荔枝核总黄酮对大鼠肝星状细胞增殖的抑制作用

目的研究荔枝核总黄酮(TFL)对大鼠肝星状细胞的生长抑制作用及其分子机制。方法应用不同浓度(20、40、80、160 mg/L)TFL(药物组)对生长状态稳定的大鼠肝星状细胞株HSC-T6进行处理,并设置空白对照组。MTT法检测不同浓度TFL处理不同时间后,HSC-T6细胞增殖情况,并根据抑制率计算TFL的半数抑制质量浓度(IC50);吖啶橙染色观察经不同浓度TFL处理后HSC-T6细胞凋亡情况;流式细胞术检测不同浓度TFL处理后HSC-T6细胞周期的变化情况。结果 MTT结果显示,TFL对HSC-T6具有增殖抑制活性(P<0.05),其处理24、48、72 h的IC50分别为116.44、101.98、129.69μg/mL。吖啶橙染色显示,药物组细胞中出现核浓缩、核碎裂及致密浓染亮绿色凋亡小体。流式细胞仪检测结果显示,对照组细胞G1期细胞比例为(47.68±2.92)%,G2期为(19.58±2.93)%,S期为(32.75±2.09)%;药物组经TFL处理后,G1期细胞数量增加,而G2期细胞显著减少(P<0.05)。结论 TFL在体外能抑制大鼠肝星状细胞增殖,它通过阻滞细胞周期和诱导凋亡来抑制大鼠肝星状细胞的增殖。     

甘参复方对大鼠肝星状细胞增殖和胶原合成的影响

目的:观察甘参复方对大鼠肝星状细胞增殖和胶原合成的影响,并分析甘参复方抗肝纤维化的分子机制。方法:采用体外培养的永生化细胞株大鼠肝星状细胞(hepatic sellate cell-T6,HSC-T6)。将甘参复方稀释成6个不同的浓度梯度,采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况,筛选出甘参复方对HSC-T6的有效作用浓度。之后将细胞分为阴性对照组,甘参复方低浓度组、中浓度组、高浓度组。采用ELISA法检测各组细胞上清液中的Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ,ColⅠ)水平。然后,应用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)(1 mg·L~(-1))刺激HSC-T6,观察甘参复方对刺激后细胞的增殖和胶原合成的影响。结果:甘参复方的6个不同浓度对HSC-T6的增殖有明显抑制作用,且浓度为0.5μmol·L~(-1)时抑制作用最明显(P0.01)。ELISA结果显示,甘参复方能够降低细胞上清中的ColⅠ含量,且与CCK-8结果相吻合,在0.5μmol·L~(-1)时ColⅠ分泌最少。甘参复方能够抑制TGF-β1刺激后的HSC-T6增殖和胶原合成。结论:甘参复方能够显著抑制星状细胞的增殖以及ColⅠ的表达,这是甘参复方抗肝纤维化的作用机制之一。     

荔枝核总黄酮预防大鼠肝纤维化的初步研究

目的观察荔枝核总黄酮(total flavone from Litchi chinensis Sonn,TFL)预防大鼠肝纤维化作用及活化肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)凋亡的变化,从细胞凋亡角度研究二者之间的关系。方法以二甲基亚硝胺腹腔注射制作大鼠肝纤维化模型,同时以秋水仙碱为阳性对照,TFL[100、200 mg/(kg.d)]灌胃给药,6周后处死大鼠,放射免疫法(RIA)检测大鼠血清中透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)蛋白水平,取肝脏同一部位行HE、Masson染色观察大鼠肝纤维化程度,采用α-SMA及TUNEL免疫组化双重染色标记活化HSC凋亡。结果 TFL高剂量组和秋水仙碱组血清肝纤维化指标(HA、LN、PCⅢ)均明显低于模型组(P<0.05)。与模型组比较,TFL高剂量组可明显增加活化的HSC凋亡指数,改善大鼠肝纤维化程度(P<0.05)。结论荔枝核总黄酮可抑制肝纤维化大鼠HA、LN、PCⅢ表达,诱导HSC凋亡并改善二甲基亚硝胺所致肝纤维化程度,且具有一定量效关系。     

荔枝核总黄酮对活化大鼠肝星状细胞的增殖抑制作用及TLR4表达的影响

目的：研究荔枝核总黄酮( TFL)在体外对活化的大鼠肝星状细胞( HSC-T6)的增殖抑制作用及 Toll 样受体4(TLR4)表达的影响。方法使用转化生长因子β1(TGF-β1)(5 ng/ml)激活HSC-T6,显微镜下观察HSC-T6和激活的HSC-T6形态变化;CCK8试剂盒( CCK8)法观察 TFL 作用24、48、72 h后活化的HSC-T6的增殖情况;逆转录聚合酶链反应( RT-PCR)检测HSC-T6中TLR4的表达;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。结果显微镜下观察HSC-T6和激活的HSC-T6形态有明显变化;CCK8结果显示TFL可以抑制HSC-T6的增殖( P<0．05),并且随着TFL浓度和作用时间增加,HSC-T6增殖明显下降,呈浓度依赖性;RT-PCR结果显示随着TFL浓度增加,HSC-T6中TLR4表达下降,与实验对照组比较差异有统计学意义( P<0．05);流式细胞仪检测结果表明TFL阻滞细胞于S期,G0/G1期细胞减少( P<0．05),S期细胞增加(P <0．05),促进细胞的凋亡(P <0．05),呈浓度依赖性。结论 TFL可以抑制 HSC-T6的增殖,其作用机制可能是通过降低TLR4在HSC-T6中的表达,阻滞其细胞增殖和诱导细胞凋亡,达到抗肝纤维化效果。     

磷脂酰肌醇3(PI3K)激酶信号途径对血小板源生长因子促肝星状细胞增殖与I型胶原表达的影响

目的观察磷脂酰肌醇3激酶特异性抑制剂(LY294002),对血小板源生长因子(PDGF-BB)促大鼠肝星状细胞(HSC)增殖与Ⅰ型胶原表达的影响,并探讨其作用机制。方法用不同浓度的PDGF-BB和LY294002对大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)进行处理,MTT法检测细胞的增殖,逆转录聚合酶链反应方法(RT-PCR)检测HSC-T6内I型胶原mRNA的表达。结果PDGF-BB在浓度1~10 ng/ml时呈剂量依赖性地促进HSC细胞增殖(P<0.05),当浓度大于10 ng/ml时处理组间无显著差异(P>0.05),其促增殖作用达到饱和。5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L的LY294002均能显著且剂量依赖性地抑制PDGF-BB刺激的HSC-T6增殖(P<0.001)。PDGF-BB能促进HSCⅠ型胶原mRNA表达,24 h、48 h时相对于对照组的表达量为112.2%,182.5%。LY294002能显著抑制PDGF-BB促Ⅰ型胶原表达,24 h4、8 h时相对表达量为76.4%,52.6%。结论磷脂酰肌醇3激酶信号途径是调节血小板源生长因子促肝星状细胞增殖与分泌胶原的重要通道,抑制该通路可以抑制肝星状细胞增殖和胶原表达,具有抗肝纤维化的作用,对防治肝纤维化有一定的意义。     

曲美他嗪对缺氧/复氧心肌细胞焦亡的影响

目的探讨曲美他嗪(TMZ)对急性缺氧/复氧(H/R)心肌细胞焦亡的影响。方法选择大鼠胚胎H9C2心肌细胞为研究对象,将细胞分为正常对照组、H/R组、H/R+50μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+100μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+500μmol·L~(-1)TMZ组。H/R组、H/R+50μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+100μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+500μmol·L~(-1)TMZ组细胞行缺氧12 h/复氧4 h处理模拟大鼠心肌缺血再灌注损伤; H/R+50μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+100μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+500μmol·L~(-1)TMZ组细胞在构建H/R模型前分别给予50、100、500μmol·L~(-1)TMZ共孵育1 h;正常对照组细胞常规培养;采用细胞计数试剂盒(CCK8)检测各组心肌细胞活性,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测各组心肌细胞培养基中LDH活性,采用实时荧光定量聚合酶链反应法和Western blot法检测心肌细胞中Caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和Nod样受体蛋白3(NLRP3) mRNA及蛋白表达水平的变化。结果与正常对照组比较,H/R组心肌细胞活性降低,LDH活性显著升高,细胞中Caspase-1、NLRP3、ASC mRNA和蛋白表达水平升高(P <0. 05);与H/R组比较,H/R+50μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+100μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+500μmol·L~(-1)TMZ组细胞活性显著增加,LDH活性显著下降,细胞中Caspase-1、NLRP3、ASC mRNA和蛋白表达水平降低(P <0. 05);与H/R+50μmol·L~(-1)TMZ组和H/R+500μmol·L~(-1)TMZ组比较,H/R+100μmol·L~(-1)TMZ组细胞活性增加,LDH活性下降,细胞中Caspase-1、NLRP3、ASC mRNA和蛋白表达水平降低(P <0. 05); H/R+50μmol·L~(-1)TMZ组细胞活性、LDH活性、细胞中Caspase-1、NLRP3、ASC mRNA和蛋白表达水平与H/R+500μmol·L~(-1)TMZ组比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论 TMZ能通过抑制细胞焦亡对H/R的心肌细胞起保护作用; TMZ处理心肌细胞的最适浓度为100μmol·L~(-1)。     

姜黄素对大鼠肝星状细胞中TGF-β调节的NADPH氧化酶4的激活及Smad信号通路的影响

目的：研究姜黄素潜在的抗纤维化作用,以及转化生长因子β( TGF-β)诱导大鼠肝星状细胞( HSC-T6)激活的机制。方法不同浓度的姜黄素(0、5、10、20、40μmol/L)处理HSC-T6后,用MTT法测定其对HSC-T6增殖作用的影响;用RT-PCR法检测其mRNA水平的表达;用Westem blot法检测表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、细胞外基质主要成分α1I胶原(Col1α1)、NADPH氧化酶4(NOX 4)、 Smad 2、Smad 3及其磷酸化的水平。结果40μmol/L的姜黄素组刺激HSC-T648 h后,其抑制率达到最大,显著低于仅TGF-β1刺激组、5、10及20μmol/L姜黄素组( P<0．05)。姜黄素可显著降低激活型HSC-T6的α-SMA、α1I胶原mRNA与蛋白表达,从而可以降低细胞外基质的沉积;有效降低了NOX 4的蛋白水平,减少了活性氧的水平;还明显降低Smad 2、Smad 3的磷酸化程度,呈浓度依赖性。结论姜黄素在体外能够明显地抑制HSC-T6激活,对肝纤维化的发生发展具有一定抑制作用,其机制可能与抑制TGF-β诱导的NOX4的激活及Smad信号通路有关。     

硫化氢对氧应激下大鼠肝星状细胞的收缩和黏附作用

目的 探讨硫化氢(H2S)含量的变化对氧应激下大鼠肝星状细胞(HSC)收缩和黏附作用影响.方法 将HSC分为空白组(B组,HSC-T6);对照组(C组,HSC-T6+ 500μ mol/L FeN-TA);NaHS组(N组,N1:HSC-T6+500μmol/L FeNTA+100μmol/L NaHS;N2:HSC-T6+500μmol/L FeNTA+200μmol/L NaHS;N3:HSC-T6 +500μmol/L FeNTA+ 300μ mol/LNaHS;N4:HSC-T6 500μmol/L FeNTA+ 400μmol/LNaHS);GLBN组(G组,G1:HSC-T6+ 500μmol/L FeNTA+ 200 μmol/LGLBN;G2:HSC-T6+ 500μmol/L FeNTA+ 400μmol/LGLBN).应用500 μmol/L次氮基三乙酸铁(FeNTA)制备氧应激模型.采用聚硅酮膜法直观检测氧应激模型大鼠肝星状细胞收缩情况、甲苯胺兰染色法测定细胞黏附率、Boyden Chamber小室法测定HSC跨膜迁移数量.给予不同浓度的外源性H2S供体NaHS和KATP通道阻断剂格列本脲(GLBN),在不同刺激条件下,观察上述指标.结果 HSC被NaHS处理后可见聚硅酮膜由于细胞收缩而引起明显皱纹,能够明显促进HSC收缩,而且随H2S浓度的升高和作用时间的延长,HSC收缩程度增强,这些作用能够被格列本脲阻止.加入200、400 μmol/L H2S的HSC黏附抑制率分别为62.4％、81.7％,与对照组相比有显著差异;100、200、300、400 μmol/L 4种不同浓度NaHS的HSC细胞迁移数量为6.43×103、8.85×103、11.34×103、14.86×103,与对照组(2.52×103)比较存在显著差异.结论 H2S在氧化应激下能促进HSC的收缩.H2S通过抑制细胞黏附、增加HSC跨膜迁移数量发挥细胞保护作用.     

过氧化物酶增生物激活受体γ激动剂对肝星状细胞α1(I)胶原表达的影响

目的观察过氧化物酶增生物激活受体γ(PPARγ)激动剂15d-PGJ2对肝星状细胞株(HSC-T6)前胶原α1(Ⅰ)表达的影响,以进一步探讨PPARγ在肝纤维化进程中的作用机制。方法体外培养HSC-T6细胞,取对数生长期的细胞分为空白对照组、TGFβ-对照组和15d-PGJ2处理组,TGF-β对照组和15d-PGJ2处理组均给予TGF-β因子(终浓度3 ng/ml)共孵育6 h,15d-PGJ2处理组再用1、2、3μmol/L的PPARγ激动剂15d-PGJ2作用24 h。应用RT-PCR、Westernblot方法观察分析各组间肝星状细胞PPARγ、前胶原α1(Ⅰ)基因表达的变化。结果15d-PGJ2能够显著上调PPARγmRNA和蛋白的表达水平,15d-PGJ2处理组的相对吸光度值较空白对照明显升高(P<0.05),而TGFβ-对照组与空白对照组差异无显著性意义(P>0.05)。在TGFβ-刺激下,TGF-β对照组前胶原α1(Ⅰ)mRNA水平均升高,同空白对照组相比差异有显著性意义(P<0.05);15d-PGJ2处理组细胞前胶原α1(Ⅰ)mRNA水平与空白对照组相比差异无显著性意义(P>0.05),但与TGFβ-对照组相比,其表达明显受抑制(P<0.05)。结论PPARγ激动剂15d-PGJ2能够通过上调PPARγ表达而抑制前胶原α1(Ⅰ)转录,提示PPARγ可抑制肝纤维化的发生发展。     

生长抑素对瘦素诱导肝星状细胞的活化增殖、PTP1 B表达及JAK2-STAT3通路的影响

目的研究生长抑素对瘦素诱导大鼠肝星状细胞(HSC)的活化增殖、蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)表达及JAK2-STAT3通路的影响,探讨生长抑素抗肝纤维化的相关机制。方法以重组大鼠瘦素作用于HSC-T6细胞(100 ng/ml),同时加入各浓度的生长抑素(10-6、10-7、10-8、10-9、10-10 mol/L)。在处理24 h后,采用CCK-8法检测HSC增殖的变化,免疫细胞化学检测 p-JAK2及 p-STAT3蛋白表达, RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和 PTP1B 的mRNA表达。结果 CCK-8法显示生长抑素可通过剂量依赖方式抑制瘦素诱导的HSC-T6细胞增殖( P<0.05);免疫细胞化学检测显示,生长抑素组HSC-T6细胞质p-JAK2及细胞核内 p-STAT3蛋白表达明显低于瘦素对照组( P <0.05);RT-PCR法检测生长抑素干预组 HSC α-SMA mRNA的表达较瘦素对照组及空白对照组明显降低(P<0.05),而PTP1B的mRNA表达量升高(P<0.05)。结论生长抑素能上调PTP1B的表达,阻断瘦素在HSC内 JAK2-STAT3信号通路的转导,并且抑制瘦素诱导HSC的活化与增殖。     

老鹰茶总黄酮中山奈酚-葡萄糖苷对TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖的影响及机制

目的 观察老鹰茶总黄酮中山奈酚-葡萄糖苷对TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖的影响及机制.方法 选用SD大鼠,分离出大鼠肝星状细胞(HSC)进行培养;MTT法检测4种黄酮类单体对HSC增殖的抑制作用;RT-PCR方法 检测分析其对HSC的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Smad2、Smad3及Smad7受体中mRNA的表达的影响.结果 4种黄酮类单体中山奈酚-葡萄糖苷能够较强的抑制HSC增殖;能够明显下调HSC的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Smad2及Smad3中mR-NA的表达,上调Smad7 mRNA的表达.结论 老鹰茶总黄酮中山奈酚-葡萄糖苷相比于其它几种单体较明显抑制HSC的增殖作用,对TGF-β/Smad通路的影响可能是其抗肝纤维化的作用机制之一.     

二氢杨梅素通过TGF-β1/Smad信号通路抑制肝星状细胞活化的作用研究

目的 观察二氢杨梅素(dihydromyricetin,DHM)对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)活化的影响,并探讨TGF-β1/Smad信号通路在其中的作用及机制.方法 以大鼠肝星状细胞株HSC-T6为研究对象,TGF-β1(5 ng/mL)处理2h后,再以不同浓度的DHM处理24h.CCK-8法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,ELISA法检测细胞分泌MMP-1、TIMP-1和COL-Ⅰ的水平,免疫荧光细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,qRT-PCR法检测MMP-1、TIMP-1和COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的mRNA表达,Western blot检测Smad2/3、p-Smad2/3、Smad7、AMPK、p-AMPK蛋白表达.结果 CCK-8法检测结果显示,40 μmol/L以上DHM单独处理能明显抑制HSC-T6细胞增殖活力,并能显著抑制活化的HSC-T6细胞增殖活力的增加,流式细胞仪检测结果表明,DHM能够明显促进活化的HSC-T6细胞凋亡,TGF-β1能够促进HSC-T6细胞G0/G1期的比例降低、S期和G2/M期的比例增加(P＜0.05),而DHM能够抑制TGF-β1对细胞周期的影响,ELISA检测结果表明,DHM能够显著抑制活化的HSC-T6细胞上清液中TIMP-1和COL-Ⅰ水平增高及MMP-1水平下降(P＜0.05),免疫荧光细胞化学法检测显示,HSC-T6细胞表达HSC活化特定抗原α-SMA,TGF-β1处理后表达增加,而DHM能够抑制α-SMA表达,qRT-PCR结果显示,DHM能够显著影响活化的HSC-T6细胞的细胞外基质相关基因MMP-1、TIMP-1和COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7等的mRNA表达,Western blot检测结果提示,DHM抑制活化的HSC-T6细胞AMPK磷酸化下降、Smad2/3的磷酸化水平升高及Smad7的蛋白表达下降,而AMPK抑制剂Compound C处理后,DHM的作用被显著抑制.结论 DHM能够显著抑制HSC-T6细胞的活化,该作用可能通过促进AMPK的磷酸化并抑制TGF-β1/Smad信号通路介导的细胞外基质产生而实现.     

蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞增殖的影响

目的研究蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖及转化生长因子β1(TGFβ1)表达的影响。方法传代培养的HSC-T6与蕲艾提取液药物血清共同培养24h后,采用MTT法检测其对HSC增殖的影响,Elisa法检测TGFβ1蛋白表达情况。结果不同浓度蕲艾提取液药物血清(5%、10%、20%)与空白对照组及生理盐水血清组比较,能显著抑制HSC-T6增殖(P0.01)及TGFβ1蛋白的表达(P0.01)。结论蕲艾提取液药物血清可显著抑制HSC-T6增殖。     

筋骨草总黄酮对大鼠肝星状细胞MMP-13和TIMP-1表达的影响

目的观察筋骨草总黄酮对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖、MMP-13、TIMP-1表达的影响。方法用筋骨草总黄酮含药血清对HSC细胞进行干预,分为空白对照组、5%、10%、20%3个含药血清组,用MTT检测HSC细胞增殖,ELISA检测Ⅰ型胶原浓度,RT-PCR检测MMP-13、TIMP-1 mRNA的表达。结果与空白对照组比较,含药血清3个剂量组对HSC细胞的抑制作用增强,I型胶原浓度降低,促进MMP-13、抑制TIMP-1 mRNA表达,随着药物浓度增加,MMP-13/TIMP-1比值增大,与I型胶原呈负相关。结论筋骨草总黄酮抗肝纤维化的机制是抑制HSC增殖,促进MMP-13、抑制TIMP-1mRNA表达,促进Ⅰ型胶原降解,抑制细胞外基质积聚。     

丹参酮ⅡA对血管紧张素II诱导的大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smads通路的影响

目的:研究丹参酮ⅡA对体外培养的血管紧张素Ⅱ诱导的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)转化生长因子β1(TGF-β1)/Smads通路中TGF-β1、Smad2、Smad4的mRNA和蛋白表达的作用,探讨丹参酮ⅡA治疗肝纤维化的机理。方法:对大鼠肝星状细胞分别使用血管紧张素Ⅱ(1×10-5mol/L)及血管紧张素Ⅱ(1×10-5mol/L)联合丹参酮ⅡA(25μg/ml)干预48h,分别用real-time PCR及western blot方法检测各组细胞TGF-β1、Smad2、Smad4的mRNA及蛋白表达。结果:血管紧张素Ⅱ上调肝星状细胞TGF-β1、Smad2、Smad4的mRNA及蛋白表达(P0.01),而丹参酮ⅡA对血管紧张素Ⅱ在肝星状细胞中的这种诱导作用具有明显的抑制(P0.01)。结论:丹参酮ⅡA抗肝纤维化的机制之一可能是通过对肝星状细胞TGF-β1/Smads通路的调控实现的。     

Smad7抑制肝星状细胞胶原蛋白表达

目的 探讨Smad7对TGF-β1刺激肝星状细胞系HSC-T6细胞的I型胶原蛋(Co1l I)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响.方法 以pTRE-Smad7-M2-flag和pTet-on共转染HSC-T6细胞,筛选出稳定表达标记蛋白(M2-flag)的细胞克隆,确定强力霉素诱导Smad7表达的最佳使用剂量.分组比较Smad7对TGF-131刺激的Col I和α-SMA蛋白表达的影响,以及Smad7对Smad2/3磷酸化的调节作用.结果 强力霉素诱导Smad7表达的最佳使用剂量为2 mg/L,强力霉素诱导过表达的Smad7可抑制TGF-β1刺激HSC-T6细胞的Col I和α-SMA蛋白的表达.与单纯使用TGF-β1刺激HSC-T6细胞组比较,Smad7表达可下调HSC-T6细胞的Smad2/3的磷酸化水平.结论 过表达的Smad7可下调TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的Smad2/3磷酸化,抑制TGF-β1刺激HSC-T6细胞的Col I和α-SMA蛋白的表达,达到抑制肝纤维化的形成.

Abstract：

Objective To investigate the effect of Smad7 on the expressions of collagen I and α-smooth muscle actin (α-SMA) in HSC-T6 cell line activated by transforming growth factor-pi (TGF-pi). Methods HSC-T6 cells stably expressing M2-flag protein were selected after co-infection of the cells with pTRE-Smad7-M2-flag and pTet-on. The optimal dose of doxycycline for inducing Smad7 was determined, and the effects of Smad7 over-expression on the expressions of collagen I and a-SMA in the cells activated by TGF-β1 and on Smad2/3 phosphorylation were evaluated using Western blotting. Results The optimal dose of doxycycline for inducing Srnad7 expression was 2 mg/L. Smad7 over-expression induced by doxycycline decreased the expressions of collagen I and α-SMA in HSC-T6 cells activated by TGF-β1, and down-regulated the level of Smad2/3 phosphorylation. Conclusion Smad7 over-expression inhibits Smad2/3 phosphorylation, and decreases the expression of collagen I and α-SMA in HSC-T6 cells induced by TGF-β1 to inhibit the progression of liver fibrosis.     

吉非替尼联合奥沙利铂对人肝癌细胞SMMC-7721增殖和凋亡的影响

目的观察吉非替尼联合奥沙利铂对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞增殖及凋亡的影响。方法取对数生长期SMMC-7721细胞随机分为对照组、吉非替尼组、10 mg·L~(-1)奥沙利铂组、20 mg·L~(-1)奥沙利铂组、40 mg·L~(-1)奥沙利铂组、吉非替尼+10 mg·L~(-1)奥沙利铂组、吉非替尼+20 mg·L~(-1)奥沙利铂组及吉非替尼+40 mg·L~(-1)奥沙利铂组共8组,依次加二甲基亚砜、2×10-6mol·L~(-1)吉非替尼、10 mg·L~(-1)奥沙利铂、20 mg·L~(-1)奥沙利铂、40 mg·L~(-1)奥沙利铂、2×10-6mol·L~(-1)吉非替尼和10 mg·L~(-1)奥沙利铂、2×10-6mol·L~(-1)吉非替尼和20 mg·L~(-1)奥沙利铂、2×10-6mol·L~(-1)吉非替尼和40 mg·L~(-1)奥沙利铂各100μL,每组设5个复孔。采用四甲基偶氮唑盐比色法测各组细胞给药后24、48、72 h的细胞生长抑制率。另取对数生长期SMMC-7721细胞分为对照组、吉非替尼组、20 mg·L~(-1)奥沙利铂组、吉非替尼+20 mg·L~(-1)奥沙利铂组。吉非替尼组细胞加入2×10-6mol·L~(-1)吉非替尼100μL,奥沙利铂组细胞加入20 mg·L~(-1)奥沙利铂100μL,吉非替尼+20 mg·L~(-1)奥沙利铂组细胞加入2×10-6mol·L~(-1)吉非替尼100μL和20 mg·L~(-1)奥沙利铂100μL,对照组细胞加入等体积培养液。采用流式细胞术检测4组细胞给药后48 h的细胞周期和细胞凋亡率。结果吉非替尼组和10 mg·L~(-1)奥沙利铂组在24 h时细胞抑制率与对照组比较差异无统计学意义(P>0. 05);其余各组在各时间点细胞抑制率均高于对照组(P <0. 05)。3个联合组各时间点细胞抑制率均高于吉非替尼组(P <0. 05),吉非替尼+10 mg·L~(-1)奥沙利铂组各时间点细胞抑制率均高于10 mg·L~(-1)奥沙利铂组(P <0. 05),吉非替尼+20 mg·L~(-1)奥沙利铂组各时间点细胞抑制率高于吉非替尼组和20 mg·L~(-1)奥沙利铂组(P <0. 05),吉非替尼+40 mg·L~(-1)奥沙利铂组各时间点细胞抑制率高于吉非替尼组和40 mg·L~(-1)奥沙利铂组(P <0. 05)。吉非替尼+10 mg·L~(-1)奥沙利铂组、吉非替尼+20 mg·L~(-1)奥沙利铂组和吉非替尼+40 mg·L~(-1)奥沙利铂组各时间点细胞抑制率成逐渐增高趋势,3组之间细胞抑制率两两比较差异均有统计学意义(P <0. 05)。24 h时,吉非替尼+10 mg·L~(-1)奥沙利铂组与40 mg·L~(-1)奥沙利铂组细胞抑制率比较差异无统计学意义(P> 0. 05); 48、72 h时,吉非替尼+10 mg·L~(-1)奥沙利铂组细胞抑制率高于40 mg·L~(-1)奥沙利铂组(P <0.05);吉非替尼+10 mg·L~(-1)奥沙利铂组在各时间点细胞抑制率均高于20 mg·L~(-1)奥沙利铂组(P <0. 05)。吉非替尼+20 mg·L~(-1)奥沙利铂组在各时间点细胞抑制率均高于40 mg·L~(-1)奥沙利铂组(P <0. 05)。吉非替尼组、10、20、40 mg·L~(-1)奥沙利铂组细胞抑制率组内各时间点比较差异无统计学意义(P>0. 05)。吉非替尼+10 mg·L~(-1)奥沙利铂组和吉非替尼+40 mg·L~(-1)奥沙利铂组48、72 h时细胞抑制率均高于24 h(P <0. 05); 2组在48 h和72 h时细胞抑制率比较差异均无统计学意义(P>0. 05)。吉非替尼+20 mg·L~(-1)奥沙利铂组随作用时间增加细胞抑制率逐渐增加,各时间点两两比较差异均有统计学意义(P <0. 05)。吉非替尼组、20 mg·L~(-1)奥沙利铂组和吉非替尼+20 mg·L~(-1)奥沙利铂组细胞的细胞周期分布与对照组比较差异有统计学意义(P <0. 05)。20 mg·L~(-1)奥沙利铂组和吉非替尼+20 mg·L~(-1)奥沙利铂组处于G0/G1期细胞比例低于吉非替尼组(P <0. 05),处于S期细胞比例高于吉非替尼组(P <0. 05);吉非替尼组和20 mg·L~(-1)奥沙利铂组处于G2/M期细胞的比例比较差异无统计学意义(P> 0. 05);吉非替尼+20 mg·L~(-1)奥沙利铂组处于G2/M期细胞的比例高于吉非替尼组和20 mg·L~(-1)奥沙利铂组(P <0. 05)。吉非替尼组、20 mg·L~(-1)奥沙利铂组和吉非替尼+20 mg·L~(-1)奥沙利铂组细胞凋亡率均高于对照组(P <0. 05);吉非替尼组、20 mg·L~(-1)奥沙利铂组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P> 0. 05);吉非替尼+20 mg·L~(-1)奥沙利铂组细胞凋亡率高于吉非替尼组、20 mg·L~(-1)奥沙利铂组(P <0. 05)。结论吉非替尼和奥沙利铂均可抑制肝癌细胞株SMMC-7721的生长和诱导细胞凋亡,吉非替尼联合奥沙利铂后细胞抑制作用明显增强,二者有协同作用。     

糜酶抑制剂在体外对肝星状细胞增殖及肝纤维化相关基因表达的影响

[目的]探讨糜酶抑制剂(Chy-I)在体外对肝星状细胞(HSC)增殖及肝纤维化相关基因表达的影响及作用机制.[方法]取HSC-T6细胞,分为对照组(DMEM)、模型组(TGF-β1)和Chy-I大、中、小剂量(TGF-β1+100 g/L Chy-I,TGF-β1+10 g/L Chy-I,TGF-β1+1 g/L Chy-I)组,检测Chy-I对HSC-T6细胞的增殖抑制率,采用Western blot法检测纤维化相关因子α-SMA及TGF-β1蛋白表达水平,应用实时定量PCR法检测α-SMA及I型胶原mRNA的表达情况.[结果]与模型组比较,Chy-I各剂量组HSC-T6细胞增殖明显受到抑制(P<0.05,P<0.01),且呈剂量依赖性;Western blot法检测结果显示,与模型组比较,Chy-I各剂量组HSC-T6细胞中α-SMA及TGF-β1蛋白表达明显受到抑制,亦呈剂量依赖性,Chy-I各组HSC-T6细胞内α-SMA及I型胶原mRNA表达水平明显降低.[结论] Chy-I在体外对HSC发挥抗肝纤维化作用,其机制认为可能与抑制HSC增殖水平及肝纤维化相关因子的表达有关系.     

Ku70乙酰化在硒诱导人肺腺癌A549细胞凋亡中的作用

目的探讨Ku70乙酰化在硒诱导人肺腺癌A549细胞凋亡中的作用。方法将体外培养的人肺腺癌A549细胞分为对照组(用含体积分数10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基培养)和1、5、10μmol·L~(-1)硒处理组(分别用含1、5、10μmol·L~(-1)硒的达尔伯克改良伊格尔培养基培养),分别培养24、48 h,通过Western blot法检测Ku70表达,免疫沉淀法检测乙酰化Ku70和Ku70-Bax、Bax-Ku70的表达。将Ku70 siRNA转染后的人肺腺癌A549细胞分为对照组和1、5、10μmol·L~(-1)硒处理组,通过Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。结果与同一时间点对照组比较,1μmol·L~(-1)硒处理组Ku70、Bax、Bcl-2、乙酰化Ku70、Ku70-Bax和Bax-Ku70表达差异无统计学意义(P>0.05);与同一时间点对照组、1μmol·L~(-1)硒处理组比较,5、10μmol·L~(-1)硒处理组Ku70、Bcl-2、Ku70-Bax和Bax-Ku70表达均减少(P<0.01),Bax、乙酰化Ku70表达均增加(P<0.01);与同一时间点5μmol·L~(-1)硒处理组比较,10μmol·L~(-1)硒处理组Ku70、Bcl-2、Ku70-Bax和Bax-Ku70表达均减少(P<0.01),Bax、乙酰化Ku70表达均增加(P<0.01)。与本组24 h时比较,48 h时1μmol·L~(-1)硒处理组Ku70、Bax、Bcl-2、乙酰化Ku70、Ku70-Bax和Bax-Ku70表达差异无统计学意义(P>0.05);与本组24 h时比较,48 h时5、10μmol·L~(-1)硒处理组Ku70、Bcl-2、Ku70-Bax和Bax-Ku70表达减少(P<0.05),Bax、乙酰化Ku70表达增加(P<0.05)。结论硒通过促使Ku70乙酰化诱导Bax依赖性人肺腺癌A549细胞凋亡。     

肝纤维化中丹参素对TGFβ1/Smads/ERK信号通路的影响及其相互关系

目的探讨肝纤维化过程中转化生长因子β1(transforming growth factorβ,TGFβ1)/Smads/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路的相互作用。方法体外分离培养大鼠肝星状细胞(hepatic stellatecell,HSC),MTT法筛选丹参素最适浓度;以最适浓度丹参素及ERK阻断剂(PD98059)作用于经TGFβ1处理的HSC,CCK-8法检测各组HSC增殖;免疫细胞化学染色法检测各组HSC内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle sctin,α-SMA)及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达;RT-PCR检测各组HSC的Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达量;Western blot法检测各组Smad2/3、ERK1/2蛋白磷酸化及Smad7蛋白水平。结果 0.062 5～0.25 mmol/L的丹参素可有效抑制HSC增殖,作为最适处理浓度;PD98059(100μmol/L)可抑制TGFβ1诱导的HSC增殖,丹参素剂量依赖性抑制TGFβ1诱导的HSC增殖(P<0.01);TGFβ1促进细胞内α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达,PD98059及丹参素降低TGFβ1诱导的α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原水平;PD98059可拮抗TGFβ1诱导的Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的表达(P<0.05,P<0.01),丹参素下调Smad2、Smad3 mRNA水平,但上调Smad7 mRNA水平(P<0.01);PD98059及丹参素抑制TGFβ1诱导的Smad2/3、ERK1/2蛋白磷酸化(P<0.01),但对TGFβ1诱导的Smad7蛋白表达上调有不同效应(P<0.01)。结论 TGFβ1上调Smad2、Smad3 mRNA表达及蛋白磷酸化,进而诱导HSC增殖、活化及胶原合成,ERK通路可能参与HSC中TGFβ1诱导Smad基因表达及蛋白磷酸化过程。丹参素对TGFβ1/Smad/ERK信号通路具有抑制效应。