CD40培养体系的建立及B淋巴细胞的体外培养

采用自行研制成的功能性抗人ＣＤ４０单克隆抗体、转导ＣＤ３２的Ｌ细胞（ＬＣＤ３２）和细胞因子建立体外研究人Ｂ淋巴细胞增殖、生长和分化的ＣＤ４０系统。方法：①流式细胞仪分析ＣＤ４０分子的表达;②在ＣＤ４０激发型单抗（克隆５Ｃ１１）与ＬＣＤ３２共培养中,加入ＩＬ－４及其它细胞因子,组成ＣＤ４０培养系统,观察人扁桃体来源Ｂ细胞的体外生存和增殖等生物学效应。结果：①ＣＤ４０分子表达于人外周血、扁桃体来源的Ｂ细胞及人多发性骨髓瘤（ＭＭ）细胞株ＸＧ２和人Ｂ淋巴瘤细胞株Ｄａｕｄｉ;②用ＣＤ４０激发型单抗（克隆５Ｃ１１和２Ｇ１１）与ＬＣＤ３２细胞联合ＩＬ－４能使静止期Ｂ细胞体外长期生存和增殖。表明用激发型ＣＤ４０单抗５Ｃ１１和２Ｇ１１建立的ＣＤ４０培养体系,能使Ｂ细胞长期生存和增殖,为体外研究Ｂ细胞提供了有效的手段。     

CD40培养体系的建立及B淋巴细胞的体外培养

采用自行研制成的功能性人ＣＤ４０单克隆抗体，转导ＣＤ３２的Ｌ细胞和细胞因子建立体外研究人Ｂ淋巴细胞增殖，生长和分化的ＣＤ４０系统。方法（１）流式细胞仪分析ＣＤ４０分子的表达；（２）在ＣＤ４０激发型单抗与ＬＣＤ３２共培养中，加入ＩＬ－４及其它细胞     

抗CD40单克隆抗体诱导树突状细胞增殖和分化成熟作用研究

探讨ＣＤ４０分子在树突状细胞和外周血单核细胞表达的意义。方法将人外周血单核细胞经不同组合的细胞因子共培养共获得了树突状细胞，经流式细胞仪表型分析，活细胞计数，混合淋巴细胞反应等方法测定抗人ＣＤ４０单抗体ＣＤ４０分子的激发作用。结论抗人ＣＤ４０激发型单抗是一种潜在的免疫激动剂。     

新生儿B细胞功能与细胞因子

检测１８例健康新生儿脐血Ｔ细胞（ＴＬ）产生白细胞介素４（ＩＬ－４）及ＩＬ－６水平同时，观察ＩＬ－４、ＩＬ－６及ＩＬ－１０对日细胞（ＢＬ）功能即葡萄球菌Ａ蛋白（ＳＡＣ）诱导的ＢＬ增殖功能与免疫球蛋白Ｇ（ＩｇＧ）合成的影响。结果发现新生儿ＴＬ产生的ＩＬ－４及ＩＬ－６水平显著低于成人并与其ＢＬ功能低下呈显著正相关，ＩＬ－４、ＩＬ－６及几ＩＬ－１０可不同程度地纠正新生儿低下的ＢＬ能。本文提示ＴＬ产生的ＩＬ－４、ＩＬ－６及ＩＬ－１０等调节因子不足可能是新生儿ＢＬ功能低下的重要原因之一。     

流式细胞术检测狼疮患者白细胞分化抗原40配体

了解在系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）患者血液中辅助性Ｔ细胞（Ｔｈ）与Ｂ细胞间的白细胞分化抗原（ＣＤ）４０－ＣＤ４０配体（Ｌ）的共刺激作用。方法：用抗ＣＤ３单克隆抗体（单抗）刺激ＳＬＥ活动期和缓解期各１０例患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）,采用流式细胞术检测不同时段ＣＤ４０Ｌ的表达水平,并与正常对照组比较。结果：活动期ＳＬＥ组ＣＤ４０Ｌ的表达在抗ＣＤ３单抗刺激前后均显著高于正常对照组,差异均有非常显著意义;而缓解期ＳＬＥ组Ｔ细胞在抗ＣＤ３单抗刺激前的ＣＤ４０Ｌ表达在正常范围内,在刺激后显著高于正常对照组,差异有非常显著意义。结论：ＣＤ４０Ｌ－ＣＤ４０共刺激作用在ＳＬＥ发病机制和病程中起着重要作用。     

α—CD3单克隆抗体对肿瘤特异性T细胞的扩增和杀瘤活性的影响

为寻找更有效的肿瘤过继性免疫治疗的方案，用α－ＣＤ３单克隆抗体（单抗）激活ＦＢＬ－３红白血病肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞获取肿瘤特异性Ｔ细胞，并观察α－ＣＤ３单抗对肿瘤特异性Ｔ细胞的增殖、杀瘤活性及表型影响，体外实验结果显示，免疫小鼠脾细胞经α－ＣＤ３单抗激活后，采用低剂量ＩＬ－２即可维持其长期高度的、持续的增殖；又培养过程中α－ＣＤ３单抗持续存在可大大促进其对肿瘤的特异性杀伤。细胞分型分析结果也支持     

CD40反义RNA对K562细胞的影响

目的 探讨ＣＤ４０反义ＲＮＡ对肿瘤传代细胞Ｋ５６２细胞株的影响。方法 用本室构建的ＣＤ４０反义ＲＮＡ转导Ｋ５６２细胞，结果 发现转导反义ＲＮＡ后Ｋ５６２细胞体积缩小，代谢变慢，光镜下见细胞核固缩或碎裂成块状，其ＤＮＡ电泳呈梯状断裂现象，用ＣＤ４０基因特异性引物和寡苷酸探针进行ＲＴ－ＰＣＲ和Ｓｌｏｔｂｌｏｔ方法检测，发现Ｋ５６２细胞为ＣＤ４０基因阳性。结论 Ｋ５６２细胞为ＣＤ４０基因阳性细胞，受ＣＤ     

CD3AK细胞对人肺癌细胞株的细胞毒作用

目的研究ＣＤ３ＡＫ细胞对人肺癌细胞株的细胞毒作用。方法应用抗ＣＤ３单克隆抗体及重组白细胞介素２（ｒＩＬ－２）刺激培养ＣＤ３ＡＫ细胞,体外实验研究ＣＤ３ＡＫ细胞的增殖及对人肺癌细胞株Ａ５４９、ＳＰＣ－Ａ１细胞的杀伤能力。结果刺激培养４ｄ,ＣＤ３ＡＫ细胞增殖及杀伤能力与ＬＡＫ细胞无差异;培养８ｄ,ＣＤ３ＡＫ细胞的增殖及杀伤能力明显优于ＬＡＫ细胞（Ｐ＜０．０１）;培养１６ｄＣＤ３ＡＫ细胞仍见增殖,且杀伤作用保持在５０％以上。结论ＣＤ３ＡＫ中细胞作为一种新的肿瘤过继性免疫治疗效应细胞具有潜在的临床应用价值。     

自然杀伤细胞的独立刺激信号——CD45分子交联

目的：探讨表面分子在自然杀伤（ＮＫ）细胞活化中的信号分子作用及其机制。方法：采用多种粘附分子单抗及配体刺激ＮＫ细胞，ＥＬＩＳＡ法定量检测刺激后ＮＫ细胞释放的γ干扰素（ＩＦＮ－γ）作为ＮＫ细胞活化指标，观察各种粘附分子在ＮＫ细胞释放ＩＦＮ－γ中的信号作用。结果：单一ＣＤ４５单抗刺激即可使ＮＫ细胞活化；两种分别为ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ亚类的ＣＤ４５单抗及ＩｇＧ２ａ亚类ＣＤ４５单抗的Ｆ（ａｂ′）２均体现对     

白介素对脐血B细胞免疫球蛋白类别转换的影响

采用反向酶联免疫斑点法观察脐血单个核细胞，及添加重组细胞后脐血Ｂ细胞免疫球蛋白释放细胞数量以探究细胞因子对新生儿Ｂ细胞免疫球蛋白类别转换的影响。结果；正常脐血单个核细胞仅产生少量的ＩｇＳＣＳ。用抗ＣＤ３单抗刺激丝裂素Ｃ处理后的脐血Ｔ细胞，并补充ｒＩＬ－２，ｒＩＬ－４，ｒＩＬ－１０及其组合，可诱导脐血Ｂ细胞释放ＩｇＡ，ＩｇＧ及ＩｇＭ。     

The expression of CD40 and CD40L on the surface of peripheral blood mononuclear cells in asthmatic rats and the effect of anti-CD40L McAb on Th1 and Th2 cytokines

Objective： To investigate the expression of CD40 and CD40 ligand （CD4OL） on the surface of peripheral blood mononuclear cells（PBMCs） in asthmatic rats and the effect of anti-CD40L McAb on cytokines of PBMCs. Methods： Flow cytometry and RT-PCR were used to detect the expression of CD40 and CD40L of PBMCs in asthmatic rats. After the PBMCs was treated with anti-CD40L McAb, ELISA was used to detect the IL-4 and IFN-γ levels of culture supernatants. Results： Compared with the normal control group, the expression of CD40 and CD40L of PBMCs in asthmatic rats increased （P 〈 0.05）. Compared with the untreated group, the level of IL-γ and the ratio of IL-4/IFN-γ decreased after the PBMCs was treated with anti-CD40L McAb（P 〈 0.05）. Conclusion： The expression of CD40 and CD40L on the surface of PBMCs in asthmatic rats was up-regulated. Anti-CD40L McAb can rectify the imbalance of Th1 and Th2 cytokines.     

Protective effect of human CD40-Ig fusion protein in a murine model of acute graft-versus-host disease

目的在小鼠GVHD模型中研究利用人CD40-Ig阻断CD40/CD40L相互作用的保护性效果.方法将人CD40基因胞外区插入含有人IgG1 Fc段基因的pIG1载体中,构建携带CD40-Fc融合基因的瞬时表达载体转染COS-7细胞,ELISA法检测CD40-Ig融合蛋白的表达.再将CD40-Fc融合基因连接入pcDNA3.1的相应位点构建稳定表达载体转染CHO细胞,利用Protein A亲和层析法纯化融合蛋白.SDS-PAGE、Western blot和配基结合实验鉴定CD40-Ig的性质.将C57BL6/J(H-2b)小鼠的脾细胞经尾静脉注射入亚致死剂量照射的BALB/c(H-2d)小鼠体内建立急性GVHD模型,通过体内注射CD40-Ig融合蛋白评价其对急性GVHD小鼠的保护效果.结果按上述方法分别构建了哺乳动物表达载体pIG/40Ig和p3.1/40Ig.ELISA 和Western blot确定在COS-7和CHO细胞中表达了CD40-Ig融合蛋白.SDS-PAGE结果显示该蛋白具有通过二硫键结合的二聚体结构并以同源二聚体的形式存在.纯化的CD40-Ig可与CD40L结合.体内应用CD40-Ig融合蛋白治疗可延缓小鼠GVHD病情发展并显著延长小鼠的平均存活时间.结论我们的结果证明CD40/CD40L相互作用在GVHD的病理过程中可能起到了十分重要的作用,提示人CD40-Ig融合蛋白在临床预防和治疗GVHD方面的巨大应用潜力.     

协同刺激分子CD28/B7及CD40/CD40L在哮喘特异性免疫治疗中的作用

目的探讨协同刺激分子CD28／B7—1、CD28／B7—2及CD40／CD40L在哮喘发病中的作用及在特异性免疫治疗前后表达水平的变化。方法选择30例哮喘患者为实验组，30例健康人群为对照组。采用流式细胞仪方法比较两组间T、B淋巴细胞表面CD28／B7—1、B7—2及CD40／CD40L的表达及与血清总IgE水平的相关性，以及哮喘患者特异性免疫治疗前后T、B淋巴细胞表面CD28／B7—1、B7—2及CEl40／CEl40L的表达水平。结果与健康人群相比，哮喘患者CD28、CD40L、B7—2及CD40表达水平均增高。血清总IgE水平与T淋巴细胞表达CD40L水平呈正相关。特异性免疫治疗6个月后，哮喘患者T、B淋巴细胞表达的CD28／B7—2及CD40／CD40L水平均有所下调，但均未达正常水平。结论协同刺激分子CD28／B7—2及CD40／CD40L表达水平的上调在哮喘发病中可能起重要作用，特异性免疫治疗能下调哮喘患者CD28／B7-2及CD40／CD40L的表达水平，并可能由此间接下调血清总IgE水平，起到相应的治疗作用。     

急性冠脉综合征患者外周血单个核细胞CD40、CD40L的表达

目的 探讨外周血单个核细胞表达免疫介质细胞分化抗原40(CD40)及其配体CD40L与急性冠脉综合征(ACS)的关系.方法 采用间接免疫荧光流式细胞术和酶联免疫吸附法(ELISA)测定ACS组(23例)、稳定性心绞痛(SA)组(16例)和对照组(15例)3组外周血单个核细胞表达CD40、CD40L和血清C-反应蛋白(CRP)水平.结果 ACS组外周血单个核细胞表达CD40平均荧光强度(MFI)19.12±4.96明显较SA组9.99±2.55和对照组11.50±2.21高,3组相比差异有统计学意义(F=34.137,P＜0.05).ACS组CD40L MFI 0.21±0.27与SA组0.10±0.18、对照组0.19±0.25相比差异无统计学意义(F=1.047,均P＞0.05).ACS组血清CRP水平(12.07±15.83)mg/ml与SA组(1.58±1.19)mg/ml、对照组(1.43±1.10)mg/ml相比差异有统计学意义(F=3.854,P＜0.05).CD40与CRP之间呈显著相关性(r=0.406,P＜0.05).结论 ACS患者外周血单个核细胞CD40表达增高,可能是冠状动脉粥样硬化病变活动性的血清学标志物.     

CD40与其配体的连接对于肺癌细胞调节功能的研究

目的 研究CI40与其配体(CD40L)的连接对于肺癌细胞的调节功能,评价CI40作为治疗靶抗原的潜能。方法 通过基因克隆技术、Western蛋白印迹、流式细胞术等研究CD40L对于7株肺癌细胞系(包括1例转染CD40 cDNA细胞系)的细胞表型、细胞生长、细胞周期和凋亡的影响。结果 CD40L使高表达CI40的肺癌细胞系上主要组织相容性抗原—Ⅰ类分子(MHC—Ⅰ)、CD54和Fas分子的表达增强,上皮生长因子受体(EGFR)的表达减弱;CD40L作用5d后,CD54平均荧光强度(mean值)大约上调了4—10倍,MHC—Ⅰ上调了4—8倍,Fas上调了2．7—6倍,EGFR下调了2—3倍。细胞生长受到抑制,第5天受抑最明显(受抑率≥30％);CD40L停用后,这些变化有所恢复;CD40L对于CD40中低表达和不表达的细胞系无明显影响;所有细胞系均无凋亡发生。结论 CI40高表达肺癌细胞上CI40的表达具有免疫导向治疗靶抗原的潜能。     

细胞因子对人单核/巨噬细胞表达CD40和CD40L的影响

目的：探讨细胞因子在γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF）和白介素-1（IL-1）对人单核/巨噬细胞表达CD40和CD40L的影响。方法：应用RT-PCR方法半定量测定CD40和CD40LmRNA含量,流式细胞技术检测细胞表面CD40和CD40L表达水平。结果：IFN-γ,TNF和IL-1既增加CD40和CD40LmRNA表达,又能诱导单核/巨噬细胞表面CD40和CD40L高表达,而抗氧化剂VitE能下调细胞因子引起的CD40和CD40L表达,但作用不完全,结论：细胞因子（IFN-γ,TNF和IL-1）能刺激单核/巨噬细胞高表达CD40和CD40L,这种作用可被VitE部分抑制。     

Expression of CD40 and CD40L on Peripheral Blood Mononuclear Cells in Patients with Condyloma Acuminatum

The initiation,development and transforma-tion of condyloma acuminatum(CA)bear a closerelation to the cellular i mmune function ofhost[1-3].The CD40and CD40ligands,a couple ofi mportant costi mulatory molecules of the specifici mmune systemin vivo,play an i mportant role inthe activation of Tlymphocytes and the secretionof effective cytokines.To obtaintheinformation a-bout the expression level and explore the clinicalsignificance of CD40and CD40L on peripheralblood mononuclear cells(PMBC…     

儿童慢性特发性血小板减少性紫癜CD40及CD40L的表达和意义

目的研究CD40、CIMOL在儿童慢性特发性血小板减少性紫癜（cITP）中的表达及其临床意义。方法应用流式细胞术检测30例cITP患儿治疗前后及30例对照组儿童外周血单个核细胞中CIM0及CD40L的表达情况,用ELISA法检测血小板抗体（PAIgG）。结果与对照组比较,cITP患儿CD40和CIMOL治疗前后的表达均增高（P〈0．05）,CD40治疗前高于治疗后（P〈0．05）,CD40L在两组的表达差异无统计学意义（P〉0．05）;CD40、CD40L的表达与PAIgG均呈正相关（r分别为0．708、0．772,P〈0。01）。结论cITP患儿外周血单个核细胞CD40及CD40L表达增高,常规治疗后CD40较治疗前降低,CD40L在两组的表达差异无统计学意义,表明CD40、CD40L在儿童cITP发病机制中可能起着重要作用,阻断此共刺激途径可能会取得更好的治疗效果。     

大鼠心脏移植排斥反应过程中外周血CD28、CD40通路相关分子的变化

目的探讨CD28、CD40共刺激通路与排斥反应的关系,同时也为排斥反应的诊断寻找一种新的检测指标。方法采用大鼠异位心脏移植模型,用免疫组化方法动态检测外周血单核细胞（PBMC）CD28、CTLA4、CD40及CD40L分子的表达。结果在0～4级排斥反应中,外周血细胞CD28分子阳性表达率在各组间的差异无统计学意义。外周血细胞表达CTLA4分子的阳性率随排斥反应增强而升高（P〈0.01）。CD40及CD40L在PBMC中的表达强度也随排斥反应的分级逐渐增强（P〈0.01）。结论外周血CTLA4、CD40及CD40L分子的表达与排斥反应有密切关系,动态检测这些分子有助于对排斥反应状态的评价。     

CD40配体诱导小鼠B淋巴瘤细胞分化抑制因子3下调表达的研究

目的：研究CD40配体（CD40L）对小鼠未成熟B淋巴瘤细胞（WEHI-231细胞）分化抑制因子3（Id3）表达的影响。方法：用RT-PCR技术从WEHI-231细胞总RNA中扩增小鼠Id3（mid3）cDNA，将其亚克隆至p3FLAG-CMV-10载体；以p3FLAG-Id3-CMV-10为模板，用PCR扩增3FLAG—Id3融合基因，将其亚克隆至逆转录病毒载体pMX—CITE／IRES—EGFP中；通过脂质体转染技术将重组逆转录病毒载体（pMX-3FLAG—Id3-EGFP）转染Phoenix-ecotropic包装细胞系；将pMX-3FLAG-Id3-EGFP逆转录病毒转导WEHI-231细胞，转导48h后的WEHI-231细胞与CD40L／NIH333和NIH333细胞共培养24～48h。转导细胞经有限稀释法建立ndd3基因稳定转染细胞系。mlar3基因稳定转染细胞与CD40L／NIH333和NIH333细胞共培养24h后，用Western blot法检测3FLAG-mid3融合蛋白的表达。结果：pMX-3FLAG-Id3-EGFP转导WEHI-231细胞后，EGFP阳性细胞比例随时间呈下降趋势；单独用培养液培养或与NIH333细胞共培养的pMX-3FLAG-Id3-EGFP／WEH1-231细胞，24～48h后，EGFP阳性细胞率呈逐渐下降趋势；而与CD40L／NIH333细胞共培养的pMX-3FLAG-Id3-EGFP／WEHI231细胞，EGFP阳性细胞率基本保持不变。稳定表达3FLAG-Id3融合蛋白的WEHI-231细胞与CD40L／NIH313和NIH333细胞共培养24h后，Western blot结果显示，CD40L刺激可明显抑制3FLAG—Id3-EGFP／WEHI-231中Id3的表达。结论：CD40L可能通过对Id3的降解而缓解Id3诱导的细胞生长抑制作用。