肝细胞生长因子(HGF)诱导肝癌Huh7细胞发生上皮间质转化(EMT)后细胞膜表面糖蛋白糖谱的变化

 目的  应用凝集素芯片技术寻找肝癌细胞表面转移相关的特征性糖谱。方法  应用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)诱导建立肝癌上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)细胞模型。通过凝集素芯片比较诱导前后细胞膜的糖谱改变,采用凝集素印迹和荧光细胞凝集素免疫组化方法验证芯片结果。结果  诱导后细胞对凝集素ACL、BPL、JAC、MPL、PHA E、SBA和SNA的亲和作用减弱,而对凝集素AAL、ConA、DBA、GSL Ⅱ、ECL、HAL、LCA、LTL、NML、NPL、PHA L、PTL Ⅱ和WFL的亲和作用增强。提示诱导后肝癌细胞表面出现了黏蛋白T/Tn抗原、平分型N-乙酰葡萄糖胺、α 2,6唾液酸和末端α或β连接的N-乙酰半乳糖胺结构减少;而末端和核心岩藻糖、高甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺β 1,6分支和复杂型寡糖分支结构增多。结论  肝癌细胞发生EMT过程中细胞膜表面糖链结构改变,提示糖链结构与肝癌的转移密切相关,为有效控制肝癌转移、改善预后提供了新思路。     

应用凝集素芯片检测胃癌细胞膜表面糖链表达

目的:应用凝集素芯片检测胃癌细胞株AGS和SGC-7901细胞膜表面糖链表达,并分析差异糖链与胃癌侵袭转移的相关性。方法:用胰酶消化收集细胞,加入荧光标记试剂对细胞进行荧光标记,利用凝集素芯片上的凝集素位点对糖链的亲和特异性捕获荧光标记的细胞,激光共聚焦扫描仪检测,凝集素流式细胞术验证,进而通过Transwell和划痕修复实验比较细胞侵袭转移能力。结果:在大多数凝集素位点上,AGS和SGC-7901这两种细胞荧光信号未出现明显差异。与SGC-7901细胞相比,AGS细胞显示出较强的LEL和MALⅡ信号。甘露糖、唾液酸、乙酰葡萄糖/葡萄糖、乙酰半乳糖/半乳糖在两种细胞中均有表达。AGS细胞含有较多的多聚乳糖胺和α2-3唾液酸,且AGS细胞侵袭转移能力要强于SGC-7901细胞。结论:高侵袭转移潜能的胃癌细胞表达特征性的多聚乳糖胺和α2-3唾液酸。基于凝集素芯片进行细胞膜糖图谱检测,将有助于筛选出肿瘤相关的糖链标志物和肿瘤诊断治疗。     

蓖麻凝集素的纯化及其对肺癌血清末端Galβ1-4GlcNAc糖链的测定

作者应用生物化学方法从中药蓖麻籽中分离纯化蓖麻凝集素,经SDS-PAGE和血球凝集试验鉴定纯度及活性后,用亲和层析法获得的蓖凝集素识别的糖蛋白.用蓖麻凝集素和辣根过氧化物酶标记的糖蛋白建立了一种血清末端Galβ1-4GlcNAc糖链分子ELISA检测方法.对肺癌.良性肺部疾病患者和正常人血清检测结果证实:肺癌患者血清中蓖麻凝集素识别的末端Galβ1-4GlcAc糖链分子表达明显增加.以正常人组血清检测平均值加2个标准差之和(11-5×2=21U ml)作为判断肿瘤的阳性阀值.肺癌阳性率为60.6％(20/33);良性肺部疾病21.4％(6,28);正常人仅为4.0％(1 25).它的检测和分析对肺癌标志物的寻找及其发病机理的探讨具有一定意义.     

小肝癌与不典型增生结节的差异糖蛋白筛选及其聚糖结构鉴定

 目的 筛选不典型增生结节(dysplastic nodule, DN)和小肝癌(small hepatocellular carcinoma, sHCC)之间的差异糖蛋白,并分析其聚糖结构,为肝癌的早期诊断提供参考。方法 对DN和sHCC各15例的石蜡组织切片进行蛋白质修复和提取;运用定量蛋白质组学技术鉴定DN和sHCC中的差异糖蛋白;利用IPA分析差异糖蛋白功能与相关信号通路,筛选出与肿瘤相关的差异糖蛋白;纯化目标糖蛋白,优化抗体辅助凝集素芯片技术(antibody overlay lectin microarray)分析其聚糖结构。结果 本研究共鉴定到26个差异糖蛋白;IPA分析筛选得到肿瘤相关的重要差异糖蛋白为α-1 抗胰蛋白酶(α-1-antitrypsin,A1AT)和补体C3;相比于DN,sHCC中A1AT与凝集素CAL、GSL I、JAC、GSL II、PHA-L、GNL、WGA等亲和的聚糖结构增多,C3与CSL、LTL、WFL亲和的聚糖结构增多,此结果说明在sHCC中,A1AT的T/Tn抗原、三/四天线的N-聚糖结构、高甘露糖和唾液酸等结构的含量增加;而C3的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、Lewis X 抗原［Fucα3(Galβ4)GlcNAc］、H-type 2 抗原［Fucα2(Galβ4)］和半乳糖β(1,3/1,6) 连接N-乙酰半乳糖［Galβ3(-6)GalNAc］结构增多。结论 在DN和sHCC中,A1AT、C3聚糖结构的变化可能为肝癌早期诊断提供新的糖生物学标志物。     

肝癌患者血清碱性磷酸酶凝集素亲和层析及其意义

目的:观察血清碱性磷酸酶凝集素结合率测定在肝癌诊断中的价值.方法:采用凝集素亲和层析法测定50例正常人、103例原发性肝癌、22例肝硬化、12例转移性肝癌患者血清碱性磷酸酶的小扁豆凝集素(LCA)、蔓陀萝凝集素(DSA)、E型红腰豆凝集素(E-PHA)等结合率.结果:原发性肝癌患者血清碱性磷酸酶的LCA结合率(49.02%±9.81%)明显高于正常对照组(31.57%±7.60%)、肝硬化组(37.00%±9.96%)和转移性肝癌组(33.31%±6.12%)(P<0.01),并与肿瘤大小呈显著性正相关(相关系数0.581).结论:血清碱性磷酸酶LCA结合率测定有助于原发性肝癌的实验诊断.     

应用凝集素芯片检测兔组织细胞膜表面糖谱

目的 应用凝集素芯片检测兔不同组织细胞膜表面糖链类型.方法 分别用不同胶原酶消化兔的脾、肾和肝组织,对消化后得到的细胞进行荧光标记,利用凝集素对糖链的特异亲和性捕获细胞,激光扫描仪检测细胞膜表面糖谱.结果 兔不同组织细胞表面糖链类型不同:肝细胞特异亲和的凝集素为LTL,脾细胞为SNA和WGA,3种组织细胞共有DSL、MAL、AAL、STL.结论 肝细胞膜表面特有糖链为L-岩藻糖,脾细胞特有糖链为唾液酸,使用凝集素芯片检测细胞膜表面的糖链特异性为建立各种细胞膜表面糖谱提供依据.     

小鼠肝腹水细胞膜表面糖表达谱

目的 探讨肝癌腹水细胞膜表面糖链表达谱.方法 用H22细胞制备肝腹水模型鼠,36只小鼠随机分为正常组(6只)和肝腹水组(20只),注射10 d后抽取腹水提取癌细胞用吖啶橙荧光标记,应用凝集素芯片检测细胞膜表面糖表达谱.结果 肝癌腹水细胞膜表面有大量唾液酸、乙酰葡萄糖、乙酰半乳糖、甘露糖和半乳糖糖链表达,正常小鼠肝组织中只有多聚乳糖胺类型糖链表达.结论 肝癌发生过程中伴随着细胞膜糖链类型和数量增加,唾液酸、乙酰葡萄糖、乙酰半乳糖、甘露糖和半乳糖糖链表达增加与肝癌变发生发展紧密相关.     

肿瘤患者血清碳水化合物末端Galβ1→4 GlcNAc糖链序列的表达

为了从分子水平探讨肿瘤患者血清碳水化合物不同糖链结构表达的意义,作者应用能识别碳水化合物末端Galβ1→4GlcNAc糖链序列的ricinuscommunis agglutinin(简称RCA_1)建立了一种血清检测方法,并对7种肿瘤患者、良性疾病及正常人血清中碳水化合物末端Galβ1→4GlcNAc糖链序列的表达进行了检测和分析.     

健康人肝组织麦胚凝集素亲和型糖蛋白表达谱分析

目的分析健康人肝组织麦胚凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)亲和型糖蛋白表达谱。方法从30例健康人肝组织混合样本的总蛋白中用WGA凝集素亲和层析分离纯化糖蛋白,再利用双向电泳结合SYPRO Ruby荧光染色进一步分离WGA亲和型糖蛋白。目的蛋白质点经质谱鉴定后对其进行生物信息学分析及功能分类。结果初步建立WGA亲和型糖蛋白的双向电泳图谱,图谱均点数为(650±50)个,质谱鉴定并去冗余共获116个蛋白。经生物信息学分析104个蛋白具有不同程度的N糖基化位点,最后按Gene Ontology的分类原则进行功能分类。结论凝集素亲和层析结合双向电泳荧光染色、质谱鉴定是一种高通量的检测方法,WGA亲和型糖蛋白表达谱的初步构建为后续研究奠定了基础。     

一种新的肝癌糖蛋白抗原HCA_2的纯化与分析

应用单抗(McAb)亲和层析技术,从原发性肝癌(HCC)组织中分离出高纯度新的肝癌相关抗原。ELISA和免疫酶斑点试验表明抗原活性保持良好,纯化倍数达580倍;SDS—PAGE、Western Blotting、PAGE、糖蛋白染色证实该抗原的蛋白组份为94KD和58KD两亚基组成的糖蛋白;抗原酶解、高碘酸钠氧化及ConA亲和吸附试验表明抗原决定簇由糖链构成;糖链含α—甘露糖基;放射免疫试验证实纯化抗原与AFP、CEA无关。其免疫生化特性及免疫组化特征与已知的肿瘤抗原均不相同。     

乙腈预处理血清寻找肝细胞癌发病相关的蛋白质

【目的】 应用乙腈(ACN)预处理血清的方法,对肝细胞癌(HCC)患者的血清进行蛋白质组分析,寻找与HCC发病相关的蛋白质&#65377; 【方法】 收集原发性HCC患者和健康人的血清各12例,首先使用乙腈预处理,然后去除白蛋白和免疫球蛋白等高丰度蛋白质,再进行双向电泳(2-DE)分析,筛选HCC与健康对照血清中有显著性差异的蛋白质斑点,并进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定&#65377; 【结果】 血清经0%&#65380;20%和30%浓度的乙腈预处理后,进行2-DE分析发现蛋白质斑点的检出数量分别为532 ± 96&#65380;623 ± 102和674 ± 123;对预处理后HCC患者和正常人的血清进行差异分析,发现甲状腺素(Tetraiodo-L-Thyronine)和Proapolipoprotein的表达上调,而维生素D结合蛋白(Vitamin D-binding Protein)和铁传递蛋白(Transferrin)的表达下调&#65377; 【结论】 对血清样本的蛋白质组分析,应用乙腈预处理会增加与白蛋白非特异性结合的蛋白质的检出;HCC患者血清中甲状腺素等4个蛋白的表达异常与HCC相关&#65377;     

HCCR1和HCCR2可溶性蛋白在细菌中表达、纯化及在早期肝癌诊断中的应用

目的评估HCCR1和HCRR2克隆、细茵表达及可溶性蛋白的纯化及应用于早期肝癌诊断的可行性。方法cDNA克隆、表达、蛋白质的纯化、Westem blot分析用于评估HCCR1和HCCR2蛋白的生产，Elisa方法用检测血清抗原。结果HCCR1和HCCR2能够高水平地在细茵中表达，纯化的可溶性蛋白能用于生产抗体并应用于肝癌的早期诊断。结论HCCR1和HCCR2蛋白质可以在细茵中生产，并能成功地用于肝癌的早期诊断。     

应用SELDI-TOF-MS技术筛选肝癌血清蛋白标记物

目的 运用表面增强激光解吸附/离子化时间飞行质谱技术(SELDI-TOF-MS)检测肝癌患者血清蛋白质的特异性生物标志,建立筛选血清蛋白质图谱模型并初步验证.方法 选择肝癌患者30例,HBV阳性携带者20例及正常人20例,应用SELDI-TOF-MS技术及相应的计算机软件进行比较分析,检测肝癌血清蛋白质的特异性生物标志,建立肝癌的筛选模型,并对其进行了双盲法验证.结果 肝癌组与对照组共有25个蛋白质差异有显著性,以其中5个蛋白标志物(6 888、13 764、6 487、3 450和6 814 Da)建立的筛选模型检测灵敏度为96.7％( 29/30),特异性为90.0％(36/40),盲法验证,灵敏度为95.5％(21/22),特异性为90％(27/30).结论 SELDI-TOF-MS技术具有高灵敏度和特异性,在肝癌的诊断及肿瘤特异性生物标志的筛选等方面具有一定价值.     

Establishment of a sandwich ELISA method for detection of vascular endothelial growth factor in serum samples of hepatocellular carcinoma patients

Objective To establish a sandwich ELISA method for detecting vascular endothelial growth factor （VEGF） in sera of population and the patients with hepatocellular carcinoma （HCC）. Methods Full length and two truncated human VEGF cDNA sequences were amplified from a commercial plasmid pBLAST49-hVEGF by PCR and inserted into the prokaryotic-expression plasmid pET-32a or pGEX-2T. Various VEGF proteins were expressed and purified from E. coli in His-Trx or GST fusion forms. The specific VEGF antibodies were elicited in experimental rabbits and mice by immunization of the full length VEGF fusion protein His-Trx-VEGF1-165. After purification of antibodies with chromatograph of Protein G, a sandwich ELISA technique was established. Serum VEGF levels were evaluated in 229 adults and 291 HCC patients. Results SDS-PAGE displayed that the molecular weights of the expressed full length （His-Trx-VEGF1-165）, N-terminal （His-Trx-VEGF1-100） and C-terminal （GST-VEGF100-165） human VEGF fusion proteins were about 38KD, 31KD, and 33KD, respectively. Western blots confirmed that the prepared antisera were able to recognize both prokaryoticly and eukaryoticly expressed recombinant VEGF proteins. Assays of serially diluted His-Trx-VEGF1-100 by the established sandwich ELISA method showed that the linear range of the standard curve was 0.625-320 ng/mL, with the squared correlation coefficient R^2=0.991. Screening of a serum panel containing 291 serum samples of HCC patients and 229 health adults revealed that the average VEGF level in HCC patients was higher than that in healthy controls, with a statically significant difference. Conclusion The established sandwich ELISA reflects the level of serum VEGF and provide scientific basis for screening metastasis and recurrence of HCC using serum VEGF as an index.     

Establishment of a Sandwich ELISA Method for Detection of Vascular Endothelial Growth Factor in Serum Samples of Hepatocellular Carcinoma Patients1

Objective To establish a sandwich ELISA method for detecting vascular endothelial growth factor(VEGF)in sera of population and the patients with hepatocellular carcinoma(HCC). Methods Full length and two truncated human VEGF cDNA sequences were amplified from a commercial plasmid pBLAST49-bVEGF by PCR and inserted into the prokaryotic-expression plasmid pET-32a or pGEX-2T. Various VEGF proteins were expressed and purified from E. coli in His-Trx or GST fusion forms.The specific VEGF antibodies were elicited in experimental rabbits and mice by immunization of the full length VEGF fusion protein His-Trx-VEGF1-165.After purification of antibodies with chromatograph of Protein G.a sandwich ELISA technique was established.Serum VEGF levels were evaluated in 229 adults and 291 HCC patients.Results SDS-PAGE displayed that the molecular weights of the expressed full length(His-Trx-VEGF1-165),N-terminal(His-Trx-VEGF1-100)and C-terminal(GST-VEGF100-165)human VEGF fusion proteins were about 38KD,31KD,and 33KD,respectively.Western blots confirmed that the prepared antisera were able to recognize both prokaryoticly and eukaryoticly expressed recombinant VEGF proteins.Assays of serially diluted His-Trx-VEGF1-100 by the established sandwich ELISA method showed that the linear range of the standard curve was 0.625-320 ng/mL.with the squared correlation coefficient R2=0.991.Screening of a serum panel containing 291 serum samples of HCC patients and 229 health adults rovealed that the average VEGF level in HCC patients was higher than that in healthy controls,with a statically significant difference. Conclusion The established sandwich ELISA reflects the level of serum VEGF and provide scientific basis for scrcening metastasis and recurrence of HCC using serum VEGF as an index.     

肝细胞癌门静脉癌栓形成相关的血清蛋白质分子标记物研究

目的筛选肝细胞癌门静脉癌栓形成相关的血清蛋白质分子标记物并建立预测模型。方法收集135例肝细胞癌患者血清,95例(其中33例为肝细胞癌伴门静脉癌栓,62例为肝细胞癌不伴门静脉癌栓)为建模型组,40例(其中18例为肝细胞癌伴门静脉癌栓,22例为肝细胞癌不伴门静脉癌栓)为盲法验证组,采用弱阳离子交换蛋白质芯片(WCX2)为检测介质,经表面加强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDITOFMS)测定得到蛋白质谱,通过BioMarkerWizardSoftware比较两组患者血清蛋白质谱,利用BiomarkerPatternsSoftware建立决策树模型并进行盲法验证。结果在m/z1100～30000范围内,检测出的100个蛋白峰中16个蛋白峰有显著差异(P<0.01),m/z为3478、1314、1744、1725、2022和3380的蛋白峰在肝细胞癌伴门静脉癌栓组中上调,而m/z为8901、9353、9415、8773、2766、2745、8697、7773、8569和1373的蛋白峰在肝细胞癌伴门静脉癌栓组中下调;选择m/z为3478、2022、8901、9415、8773、2766、和2745的7个蛋白峰建立的决策树模型其敏感性为75.8%(25/33),特异性为82.3%(51/62);盲法验证该模型准确率87.5%(35/40),灵敏性100%(18/18),特异性77.3%(17/22),阳性预测值78.3%(18/23),阴性预测值100%(17/17)。结论筛选出的16个蛋白分子标记物可能与肝细胞癌门静脉癌栓形成有关;决策树模型可能对预测肝细胞癌门静脉癌栓的发生有重要的临床意义。     

双向凝胶电泳进行肾癌与健康人血清中差异表达蛋白的筛选和鉴定

目的 应用双向凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离化/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对小肾癌与健康人的血清蛋白进行差异蛋白质的筛选和鉴定,以寻找潜在的肾癌肿瘤标志物.方法 选取20例小肾癌患者和20名健康人,各抽取少量静脉血,分离出血清,应用2-DE结合MALDI-TOF-MS技术测定血清蛋白质表...     

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3对原发性肝细胞癌的诊断价值评价

目的：探讨血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）对原发性肝细胞癌的诊断价值。方法：应用酶联免疫法测定35例肝细胞癌（HCC）、26例肝硬化和50例健康人血清GPC3和甲胎蛋白（AFP）水平,并分析比较两者对原发性HCC的诊断价值。结果：HCC组、肝硬化组和健康对照组血清GPC3分别为（4．16±2．35）、（3．13±1．19）和（1．92±1．23）ng·ml^-1,HCC组明显高于肝硬化组和健康对照组,差异有统计学意义（分别P=0．018和P〈0．001）。对于诊断HCC,GPC3的ROC曲线下面积为0．789,AFP为0．803;GPC3的敏感性为82．8％,特异性为56．5％;AFP的敏感性为62．8％,特异性为78．9％。GPC3与AFP联合应用诊断HCC则敏感性为91．4％,特异性为45．6％。对于I期和Ⅱ期HCC,GPC3的阳性比例（11／14）高于AFP（4／14）,差异有统计学意义（P=0．021）。结论：GPC3是一个敏感且特异的HCC标志物,检测血清GPC3有助于HCC的诊断与研究。     

双向电泳和质谱技术分析HCV NS3转化肝细胞的蛋白质组

目的:持续感染丙型肝炎病毒(HCV)在肝细胞癌(HCC)发生中起重要作用,细胞转染和成瘤实验表明HCV NS3对人肝细胞具有转化作用和致瘤活性.本实验旨在探讨HCV非结构蛋白3(NS3)转化肝细胞的蛋白质组.方法:构建稳定表达HCV NS3 N端多肽的人肝细胞(pRcHCNS3/QSG)及空白质粒转染细胞(pRcCMV/QSG),双向电泳技术分离两种细胞的总蛋白,差异蛋白质点进行质谱分析,Western印迹验证蛋白表达差异.结果:得到分辨率较高、重复性较好的双向电泳图谱.pRcHCNS3/QSG和pRcCMV/QSG细胞的蛋白质斑点数分别为(1 183±77)和(1 095±82)个,两组平均匹配数为(920±60)个.初步鉴定出15个有意义的蛋白质点.其中Ras,P38,HD53等参与调节信号转导的蛋白在pRcHCNS3/QSG细胞中表达上调,Western印迹结果亦证实pRcHCNS3/QSG细胞中磷酸化的P44/42和P38表达增加.鉴定出的差异蛋白质还包括一些调节细胞周期、免疫反应、与肿瘤侵袭和转移相关的蛋白质及参与肝脏代谢的蛋白质.结论:HCV NS3可能通过影响多种蛋白表达,经相应信号转导途径,如丝裂原活化蛋白激酶途径,使细胞发生恶性转化.进一步弄清信号转导过程和相互关系不仅对了解HCV相关性HCC的发生机制有重要意义,而且为从分子水平治疗HCC提供新思路.