Beclin-1、P62、LC3B在肺炎链球菌感染小鼠肺部中的表达变化

目的：探讨自噬相关蛋白Beclin-1、P62及微管相关蛋白轻链3B（microtubule-associated protein light chain 3B,LC3B）在肺炎链球菌感染小鼠肺部中的表达及意义。方法：生长至对数生长期的肺炎链球菌标准株D39用无菌PBS调节浓度为1.5×109 CFU/mL,采用鼻滴的方法对50只SPF级雌性Balb/c鼠（6~8 周,16~20 g）进行处理,分别在感染后0、6、12、24、48 h收集Balb/c小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）及肺组织,瑞氏-吉姆萨染色进行BALF细胞计数,HE染色观察肺组织病理学改变,Western blot 检测自噬相关蛋白Beclin-1、P62、LC3B在肺组织中的表达水平,免疫荧光观察LC3B在肺组织中的表达情况。结果：HE染色显示,小鼠鼻饲肺炎链球菌后12 h及24 h后肺组织内出现大量炎症细胞浸润。BALF中总细胞数量及中性粒细胞数量于感染后6 h开始增高[（1.280±0.506） vs. （6.272±1.312）,P=0.000;（0.000±0.000） vs. （3.456±1.308）,P=0.000],在12 h时达到高峰[（1.280±0.506） vs. （19.456±0.997）,P=0.000;（0.000±0.000） vs. （15.040±1.012）,P=0.000],48 h后基本恢复正常水平[（1.280±0.506） vs. （3.520±0.933）,P=0.005;（0.000±0.000） vs. （0.128±0.175）,P=0.835]。Western blot结果显示：自噬相关蛋白Beclin-1于感染后6 h开始增加[（0.626±0.078） vs. （0.921±0.093）,P=0.002],48 h时达到最高水平[（0.626±0.078） vs. （1.884±0.158）,P=0.000];自噬相关蛋白P62于感染后6 h开始减少[（2.915±0.094） vs. （2.275±0.269）,P=0.000],48 h时降低至最低水平[（2.915±0.094） vs. （1.178±0.142）,P=0.000];自噬相关蛋白LC3B于感染后12 h开始升高[（0.747±0.197） vs. （1.429±0.318）,P=0.006],24 h时达到高峰[（0.747±0.197） vs. （2.002±0.451）,P=0.000],48 h后降低[（0.747±0.197） vs. （1.563±0.501）,P=0.002]。免疫荧光显示：小鼠感染后12 h与24 h,肺组织中LC3B蛋白表达水平增加。结论：肺炎链球菌感染小鼠肺部后激活自噬的发生,且自噬在免疫调节过程中发挥着重要作用。     

抑制大鼠脑缺血再灌注损伤中GSK-3β活性对自噬的影响及可能机制

目的：探讨大鼠缺血再灌注损伤中抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β）后对自噬的影响及如何通过酵母自噬启动ATG1激酶同源蛋白（Unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1）影响自噬的机制。方法：实验选取SD大鼠为研究对象,分为假手术组（Sham 组,仅结扎颈内动脉）、缺血再灌注组（MCAO 组,大脑中动脉栓塞术制备局灶脑缺血再灌注模型）、GSK-3β干扰片段组（siGSK-3β组,建模前24 h注射GSK-3β干扰片段）、GSK-3β无意义序列组（ConsiGSK-3β组,建模前24 h注射无意义序列）、GSK-3β抑制剂组（SB216763组,建模前6 h注射抑制剂SB216763）,每组5只。免疫印迹检测大脑皮质酪氨酸216号位点磷酸化GSK-3β[GSK-3β（P-tyr216）]、自噬相关蛋白轻链3抗体Ⅰ/Ⅱ（autophagy microtubule-as－sociated protein light chain 3 antibodyⅠ/Ⅱ,LC3BⅠ/Ⅱ）、泛素结合蛋白（sequestosome 1,P62）、磷酸化ULK1（phosphorylated ULK1,P-ULK1）、乙酰化ULK1（acetylated ULK1,AcK）的表达,电镜显示自噬体数量。结果：与Sham组比较,MCAO组中GSK-3β（P-tyr216）增高（P=0.000）。siGSK-3β、SB216763组相较MCAO组,LC3BⅡ/LC3BⅠ升高（P=0.000）、P62表达下降（P=0.000）、P-ULK1表达增高（P=0.000）、AcK表达下降（SB216763：P＜0.05;siGSK-3β：P＜0.01）,电镜可见自噬小体。结论：在脑缺血再灌注损伤中,GSK-3β活性抑制后可通过磷酸化ULK1增强细胞自噬。     

颅脑创伤后大鼠脑组织自噬表达变化及渥曼青霉素保护作用的研究

目的探索颅脑创伤后大鼠脑组织自噬表达变化及渥曼青霉素的保护作用,为临床治疗脑外伤提供实验依据。方法将120只健康成年雄性SD大鼠随机分为3组[假手术组（A组）、颅脑创伤组（B组）、渥曼青霉素治疗组（C组）],每组40只。B、C组使用PinPointTM精密颅脑创伤撞击器、直径4mm的打击头制作中度创伤性脑损伤模型,其中C组于建模前10min侧脑室注入渥曼青霉素（0.5滋g/kg）,B组注入含有二甲基亚砜（DMSO）的PBS（25滋l/kg）;A组暴露硬脑膜但不撞击,建模前注入含有DMSO的PBS（25滋l/kg）。采用Westernblot检测自噬相关蛋白（LC3-Ⅱ,p62）表达水平,应用大鼠行为学评分观察大鼠颅脑创伤后神经功能的变化,采用干湿法检测脑组织含水量。结果与A组相比,B组和C组大鼠在颅脑创伤后24、72、168h脑组织LC3-Ⅱ表达水平增加,p62表达水平减少,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与B组相比,C组大鼠在颅脑创伤后24、72、168h脑组织LC3-Ⅱ表达水平减少,p62表达水平增加,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;伤后72、168h脑组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低（均P＜0.05）。颅脑创伤后48、72h,C组大鼠行为学评分均高于B组（均P＜0.05）。颅脑创伤后72h,B组和C组脑组织含水量均较A组明显增加（均P＜0.05）,但C组较B组明显减少（P＜0.05）。结论渥曼青霉素能明显抑制颅脑创伤后过度的自噬反应,减轻脑水肿,改善大鼠神经功能。     

溶酶体膜蛋白Sidt2缺失导致肝脏细胞自噬受损

目的 研究溶酶体膜蛋白Sidt2缺失后对肝脏自噬的影响。方法 利用Crispr-Cas9技术构建Sidt2敲除的人肝脏（HL7702）细胞模型,对自噬关键蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62及自噬相关蛋白Atg5、Atg7、Atg12进行蛋白水平检测,同时使用免疫荧光方法对LC3B及P62进行共定位,检测自噬小体对P62货物蛋白的识别与封存以及自噬溶酶体的降解。对LC3B及LAMP1进行免疫荧光共定位,检测自噬小体与溶酶体融合过程。使用LysoTracker对酸性溶酶体进行示踪。结果 成功构建HL7702细胞Sidt2+/+组 及Sidt2-/-组,HL7702细胞Sidt2-/-组较Sidt2+/+组相比,自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ及P62表达均增多（P<0.01）,免疫荧光结果显示LC3B及P62亦明显增多（P<0.001）,同时自噬相关蛋白Atg5、Atg7、Atg12表达减少（P<0.05）。LC3B与P62共定位降低,LC3B 与LAMP1共定位降低,酸性溶酶体数量减少（P<0.05）。结论 Sidt2基因的缺失导致人肝脏细胞自噬小体对P62货物蛋白的识别和封存障碍,同时酸性溶酶体数量减少、自噬小体与溶酶体融合障碍导致自噬溶酶体途径受阻,最终导致LC3B与P62发生堆积,肝脏细胞自噬受损。     

自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的：探讨自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞株（HK-2）凋亡中的作用。方法：培养HK-2细胞,根据培养环境氧浓度不同分为对照组（21%O2）和低氧组（1%O2）;根据低氧培养时间不同,低氧处理细胞进一步分为：低氧6 h亚组、低氧12 h亚组、低氧18 h亚组和低氧24 h亚组。Western blot检测HK-2细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和凋亡相关蛋白活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cleaved-caspase3）表达水平,流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡情况;采用低氧诱导稳定表达GFP-LC3的HK-2细胞18 h,在荧光显微镜下观察GFP-LC3自噬小体的变化;进一步采用低氧联合自噬诱导剂雷帕霉素（ra－pamycin,RP）或自噬抑制剂巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1,BAfA1）处理HK-2细胞,细胞分为常氧对照组、常氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组、低氧对照组、低氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组。Western blot检测Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和cleaved-caspase3表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：与对照组（0.161±0.043）相比较,低氧12 h[（0.315±0.060）,P=0.019]、18 h[（0.586±0.063）,P=0.000]、24 h[（0.698±0.085）,P=0.000]亚组HK-2细胞cleaved-caspase3蛋白表达明显增多;低氧12 h、18 h、24 h亚组HK-2细胞凋亡率分别为（23.633±5.346）%、（25.200±4.782）%、（38.567±8.046）%,较对照组（11.800±3.966）%明显增多（P=0.036,P=0.021,P=0.000）。同时,低氧18 h、24 h亚组HK-2细胞表达Beclin1蛋白[（0.557±0.071）,（0.897±0.074）[较对照组（0.249±0.040）明显上调（P=0.001,P=0.000）;低氧6 h、12 h、18 h、24 h亚组细胞表达LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白[（1.795±0.143）,（2.873±0.078）,（3.029±0.089）,（3.735±0.059）]较对照组（1.322±0.191）明显上调（P=0.036,P=0.000,P=0.000,P=0.000）;细胞表达自噬底物P62蛋白[（0.776±0.061）,（0.602±0.119）,（0.419±0.117）,（0.384±0.068）]较对照组（0.957±0.035）明显下调（P=0.028,P=0.001,P=0.000,P=0.000）;低氧组细胞GFP-LC3斑点计数相对值为（40.667±6.028）,较对照组（18.667±5.508）明显增加（P=0.010）。雷帕霉素增加自噬后,低氧诱导的HK-2细胞凋亡（26.433±3.402）及cleaved-caspase3蛋白表达（0.265±0.066）较低氧对照组[（36.133±5.856）,（0.358±0.060）]明显减少（P=0.012,P=0.000）;巴弗洛霉素A1抑制自噬后,低氧诱导的HK-2细胞凋亡增多（49.233±3.412）及cleaved-caspase3蛋白表达（1.242±0.110）较低氧对照组[（25.933±3.650）,（0.659 ± 0.060）]明显增加（P=0.000,P=0.000）。结论：自噬在低氧诱导的HK-2细胞凋亡中起保护作用。     

PINK1/parkin介导的线粒体自噬在机械通气导致的膈肌功能障碍中的作用

目的：研究PTEN诱导激酶1（PTEN induced putative kinase 1,PINK1）/parkin介导的线粒体自噬在机械通气（mechani－cal ventilation,MV）导致的膈肌功能障碍和萎缩中的作用。方法：将24只成年雄性SD大鼠随机分成Control组（n=6）、MV-6h组（n=6）、MV-12h组（n=6）和MV-24h组（n=6）。Control组大鼠未经任何处理,MV-6h组大鼠机械通气6 h,MV-12h组大鼠机械通气12 h,MV-24h组大鼠机械通气24 h。采用RM6240生物信息采集系统测量膈肌复合肌动作电位（compound muscle action potential,CMAP）,HE染色测量膈肌肌纤维横截面积（cross-sectional area,CSA）,Western blot检测膈肌肌肉萎缩蛋白（muscle atrophy F-box,MAFbx）、肌肉特异性环指蛋白1（muscle specific ring finger 1,MURF1）、线粒体裂解蛋白1（dynamin-related pro－tein 1,drp1）、线粒体融合蛋白2（mitofusin-2,mfn2）、线粒体自噬相关蛋白PINK1、parkin、P62及微管相关蛋白轻链3（micro－tubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）水平。结果：MV-12h组[（3.15±0.52） mV]和MV-24h组[（2.44±1.26） mV]膈肌的CMAP幅值明显下降（P=0.000）;MV-24h组[（7.05±0.61） ms]膈肌的CMAP时程明显延长（P=0.000）;与Control组[（5 308.67±228.18） μm2]相比,MV-6h组[（3 378.33±393.40） μm2]、MV-12h组[（2 969.67±35.16） μm2]和MV-24h组[（2 115.33±130.23） μm2]膈肌的CSA均明显减少（P=0.000）;与Control组相比,MV-12h组（2.59±0.19）、MV-24h组（4.11±0.19）的MAFbx明显升高（P=0.000）,MV-12h组（1.96±0.26）、MV-24h组（2.88±0.29）的MURF1明显升高（P=0.000）;与Control组相比,drp1在MV-24h组（5.55±0.36）明显上升（P=0.000）,mfn2在MV-12h组（0.47±0.13）、 MV-24h组（0.35±0.10）明显降低（P=0.002）;与Control组相比,PINK1在MV-12h组（2.53±0.25）和MV-24h组（4.78±0.31）明显上升（P=0.000）,parkin在MV-24h组（3.73±0.16）明显上升（P=0.000）,P62在MV-12h组（2.28±0.06）和MV-24h组（3.69±0.17）明显上升（P=0.000）,LC3Ⅱ/Ⅰ比值在MV-24h组（1.57±1.32）明显上升（P=0.002）。结论：MV可以引起PINK1/parkin介导的线粒体自噬发生改变,并引起膈肌功能障碍和萎缩。     

电针对脑缺血再灌注大鼠自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达的影响

目的  观察电针对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的改善程度及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达的影响。方法  根据随机数字表法,将72只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组和电针组,每组24只。采用Longa线栓法建立改良的急性局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,并在缺血1 h后进行再灌注。参照改良的Zea Longa 8级神经功能缺损评分法对3组大鼠脑神经功能损伤程度进行评估。电针组于造模成功后5 min和16 h进行电针干预。于再灌注后24 h取材。TTC染色法观察各组大鼠脑梗死体积;HE染色法观察大鼠脑组织病理学变化;Western blot检测大鼠右侧纹状体脑组织中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达,qPCR检测Beclin1 mRNA表达。结果  对照组无行为学改变,模型组神经功能缺损评分显著高于对照组(P < 0.05);与模型组比较,电针组神经功能缺损评分明显低于模型组(P < 0.05)。电针组脑梗死体积较模型组明显减少(P < 0.05)。与模型组比较,电针组LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达明显增加(P < 0.05),Beclin1 mRNA的表达亦明显增加(P < 0.05)。结论  电针治疗可能通过促进自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表达,调控自噬的发生,减小大鼠脑梗死体积,改善神经功能缺损,实现对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护效应。      

Vaspin对棕榈酸诱导的INS-1细胞自噬水平的影响

目的：研究脂肪细胞因子Vaspin对棕榈酸诱导的INS-1细胞自噬水平的影响。方法：培养INS-1细胞,分为正常组：用普通培养基培养24h;棕榈酸（palmiticacid,PA）组：以0.5mmol/LPA培养24h;PA+Vaspin组：先加入320ng/mLVaspin预培养2h,再以0.5mmol/LPA+320ng/mLVaspin共培养24h;PA+Vaspin+雷帕霉素（rapamycin）组：先以50nmol/LRapamycin预培养2h,再以0.5mmol/LPA+320ng/mLVaspin共培养24h;PA+Vaspin+3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）组：先以1mmol/L3-MA预培养2h,再以0.5mmol/LPA+320ng/mLVaspin共培养24h。葡萄糖（3.3mmol/L和16.7mmol/L）刺激胰岛素分泌实验检测各组胰岛素分泌水平,Westernblot检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）、p-mTOR、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及P62蛋白水平,mRFP-GFP-LC3检测自噬流水平,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果：与正常组相比,PA组INS-1细胞上清液中胰岛素分泌水平在3.3mmol/L葡萄糖和16.7mmol/L葡萄糖刺激下均降低[（1.02±0.08）ng/mLvs.（0.54±0.06）ng/mL,P=0.000;（1.15±0.13）ng/mLvs.（0.71±0.05）ng/mL,P=0.000）],PA+Vaspin组较PA组升高[（0.76±0.03）ng/mLvs.（0.54±0.06）ng/mL,P=0.001;（0.91±0.04）ng/mLvs.（0.71±0.05）ng/mL,P=0.011）];与正常组相比,PA组INS-1细胞p-mTOR与mTOR蛋白比值低（2.04±0.14vs.1.19±0.09,P=0.000）,PA+Vaspin组p-mTOR与mTOR蛋白比值较PA组高（1.51±0.05vs.1.19±0.09,P=0.005）;同时,PA组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与正常组相比明显增加（0.81±0.07vs.0.65±0.04,P=0.005;2.35±0.25vs.1.16±0.11,P=0.000）,P62蛋白水平降低（1.04±0.19vs.0.60±0.08,P=0.000）;PA+Vaspin组Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平较PA组低（0.58±0.04vs.0.81±0.07,P=0.001;1.95±0.08vs.2.35±0.25,P=0.007）,P62蛋白增加（0.82±0.03vs.0.60±0.08,P=0.032）;PA组自噬溶酶体数量较正常组多（8.33±1.53vs.0.33±0.58,P=0.000）,Vaspin干预后降低（3.67±1.53vs.8.33±1.53,P=0.001）;同时,PA干预INS-1细胞24h后细胞凋亡明显增加（7.91±0.50vs.22.15±2.05,P=0.000）,PA+Vaspin组较PA组细胞凋亡减少（13.23±1.97vs.22.15±2.05,P=0.000）。结论：Vaspin能够改善棕榈酸诱导的INS-1细胞过度自噬和细胞凋亡,改善胰岛β细胞分泌功能。     

缺血再灌注损伤诱导心肌细胞自噬相关基因过表达

目的探讨缺血再灌注(IR)损伤对心肌细胞自噬相关基因(autophagy-related gene,Atg)表达的影响。方法成年雄性SD大鼠随机分为2组:对照组(假手术组),于左前降支(left anterior descending,LAD)下方穿过5-0丝线,不结扎;缺血再灌注损伤组:结扎LAD,45 min后松结扎线再灌注120 min。利用RT-PCR方法,检测各组心肌Beclin 1和Atg5mRNA表达;应用蛋白质印迹分析法检测心肌LC3蛋白表达变化。结果缺血再灌注损伤后心肌Beclin 1和Atg5 mRNA表达较对照组升高,分别达到对照组的2.45和1.6倍,差异具有统计学意义(P<0.05);LC3-Ⅱ蛋白表达增加,IR后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值较对照组升高(1.4 vs 0.2,P<0.01)。结论缺血再灌注损伤可以诱导心肌细胞Atg家族表达增加,促进自噬的发生,导致心肌损害。     

3-methyladenine下调自噬对脑缺血再灌注损伤的影响

目的 探讨自噬对脑缺血再灌注损伤的影响。方法 将CD-1小鼠随机分为假手术组和缺血再灌注(t-MCAO)模型组,模型组分别在6、12、24和48h处死小鼠取脑,用Western blot半定量检测再灌注后缺血侧/左侧皮层,海马和纹状体中LC3Ⅱ蛋白的表达变化；随后将小鼠随机分为3-methyladenine(3-MA)(2、10、50mM)组和盐水对照组,两组都用线拴法建立t-MCAO模型,用Western blot检测不同浓度的3-MA对缺血再灌注后24h的LC3Ⅱ蛋白的表达影响,并用TTC染色观察3-MA(10mM)组和PBS对照组缺血再灌注后24h的梗死体积。 结果 缺血再灌注后缺血侧的LC3Ⅱ蛋白表达升高,在海马和皮层区,与假手术组相比24h升高最为明显并且差异有统计学意义(P<0.05)； 3-MA(10mM)时可明显下调自噬,并且与盐水对照组相比能显著减少梗死体积(P<0.001)和水肿程度(P<0.01)。结论 自噬的下调对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用。     

二氢杨梅素调控自噬抑制氧化低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究

目的观察二氢杨梅素（DMY）对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的影响,并探讨自噬在其中的作用。方法DMY（0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L）预处理HUVECs 2 h,用100.0 mg/L ox-LDL 继续培养细胞24 h。以辛伐他汀作为阳性对照组。采用噻唑蓝法检测细胞活力,Hoechst33258染色观察细胞核形态,透射电镜观察自噬体,Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）、Beclin-1和p62/SQSTM1的表达,观察自噬抑制剂对DMY作用的影响。结果与对照组比较,ox-LDL组细胞的存活率降低（p <0.05）,细胞核呈集中高强度蓝色荧光,固缩致密浓染或碎块状致密浓染,颜色发白,细胞核较小,形态不规则,自噬体和自噬溶酶体数量增加;Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调,而p62的表达下调（p <0.05）。与ox-LDL组比较,0.1、1.0和10.0μmol/L DMY预处理组细胞存活率均升高;细胞核荧光强度降低,核固缩致密浓染和碎块状致密浓染减少,形态较规则;1.0 μmol/L DMY 预处理组的自噬体和自噬溶酶体数量增加;Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调,而p62 的表达下调（p <0.05）。自噬抑制剂3-MA 部分抵消DMY 抑制ox-LDL诱导的HUVECs 存活率降低（p <0.05）。结论DMY 能抑制ox-LDL诱导的HUVECs 损伤,其机制与诱导自噬有关。     

脑缺血再灌注不同时间对大鼠海马神经元自噬及PI3K/mTOR通路的影响

目的：探讨脑缺血再灌注不同时间对大鼠海马神经元自噬及PI3K/mTOR通路的影响。方法：72只大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注组（分别再灌0、6、12、24、36 h）,每组12只。采用四血管阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。神经功能缺损评分评价大鼠海马神经功能,HE染色检测大鼠海马神经细胞损伤,透射电镜下观察海马神经元内自噬小体,Western blot检测Beclin-1、LC3 II、p62、p-PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白表达。结果：与假手术组比,随着脑缺血再灌注的时间延长,脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积、自噬小体数量均增加（均P＜0.05）;随着脑缺血再灌注的时间延长,大鼠海马组织自噬相关蛋白Beclin-1和LC3 II表达显著上调、p62表达下调（P＜0.05）;PI3K/mTOR通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表达显著下调（P＜0.05）。结论：脑缺血再灌注可增强大鼠海马神经元自噬,抑制PI3K/mTOR信号通路。     

姜黄素通过提高Rab家族蛋白的表达增强N2a/APP695swe细胞的自噬作用

目的：研究姜黄素（curcumin）对N2a/APP695swe细胞中自噬和Rab家族蛋白的影响,并且探讨姜黄素调节N2a/APP695swe细胞自噬的可能机制。方法：采用N2a/WT和N2a/APP695swe细胞,并将其分为4个组：N2a/WT组（WT组）、N2a/APP695swe组（APP组）、DMSO溶剂对照组（DMSO组,5 μmol/L,24 h）、curcumin处理组（curcumin组,5 μmol/L,24 h）。Western blot分别检测各组自噬标志性蛋白LC3BⅡ和底物蛋白SQSTM1的表达,以及Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7、Rab9、Rab24和Rab33B的表达;共聚焦显微镜观察免疫荧光进一步验证各组LC3BⅡ与SQSTM1蛋白的表达情况。结果：Western blot结果表示,curcumin组LC3BⅡ蛋白表达量明显高于APP组和DMSO组（0.54±0.02 vs. 0.29±0.09,0.54±0.02 vs. 0.29±0.09,P=0.000）;同时,curcumin组SQSTM1蛋白表达量则明显低于APP组（0.67±0.01 vs. 1.02±0.02,P=0.000）。共聚焦显微镜观察免疫荧光实验再次验证了LC3B和SQSTM1蛋白的这种表达趋势。Western blot进一步检测发现,与APP组相比,curcumin组Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7和Rab33B的蛋白表达量均明显增加（1.00±0.02 vs. 0.63±0.02,P=0.000;0.94±0.03 vs. 0.79±0.03,P=0.000;0.75±0.00 vs. 0.56±0.01,P=0.000;0.88±0.04 vs. 0.59±0.03,P=0.000）,而Rab9和Rab24的改变差异无统计学意义（1.04±0.02 vs. 1.06±0.02,P=0.578;0.79±0.00 vs. 0.80±0.00,P=0.067）。结论：姜黄素提高N2a/APP695swe细胞的自噬水平,其机制可能与增强Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7和Rab33B的表达有关。     

二甲双胍促进AMPK、TFEB表达改善自噬减轻大鼠脑缺血再灌注损伤

目的:探究二甲双胍(Met)对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响及机制。方法:建立大鼠脑缺血再灌注模型，随机分为假手术组、缺血再灌注组、Met预处理组[造模前3周腹腔注射Met 100 mg/(kg·d)],TTC染色检测各组大鼠脑梗死体积改变，HE染色观察脑组织病理变化；蛋白免疫印迹法检测各组大鼠脑组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62等自噬相关蛋白以及AMP活化蛋白激酶(AMPK)、p-AMPK(Thr172)、转录因子EB(TFEB)相关通路蛋白含量。结果:与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠脑组织病理损伤严重，脑梗死体积增高(P<0.001);与缺血再灌注组相比，Met预处理组大鼠脑梗死体积减少(P<0.01),脑组织病理损伤减轻。与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白水平表达减少(P<0.05),p62蛋白表达增多(P<0.001);与缺血再灌注组相比，Met预处理组大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达均增多(P<0.05),p62蛋白表达减少(P<0.01);与假手术组相比，缺血再...     

后适应对大鼠脑缺血再灌注后自噬相关基因表达的影响

目的探究缺血再灌注及缺血后适应后自噬相关基因的表达水平及变化趋势,以及相关作用。方法49只SD成年雄性大鼠随机分为假手术组(Sham组),缺血再灌注组(3、6、24 h亚组),缺血后适应组(3、6、24 h亚组)。于线栓拔除后3、6、24 h后取材进行TTC染色,Western检测Beclin 1、LC3Ⅱ表达,免疫组化检测神经元上Atg5、Atg7表达。结果 (1)缺血后适对神经元的作用在3 h时保护作用不明显(P=0.281),24 h时保护作用最明显(P=0.002);(2) 24 h时,缺血后适应可以有效减小梗死面积(P=0.005 3);(3)与Sham组相比,缺血再灌注和后适应均可诱导Beclin 1、LC3Ⅱ、Atg5、Atg7表达的增加(P <0.05)。24 h后适应能够有效抑制Beclin 1 (P=0.022)、LC3Ⅱ (P=0.039)的表达。而后适应在3 h时明显抑制Atg5的表达(P=0.007),在6 h时开始抑制Atg7的表达(P=0.019)。结论缺血再灌注加重神经元的损伤,有明显的时间依赖性。而缺血后适应在3 h时神经保护作用不明显,随时间延... 更多     

通络清脑注射粉针对脑缺血-再灌注损伤大鼠的脑保护作用及神经元自噬相关蛋白表达的影响研究

背景　细胞自噬所致神经元凋亡是脑缺血后神经损伤的重要环节,而以通络清脑注射粉针为代表的清热解毒通络疗法在只辨病、不辨证的情况下治疗大鼠脑缺血亦能取得良好疗效,因此推测通络清脑注射粉针发挥脑保护作用的机制很可能与抑制细胞自噬有关。目的　探讨通络清脑注射粉针对脑缺血-再灌注损伤大鼠的脑保护作用及神经元自噬相关蛋白表达的影响。方法　本实验于2019年1月-2020年3月实施,共选取SPF级成年雄性SD大鼠36只,编号后采用随机数字表法分为假手术组、模型组、通络清脑组,每组12只。采用线栓法制备大鼠脑缺血-再灌注损伤模型（假手术组大鼠只进行血管分离、不进行其他操作）,通络清脑组大鼠经尾静脉缓慢推注浓度为18.75 mg/ml的通络清脑溶液3.2 ml/kg,假手术组、模型组大鼠经尾静脉注射等体积0.9%氯化钠溶液。比较三组大鼠建模24 h后神经功能学评分、脑梗死体积占比及再灌注24 h后海马区神经元损伤情况、海马区和皮质区自噬体形成情况、海马区神经元自噬相关蛋白〔包括磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）、Beclin1、自噬微管相关蛋白1轻链3（LC3）〕表达情况。结果　模型组、通络清脑组大鼠建模24 h后神经功能学评分、脑梗死体积占比高于假手术组,而通络清脑组大鼠建模24 h后神经功能学评分、脑梗死体积占比低于模型组（P<0.05）。再灌注24 h后假手术组大鼠海马区神经元未见明显坏死、海马区和皮质区均偶见自噬体,模型组大鼠海马区缺血区神经元结构破坏严重、大量神经元丢失且海马区和皮质区均可见双层膜结构自噬体,通络清脑组大鼠海马区缺血区神经元坏死范围较模型组缩小、神经元损伤明显缓解且海马区和皮质区自噬体数量均减少。再灌注24 h后模型组、通络清脑组大鼠海马区p-NF-κB、LC3相对表达量及模型组Beclin1相对表达量高于假手术组,而通络清脑组大鼠海马区p-NF-κB、Beclin1、LC3相对表达量低于模型组（P<0.01）。结论　通络清脑注射粉针可有效改善脑缺血-再灌注损伤大鼠神经功能,减轻脑梗死程度、神经元损伤,减少自噬体形成及神经元凋亡,抑制神经元自噬相关蛋白p-NF-κB、Beclin1、LC3的表达,其发挥脑保护作用的机制可能与抑制神经元过度自噬有关。     

氯喹抑制的自噬对地西他滨促进髓性白血病细胞凋亡的影响

目的：研究氯喹与地西他滨联合应用对白血病K562和KG-1a1Aor1a细胞凋亡的影响,探讨自噬对地西他滨诱导白血病细胞凋亡的作用,阐明其作用机制。方法：体外培养髓性白血病K562和KG-1a1Aor1a细胞,分为空白对照组、地西他滨（10 μmol·L^-1）单用组和氯喹（50 μmol·L^-1）联用地西他滨组（联用组）。联用组细胞使用氯喹孵育6 h后再与其他组细胞同时开始实验。孵育24及48 h后,CCK-8法检测细胞数量并计算增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位。Q-PCR法检测Atg7及Atg12基因表达水平,Western blotting法检测LC3蛋白表达。结果：孵育24及48 h后,与空白对照组比较,地西他滨和联用组K562和KG-1a1Aor1a细胞数量数量明显减少（P < 0.05或P < 0.01）;凋亡率明显升高（P < 0.05或P < 0.01）,线粒体膜电势明显增加（P < 0.05或P < 0.01）;与地西他滨组比较,联用组K562和KG-1a1Aor1a细胞明显减少,细胞数量凋亡率明显升高（P < 0.05）。孵育24 h后,与空白对照组比较,地西他滨组K562和KG-1a1Aor1a细胞Atg7、Atg12和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达水平明显升高（P < 0.05或P < 0.01）;与地西他滨组比较,联用组K562和KG-1a1Aor1a细胞Atg7、Atg12和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达水平明显降低（P < 0.05或P < 0.01）。结论：地西他滨具有促进白血病细胞凋亡的作用,而联用氯喹可以抑制自噬从而增强地西他滨诱导细胞凋亡的作用。     

Apelin-13对脑缺血再灌注损伤作用的初步研究

目的:研究Apelin-13对缺血/再灌注小鼠脑损伤的作用,并初步探讨其对自噬性细胞死亡的影响。方法:取健康雄性CD-1小鼠,随机分为假手术(sham)组、生理盐水(Saline)组、Apelin组;Apelin组和Saline组首先建立脑缺血再灌注(MCAO/R)模型,再灌注即刻给予同侧侧脑室注射Apelin-13或等量生理盐水,然后在再灌注48 h后,进行神经功能方面检测,同时利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色评估脑梗死体积;缺血再灌注24 h和48 h后,采用West-blot法检测各组自噬相关蛋白LC3的表达情况。结果:Apelin-13可显著降低小鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损症状,减少脑梗死体积,减低自噬相关蛋白LC3的表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值。结论:Apelin-13对小鼠脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用,抑制神经细胞的自噬性死亡可能是其作用机制之一。     

雷公藤甲素调节佐剂关节炎大鼠滑膜、脾脏、胸腺组织细胞自噬的实验研究

目的观察雷公藤甲素（TP）对佐剂关节炎（AA）大鼠滑膜脾脏胸腺自噬相关基因（Atg）/自噬标记蛋白（LC3-Ⅱ）、Beclin1表达和血清细胞因子水平的影响。方法将大鼠随机分为4组:正常对照 (NC) 组,模型对照 (MC) 组,来氟米特（LEF）组,雷公藤甲素（TP）组,每组12只,后3组复制成AA大鼠模型。致炎后第13 d开始给药。NC组、MC组给予生理盐水灌胃,每天1 次;LEF组按5 mg/kg的剂量灌胃,每天1次;TP组按50 μg/kg的剂量,每天1次。连续给药30 d。观察大鼠关节及其病理形态学变化,ELISA法检测血清细胞因子B淋巴细胞刺激因子（BAFF）、白介素（IL）-1、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL- 15、IL-10表达,RT-PCR法检测大鼠滑膜、脾脏、胸腺组织 Atg5、 Atg7、 Atg12 mRNA,Western blot法检测大鼠滑膜、脾脏、胸腺组织LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达。结果 治疗后,TP组和LEP组大鼠足跖肿胀度（E）和关节炎指数较MC组降低。与NC组比较,MC组大鼠血清BAFF、IL-1、TNF-α升高,IL-15、IL-10降低,滑膜 Atg5、 Atg12mRNA降低,脾脏 Atg5mRNA降低,脾脏 Atg7、 Atg12mRNA及胸腺 Atg12mRNA升高,滑膜、脾脏、胸腺组织LC3-Ⅱ、Beclin1下降（P<0.05或0.01）。与MC组比较,TP组滑膜 Atg7、 Atg12 mRNA降低,脾脏 Atg5、 Atg7、 Atg12 mRNA及胸腺中 Atg5、 Atg7 mRNA降低, Atg12 mRNA升高;滑膜、脾脏、胸腺组织LC3-Ⅱ、Beclin 1升高（P<0.05）。与LEF组比较,TP组TNF-α、BAFF降低,E、IL-15升高（P<0.05或0.01）。TP组滑膜 Atg7mRNA及胸腺 Atg5、 Atg7 mRNA表达降低,胸腺 Atg12mRNA及脾脏 Atg5、 Atg7、 Atg12mRNA表达升高。结论TP通过调节滑膜、胸腺、脾脏组织细胞自噬,改善关节滑膜炎症反应。     

电针预处理通过抑制AMPK-Beclin1/Vps34通路介导的细胞自噬减轻脑缺血再灌注损伤

目的：探讨电针预处理治疗对大鼠脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤的影响及其相关机制。方法：将健康成年雄性SD大鼠75只随机分为Sham组,脑缺血再灌注组（I/R组）,电针预处理并缺血再灌注组（EA+I/R组）,脑纹状体感染AAV-VC（空载体病毒）后再给予电针预处理并缺血再灌注组（AAV-VC+EA+I/R组）和脑纹状体感染AAV-Beclin1（过表达Be－clin1病毒）后再给予电针预处理并缺血再灌注组（AAV-Beclin1+EA+I/R组）,每组15只大鼠。对各组大鼠脑中动脉梗死（middle cerebral artery occlusion,MCAO）术后1、2、3 d进行神经功能评分;在MCAO术后7 d处死大鼠,TTC染色以测定脑梗死体积;TUNEL染色法检测脑细胞凋亡状况;免疫印迹法检测自噬相关分子LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、AMPK和Beclin1的蛋白表达水平;免疫共沉淀检测Beclin1与Vps34的相互作用。结果：与Sham组相比,I/R组脑梗死体积与神经行为学评分明显增加（均P<0.05）。机制研究显示缺血再灌注后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加（P<0.05）,且自噬调控蛋白AMPK与Beclin1上调表达（均P<0.05）,Beclin1与Vps34复合物形成增多;与此同时,细胞凋亡数目明显增加。给予电针预处理后,上述指标均明显改善（均P<0.05）。而在电针预处理之前对自噬关键蛋白Beclin1进行脑内过表达可以逆转电针预处理对缺血脑损伤的保护作用（P<0.05）。结论：电针预处理可能通过抑制AMPK-Beclin1/Vps34通路减少自噬,发挥神经保护作用。