旋转超滤：一种提取细胞外泌体的新方法

目的 建立一种利用旋转超滤技术从骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）培养上清液中分离外泌体（exosome）的方法。 方法 收集BMSCs细胞培养上清,低速离心去除残余细胞,0.22 μm滤器过滤除去细胞碎片,采用旋转超滤技术提取外泌体。应用透射电子显微镜观察所获外泌体的形态,用蛋白质印迹法检测外泌体标记物CD63、CD9蛋白的表达,用CCK-8试剂盒检测外泌体对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）增殖活性的影响。 结果 使用旋转超滤技术成功分离出BMSCs分泌的外泌体,透射电镜下外泌体为圆形或椭圆形,直径约100 nm,蛋白质免疫印迹法检测结果显示外泌体中有其特异标记物CD63、CD9蛋白的表达。外泌体能够促进HUVECs增殖,并且其促细胞增殖作用随浓度增高而增强。 结论 旋转超滤技术是一种简单有效的提取外泌体的方法。     

间充质干细胞外泌体调控氧化应激减轻D 氨基半乳糖/脂多糖诱导的急性肝损伤

目的: 探讨小鼠间充质干细胞来源的外泌体(exosome, Exo)对D-氨基半乳糖(D-galactosamine hydrochloride, D-GalN)/脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)诱导的急性肝损伤治疗作用及可能机制。方法: 提取小鼠间充质干细胞,通过流式细胞术和细胞分化实验进行验证。超速离心法提取间充质干细胞外泌体,透射电镜和蛋白质免疫印迹对其鉴定,纳米颗粒追踪分析测定外泌体粒径电位。通过活性氧荧光探针考察外泌体减轻活性氧损伤的功能。CCK-8检测外泌体对肝细胞的保护作用。腹腔注射D-GalN/LPS制备急性肝损伤小鼠模型,考察外泌体对D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤小鼠的治疗作用。结果： 原代间充质干细胞表达CD29和CD44两个标志蛋白,而不表达CD31和CD117,具有成骨分化能力。间充质干细胞外泌体为具有典型杯状结构的纳米囊泡,表达CD9和CD63两个标志性蛋白。与PBS组相比,干细胞外泌体能够减轻L02细胞内的活性氧水平,提高L02细胞活性,且外泌体本身对L02细胞活性没有影响。与PBS组相比,Exo治疗组能够改善肝脏组织损伤,降低转氨酶水平,调节丙二醛、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的水平。结论： 在细胞实验中,间充质干细胞外泌体能够减少活性氧,保护肝细胞的活性;在动物实验中,间充质干细胞外泌体能够下调氧化应激相关蛋白的表达,促进肝脏组织修复。     

低氧诱导胰腺癌细胞通过外泌体途径分泌高迁移率族蛋白1

目的: 研究低氧诱导条件下胰腺癌细胞中高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)的分泌途径。方法: 经GEO和TCGA数据库分析HMGB1在胰腺癌样本中的表达;低氧处理胰腺癌PaTu8988细胞0,6,12,24,48 h,免疫印迹法检测培养上清液中HMGB1的含量;采用外泌体提取试剂盒分离常氧和低氧培养液中的外泌体,运用透射电镜观察外泌体膜结构,运用免疫印迹法检测外泌体中的HMGB1以及外泌体标志蛋白CD9、CD63、CD81以及HSP70的表达;利用免疫荧光法和激光扫描共聚焦显微镜观察HMGB1在PaTu8988细胞中的定位情况。结果： 数据库分析结果表明,与健康胰腺组织相比,HMGB1在胰腺癌组织中呈高表达(P<0.01),且高表达者生存期明显短于低表达者(P<0.05)。低氧处理48 h,细胞培养上清液中的HMGB1含量最多,明显高于6,12,24 h。透射电镜观察到培养上清液中有微囊泡结构,直径在100 nm左右,蛋白质免疫印迹法检测到外泌体膜标志蛋白CD9,CD63,CD81,HSP70的表达和外泌体中HMGB1的表达。免疫荧光结果显示,低氧情况下HMGB1和外泌体共定位增多。 结论： 低氧处理条件下,胰腺癌细胞中HMGB1可通过外泌体途径释放到细胞外。     

肿瘤样干细胞来源的外泌体促进人脐带间充质干细胞的增殖和侵袭

目的探讨Piwil2诱导肿瘤干细胞（Piwil2-iCSC）来源的外泌体对人脐带间充质干细胞（hucMSCs）肿瘤样生物学行为的影 响。方法超速离心法提取Piwil2-iCSCs外泌体,透射电镜、粒径分析、Western blot及外泌体摄入实验检测外泌体形态、直径、标 志蛋白表达及作用途径。将hucMSCs 分为对照组、PBS干预组和外泌体干预组（Exo）,CCK-8、细胞划痕实验、Transwell 和 Western blot检测各组hucMSCs的增殖、迁移、侵袭能力以及基质金属蛋白酶（MMPs）MMP2和MMP9蛋白的表达水平。细胞 染色体核型分析检测经Piwil2-iCSCs外泌体长期干预的hucMSCs的染色体结构。结果透射电镜可见Piwil2-iCSCs外泌体大 小均匀,直径在50~100 nm,呈形态较规则的圆形或椭圆形囊泡状小体,粒径分析显示外泌体直径分布集中在在100~200 nm; Western blot显示外泌体标志性蛋白CD9、CD63和piwil2蛋白阳性表达;外泌体摄入实验表明外泌体进入细胞发挥作用。与对 照组和PBS干预组相比,Exo组细胞增殖数量明显增多（P<0.05）,划痕愈合速度加快（24 h,P<0.05;48 h,P<0.01）,侵袭细胞数目 显著增加（P<0.01）。经Piwil2-iCSCs外泌体干预后的hucMSCs细胞MMP2（P<0.05 vs PBS干预组,P<0.01 vs 对照组）、MMP9 蛋白水平表达增高（P<0.05）,但染色体核型仍是46XY,无异常。结论肿瘤样干细胞Piwil2-iCSC外泌体能促进hucMSCs的增 殖、迁移及侵袭,但是未出现肿瘤样异质性改变。     

脐带间充质干细胞外泌体修复骨质疏松大鼠颅骨缺损的研究

目的：探讨人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,HucMSCs）来源外泌体对骨质疏松大鼠颅骨缺损的修复作用。方法：提取HucMSCs来源外泌体,使用透射电镜及纳米颗粒追踪分析鉴定其形态及大小,使用Western blot鉴定其表面标志物;分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）并使用流式细胞术鉴定其表面标志物;将外泌体（空白对照、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL）与BMSCs共培养,检测不同浓度的外泌体对BMSCs增殖及成骨向分化的影响;选取SD大鼠通过卵巢切除术（ovariectomy,OVX）构建骨质疏松模型,在颅骨缺损模型建立的同时注射外泌体悬液,术后8周处死大鼠,取术区组织进行micro-CT扫描并进行骨量分析,HE染色后显微镜下观察骨缺损愈合情况,评价HucMSCs来源外泌体对骨质疏松大鼠颅骨缺损的修复潜能。结果：透射电镜及纳米颗粒追踪分析结果显示,提取的HucMSCs来源外泌体形态及大小符合要求,表面蛋白...     

刚地弓形虫RH株速殖子外泌体的分离与鉴定

目的: 分离与鉴定刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）RH株速殖子外泌体。方法: 收集弓形虫速殖子与人结肠癌SW480细胞共培养上清液,经离心、过滤,采用基于聚合物沉淀技术的试剂盒法分离外泌体;透射电镜观察外泌体形态特征,纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）检测外泌体粒径大小,蛋白质印迹法检测外泌体经典标志分子CD63、HSP70以及弓形虫特异蛋白表面抗原1（surface antigen 1,SAG1）、棒状体蛋白16（rhoptry protein 16,ROP16）、ROP18和致密颗粒蛋白1（dense granule protein 1,GRA1）。结果： 从弓形虫与细胞共培养上清液中分离出囊泡样物质,其外形为圆形,有完整的膜结构,直径为30~150 nm;表达外泌体特异性蛋白CD63、HSP70;检测出弓形虫特异性蛋白SAG1、ROP16、ROP18和GRA1。结论： 从弓形虫速殖子与SW480细胞共培养上清液中获得弓形虫外泌体。     

鼻咽癌细胞来源外泌体的提取和鉴定

目的：从鼻咽癌细胞系CNE－1、CNE－2及SUNE－1中分离外泌体,并对CNE－2所得外泌体进行鉴定。方法使用ExoQuick－TC（ SBI）试剂盒法从鼻咽癌细胞系CNE－1、CNE－2及SUNE－1培养上清液分离出外泌体,使用透射电镜观察其形态特征,BCA法进行蛋白定量,Western blot进行外泌体特异性抗原分子CD63及筏蛋白－1鉴定。结果3种鼻咽癌细胞系培养上清液中均分离出大量泡状物,透射电镜下观察呈圆形的囊泡,直径为40～130 nm,具有完整胞膜。且CNE－2来源的此种泡状物表达外泌体特异性膜筏蛋白－1、CD63。10 mL对数生长期CNE－2培养上清液得到487μg／mL（以蛋白计）的外泌体200μL。结论本实验室保存的3种鼻咽癌细胞系很可能均能产生外泌体,ExoQuick－TC（ SBI）法能够简便快速地从鼻咽癌细胞系中提取到外泌体,不需要超速离心,为鼻咽癌的防治研究提供了新的研究方法和靶点。     

炎症微环境中脐带干细胞外泌体对牙周膜干细胞增殖和迁移的影响

背景 在炎症微环境中牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)的生物活性受到抑制是牙周再生困难的重要原因.脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)来源外泌体(exosome,Exo)具有与UCMSCs相似的生物学作用,广泛用于多种组织的再生修复,但在牙周再生方面的研究仍然缺乏,对炎症微环境中PDLSCs生物活性的影响尚不明确.目的 探讨在炎症微环境中UCMSCs来源外泌体对PDLSCs增殖和迁移的影响.方法 提取UCMSCs来源外泌体并进行鉴定;分离PDLSCs并进行鉴定;荧光显微镜下观察PDLSCs对外泌体的摄取内吞;按照空白对照组、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)组、TNF-α+25μg/mL外泌体组、TNF-α+50μg/mL外泌体组、TNF-α+100μg/mL外泌体组进行实验分组,分别通过CCK-8实验、划痕实验、Transwell实验检测炎症微环境中外泌体对PDLSCs增殖、横向迁移及纵向迁移的影响.测炎症微环境中外泌体对PDLSCs增殖、横向迁移及纵向迁移的影响.结果 透射电镜下UCMSCs来源外泌体呈现类圆型,直径100 nm左右.Western blot检测到外泌体表面蛋白CD9、CD63、CD81表达阳性.成功提取PDLSCs,能够表达间充质干细胞表面标记蛋白CD90、CD73、CD29、CD105.免疫荧光结果显示UCMSCs来源外泌体可以被PDLSCs内吞.CCK-8实验表明UCMSCs来源外泌体可以促进炎症微环境中PDLSCs的增殖(P<0.05),100μg/mL外泌体促增殖作用最佳(P<0.05).Transwell实验和划痕实验分别表明UCMSCs来源外泌体可以促进炎症微环境中PDLSCs的横向迁移及纵向迁移,且呈浓度依赖性,外泌体浓度100μg/mL促迁移作用最佳(P<0.05).结论 在炎症微环境下,UCMSCs来源外泌体可以有效促进PDLSCs的增殖和迁移,高浓度外泌体促增殖及迁移效果更佳,这为外泌体应用于牙周再生奠定了基础.     

口腔鳞癌细胞来源外泌体的提取与鉴定

目的 提取并鉴定口腔鳞癌细胞来源的外泌体。方法 超速离心法自口腔鳞癌CAL27细胞培养上清中提取外泌体,利用透射电镜观察其形态特征和大小,纳米粒度分析检测其粒径大小和分布,Western blot检测其外泌体特异性蛋白CD9、CD81和CD63的表达。结果 自口腔鳞癌CAL27细胞上清中分离出的外泌体,形态为具有膜结构的囊泡,直径约30-100 nm;粒径分析显示其粒径的主峰为127.0 nm,大小分布集中于(127.9±4.1)nm; Western blot结果显示其具有外泌体特异性蛋白CD9、CD81和CD63的表达。结论 利用超速离心法可成功提取口腔鳞癌CAL27细胞来源的外泌体,为后续探究外泌体调控口腔鳞癌发生发展的相关机制奠定实验基础。     

宫颈癌HeLa细胞外泌体对细胞迁移和侵袭的影响及其Wnt/β-catenin信号通路机制

目的：探讨宫颈癌HeLa细胞外泌体对细胞迁移、侵袭及Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路的影响,阐明其外泌体在宫颈癌发生发展过程中的可能作用机制。方法：取对数生长期宫颈癌HeLa细胞,采用超速离心法分离宫颈癌HeLa细胞外泌体,透射电镜下观察外泌体形态表现,Western blotting法检测外泌体标志蛋白CD63和CD81的表达,鉴定分离出来的外泌体。将HeLa细胞分为外泌体组（Exo组）和对照组,2组细胞分别用含和不含HeLa细胞外泌体的培养基培养。共聚焦显微镜下观察HeLa细胞摄取外泌体情况,其中外泌体采用PKH26荧光标记,HeLa细胞用DAPI荧光进行核染色,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,细胞划痕实验测定细胞迁移能力,Western blotting法检测细胞中Wnt1、β-catenin和T细胞因子4（TCF4）蛋白表达水平。结果：透射电镜下观察,HeLa细胞中分离的外泌体为是圆形或椭圆形、直径为40~100 nm的囊泡状小体,且富含CD63和CD81蛋白。共聚焦显微镜下观察,Exo组HeLa细胞膜表面有外泌体附着,而对照组HeLa细胞膜表面无外泌体附着。Transwell小室实验,Exo组HeLa细胞中侵袭细胞数明显高于对照组（t=17.894,P<0.01）。细胞划痕实验,Exo组HeLa细胞迁移距离明显长于对照组（t=9.689,P<0.01）。Western blotting法检测,与对照组比较,Exo组HeLa细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表达水平均明显升高（t=13.159,P<0.01;t=15.478,P<0.01;t=7.734,P<0.01）。结论：宫颈癌HeLa细胞来源的外泌体可促进宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力,其机制可能与HeLa细胞来源外泌体可促进Wnt/β-catenin信号通路的激活及下游TCF4基因的表达有关。     

肿瘤来源的外体及其在肿瘤中的作用

外体（exosome）是由细胞内多泡体（multivesicular body,MVB）与细胞膜融合而释放到细胞外的纳米大小的膜性小囊泡,具有一定的免疫调节功能。造血细胞以及非造血细胞都可以分泌外体。肿瘤来源的外体（tumor-derived exosome,TEX）存在于肿瘤细胞培养上清液、肿瘤患者血浆或者恶性渗出液中,包含天然的肿瘤相关抗原,并能将其呈递给T细胞,可有效地促进细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte ,CTL）的活化,产生抗瘤免疫。近年来,也有文献报道外体可诱导免疫耐受,甚至产生免疫抑制作用而使得肿瘤逃逸宿主免疫系统对它的免疫监视,并能促进肿瘤细胞的增殖。这些功能的不一致与外体的表型密切相关。     

外泌体在胆管细胞癌中的研究进展

胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,CCA)是一种恶性程度较高,可发生于胆管树任何位置的实体肿瘤。CCA由于症状不明显且进展迅速,往往发现时已处于进展阶段,即使及时手术,5年存活率也小于10%。因此寻找CCA特异的生物标记物,早期筛查出CCA可疑人群十分必要。外泌体属于细胞外囊泡的一种亚型,能够被细胞分泌出来,广泛分布于体液之中。由于外泌体包含有分泌细胞的某些特异物质,近年来作为潜在的生物标记物在肿瘤的发生和转移领域被广泛关注。本文总结了外泌体在CCA中的研究进展,分析目前研究存在的问题,以期为后续研究提供帮助。     

外泌体在肿瘤诊疗中的研究进展

外泌体是具有磷脂双分子膜结构的纳米级囊泡,直径在30~100 nm,广泛分布于血清、唾液、尿液等体液中。外泌体中包含多种蛋白质、核苷酸、甚至病毒等遗传物质,广泛参与细胞间物质交换和信息传递。最近研究发现,肿瘤细胞分泌的外泌体中mRNA和miRNA等遗传物质直接来自母体肿瘤细胞,此外外泌体携带的遗传物质可以直接作用于受体细胞,因此外泌体可能成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。本文对外泌体作为肿瘤诊断的标志物以及外泌体对肿瘤治疗的作用作一综述。     

基于PEG6000富集精液来源外泌体的提取及鉴定

目的介绍PEG6000富集精液来源外泌体的提取和鉴定方法,为精液外泌体相关研究奠定基础。方法选自南方医科大学 南方医院检验中心6名正常志愿者精液,经8% PEG6000富集并多步离心结合超速离心方法获取提取物,然后采用透射电子显 微镜观察其形态,纳米颗粒跟踪分析仪分析其大小,蛋白印迹法检测其蛋白组成成分。结果提取物呈类圆形、椭圆形囊泡,质 膜完整,大小约为30~150 nm,内部含有低电子密度物质,均阳性表达CD63、ALIX、TSG101 蛋白,且不含精子细胞内质网 Calnexin蛋白。结论经过对提取物的形态、大小以及其蛋白成分分析证实所提取到的物质为精液来源的外泌体,为后续开展 精液外泌体临床及基础研究提供了方法学基础。     

外泌体在肿瘤诊治中的研究进展

外泌体是多囊泡体（MVBS)与细胞膜接触融合而释放的纳米级生物活性小囊泡;直径为30-100nm,几乎所有活细胞均可分泌,尤以肿瘤细胞分泌更为旺盛。根据其特性使得外泌体在肿瘤的诊断中有着很大的开发前景。     

外泌体在头颈部恶性肿瘤中的研究进展

 外泌体为细胞分泌的直径30~100 nm的细胞外囊泡,最早发现于绵羊网织红细胞培养上清中。早期研究认为外泌体仅仅为细胞排除代谢废物的“垃圾桶”,而近段时间越来越多的证据显示外泌体内的“货物”能够在细胞之间互相传递,从而在介导细胞间通讯、调节免疫反应、诱导肿瘤细胞耐药和转移等方面发挥着重要作用。头颈部恶性肿瘤作为高发恶性肿瘤之一,发病率较高、早期筛查指标缺乏及治疗效果不理想等制约着疾病的诊治。而外泌体在研究头颈部恶性肿瘤发生发展中的内在机制、筛选稳定的生物标记物进行诊断和判断预后以及应用靶向治疗等方面的研究日益增长,因此本文就目前关于外泌体在头颈部恶性肿瘤中的进展作一综述。     

外泌体在卵巢癌中的研究进展

卵巢癌是常见的妇科肿瘤,其早期诊断率低,晚期缺乏有效的治疗手段,致死率极高.外泌体在循环系统中含量丰富,稳定作用于靶细胞,是携带许多生物活性物质的囊泡.外泌体作为细胞间通信的重要媒介,参与了卵巢癌细胞及其微环境之间的信息传递,在卵巢癌诊断、治疗及预后方面都有重要的价值.本文就外泌体在卵巢癌中的作用机制及其在诊断和治疗中...     

外泌体对上皮-间质转化调控作用的研究进展

外泌体是一种具有生物活性的膜性囊泡,既可在细胞间传递活性物质,还可通过调控细胞间的信息传递参与细胞活动。 上皮-间质转化（EMT）是上皮细胞获得间充质细胞特性的过程,在众多疾病中发挥了重要作用。研究表明,外泌体在EMT的发 生发展过程中具有双向作用。一方面,外泌体可促进细胞发生EMT,赋予肿瘤细胞侵袭和转移能力,促进血管新生和加快肿瘤 生长;另一方面,外泌体亦可抑制EMT,发挥减弱肿瘤细胞侵袭能力,抑制心、肝、肾纤维化,改善心肌梗死等作用。外泌体可能 是通过携带EMT相关蛋白或miRNA,调控EMT相关信号通路发挥双向调节作用。