单抗发生反应,纯化的重组蛋白具有良好的反应原性.     

大肠杆菌Mn-SOD基因的克隆及表达

目的：实现Mn-SOD基因在大肠杆菌（E.coli）中的可溶性表达,并对表达产物进行活性测定。方法：用PCR方法从大肠杆菌2号基因组中扩增Mn-SOD基因编码区,克隆到pUCm-T Vector,测定核苷酸序列;再将基因编码区克隆到原核表达载体PET-28a,构建含Mn-SOD基因的重组表达质粒,转化到大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达。结果：SDS-PAGE分析表明SOD的表达量约为细菌总蛋白的50%;黄嘌呤氧化酶法测定表达蛋白活性,菌体可溶性总蛋白中表达产物酶比活为3921.8 U/mg,是对照BL21的276.8倍。结论：Mn-SOD基因可在BL21中成功表达,产物具有高可溶性、高活性的特点。     

猪α干扰素基因的克隆、原核表达及生物学活性鉴定

目的 构建稳定、高效表达的重组猪α干扰紊(rpoIFN-α)大肠杆菌表达菌株,并纯化鉴定该菌株表达的目的 蛋白,进行生物学活性检测.方法 提取猪肝脏细胞基因组DNA,PCR扩增猪α干扰素(poIFN-α)基因,克隆到pMD18-T载体上,测序鉴定后再亚克隆到pGEX-5X-1载体上,转化入E.coli BL21中后得到表达菌株,用IPTG诱导表达,收集的菌体超声破碎后取上清得粗制蛋白,用GST亲和层析法进行纯化,产物用Western blot进行鉴定,并在Hep-2/VSV系统上滴定效价.结果 重组质粒pGEX-5X-1/polFN-α经过EcoR 1和Xho Ⅰ限制性酶切后可见501 bp的目的 片段,提取质粒测序鉴定,结果与GeneBank中的序列一致.转化入E. coli BL21中32℃条件下经IPTG诱导5 h,提取总蛋白,SDS-PAGE检测显示带有GST标记的rpoIFN-α能高效表达,分子量约45 ku,可溶性rpoIFN-α约占菌体蛋白的0.35,Western-blot鉴定显示有特异性条带.效价滴定结果表明该rpoIFN-α具有抗病毒活性,纯化后效价为7.5×106 IU/ml,比活性达到1.1×107IU/mg.结论 成功克隆了polFN-α基因,并可在大肠杆菌中高效表达具有抗病毒活性的rpoIFN-α.     

人TRAIL胞外区原核可溶性表达及活性鉴定

目的获得具有生物活性的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)胞外段蛋白。方法根据大肠杆菌密码子偏爱性要求,设计合成编码TRAIL胞外段的DNA序列,构建成pET30a-TRAIL胞内融合表达质粒,重组质粒转化表达宿主E.coli BL21。在不同温度、不同浓度的IPTG条件下诱导表达TRAIL,SDS-PAGE分析表达产物,MTT法检测产物活性。结果构建的工程菌株表达29KD的可溶性TRAIL融合蛋白,能诱导Jurkat细胞凋亡。结论成功表达了人TRAIL胞外段蛋白,为进一步研究提供基础。     

抗肝癌单链抗体与PE38融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达

目的：实现二硫键稳定的抗肝癌单链抗体与PE38融合，免疫毒索在大肠杆菌中的可溶性表达，为下游的活性检测等工作打下基础．方法：设计了两种不同的表达载体(GST、硫氧还蛋白促可溶表达载体)，并通过改变宿主菌菌株、IPTG诱导浓度、诱导温度及诱导时间等，优化表达条件；通过ELISA法判断该免疫毒素中单链抗体的结合活性．结果：抗肝癌单链抗体与PE38融合蛋白在大肠杆菌Origami(DE3)的上清中得到表达，表达量占菌体总可溶蛋白量的21％：ELISA法证实该融合蛋白保持了亲本抗体的特异性．结论：dsFv-PE38融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达为其他融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达提供了思路．     

IL-18在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

目的：研究人IL-18成熟蛋白（mhIL-18）在大肠杆菌中的高效的非包涵体表达以及纯化方案。方法：利用PCR方法扩增出mhIL-18基因，构建融合型表达载体pPTYB1-IL18，转化入大肠杆菌ER2566中，IPTG诱导表达，优化表达条件，超声裂解细胞，采用SDS-PMGE和Weslern blot分析重组蛋白的表达，亲和层析后用MTT法检测表达mhIL-18的活性。结果：成功构建载体并转化入ER2566后，经IPTG诱导，表达量可占菌体总蛋白的26％以上，其中80％以上的mhIL-18融合蛋白以可溶、有活性的形式存在。亲和层析后的mhIL-18纯度可达95％，具有显著的IL-18的生物学活性。结论：成功的在大肠杆菌中的高效以非包涵体表达mhIL-18，并具有显著的IL-18的生物学活性。     

人结核分支杆菌HSP70的原核表达质粒的构建及诱导表达

目的　构建编码人结核分支杆菌 (TB)热休克蛋白 70 (HSP70 )的Dnak基因的重组原核表达质粒 ,并研究其表达动力学。方法　质粒pMT70用限制性内切酶消化、核酸体外扩增 (PCR)及末端修饰后可获得Dnak基因全长 ,与大肠杆菌质粒 pRSET连接重组 ,阳性克隆经酶切分析鉴定后即为质粒 pMT70 3,转入受体菌BL2 1DE3中 ,经诱导剂异丙基硫代 - β -D-半乳糖 (IPTG)诱导 ,由SDS -PAGE、Western -blot鉴定 ,并以薄层扫描分析。结果　重组表达质粒 pMT70 3构建成功 ,可在大肠杆菌中高效表达 ,诱导后 1h即开始表达 ,16h达高峰期。表达量占菌体总蛋白的 6 5 % ,可溶性产物占总表达量的 90 %。结论　pMT70 3质粒不仅构建成功且更有利于对分支杆菌HSP70蛋白的纯化 ,方便对其抗结核、抗肿瘤的研究     

岸蟹金属硫蛋白在大肠杆菌BL21中的表达

目的：在大肠杆菌BL21中表达岸蟹金属硫蛋白基因，建立金属硫蛋白原核表达的流程。方法：将重组质粒pET-GST-R转化至大肠杆菌，经PCR扩增和酶切检测，得到含重组质粒pET-GST-R的工程菌。结果：从IPTG浓度、IPTG诱导时间、金属离子浓度等几个方面摸索诱导金属硫蛋白表达的条件，表达出分子量约为33kD的融合蛋白。结论：成功制备金属硫蛋白的工程菌菌株。金属硫蛋白对大肠杆菌细胞毒性很大，培养基需添加金属离子。     

人可溶性CD83基因的克隆、原核表达和纯化

目的:构建人可溶性CD83基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:利用反转录PCR方法从正常人外周血单个核细胞中获得可溶性CD83基因,克隆到表达载体pET-32a载体,构成重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定.表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化.结果:经酶切鉴定及测序证实可溶性CD83蛋白基因的原核表达载体构建正确.经SDS-PAGE及Western blot显示在M,约32 000处出现融合表达条带.融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的45%.重组蛋白经Ni-NTA亲和层析进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白.结论:成功克隆人外周血单个核细胞来源的可溶性CD83基因片段,并在大肠杆菌B121(DE3)中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度融合蛋白.     

耐辐射奇球菌超氧化物歧化酶基因的克隆和表达

目的 构建耐辐射奇球菌(D．rdiodurans)锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因的原核表达重组子,并在E．coli BL21(DE3)中表达。方法 用PCR方法自D.radiodurans基因组中扩增Mn-SOD目的片段。将该基因与原核表达质粒载体pET-30a( )连接,构建重组质粒pET-SOD,并转化表达宿主菌E．coli BL21(DE3)。用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组SOD蛋白表达,SDS-PAGE分析表达产物。结果 获得了D．radiodurans-Mn-SOD基因的pET原核表达重组质粒,该质粒经IPTG诱导能在E．coli BL21(DE3)中高效表达目的蛋白,蛋白活性可达51800u／g湿菌体。结论 成功构建了原核表达重组质粒pET-SOD,实现了SOD在原核细胞中的高效表达,表达产物活性较高,为重组D．radiodurans Mn-SOD的进一步研究和应用奠定了基础。