骨形态发生蛋白2／7异二聚体对人脂肪间充质干细胞成骨分化的促进作用

目的：探讨新型成骨诱导生长因子骨形态发生蛋白2/7异二聚体（bone morphogenetic protein 2/7 heterodimer,BMP-2/7）在诱导人脂肪间充质干细胞（human adipose-derived stem cells,hASCs）成骨分化中的作用。方法：体外培养hASCs,以成骨诱导培养基（osteogenic medium,OM）中添加150 μg/L BMP-2/7为实验组,以单纯OM为阳性对照组（OM组）, 以常规增殖培养基（proliferation medium,PM）为阴性对照组（PM组）。体外诱导的第1、4和7天检测细胞DNA含量,第7和14天进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色及定量检测,第21和28天进行茜素红染色及定量检测,第1、4、7和14天分别进行成骨相关基因的检测。体内实验使用6只裸鼠,于其背部正中做皮肤切口,向两侧分离出4个皮下植入腔,分别植入：（1）单纯β 磷酸三钙（β-tricalcium phosphate,β-TCP）支架（支架对照组）;（2）β-TCP支架+hASCs（体外PM培养1周）（增殖细胞对照组）;（3）β-TCP支架+hASCs（体外OM培养1周）（诱导细胞对照组）;（4）β-TCP支架+hASCs（体外OM+150 μg/L BMP-2/7培养1周）（实验组）。植入后4周进行取材,标本制成组织学切片,进行HE和Masson三色染色分析。结果：体外诱导后第1天,实验组细胞DNA含量与PM组差异没有统计学意义（P>0.05）,第4天时实验组细胞DNA含量较PM组升高（P<0.05）,第7天时组间DNA含量没有明显差异（P>0.05）。诱导7天和14天后,实验组的ALP染色及定量检测均高于OM组和PM组（P<0.05）;第21和28天矿化结节染色及钙沉积定量检测均高于OM和PM组（P<0.05）。诱导第1天时实验组的成骨相关基因（Runx2、ALP、COL-1A1）的表达量即高于PM组 (P<0.05),诱导第4天时骨钙素（osteocalcin,OC）基因表达量即开始升高,第4、7和14天的基因表达量较OM和PM组显著升高（P<0.05）。HE染色分析可见实验组和诱导细胞对照组的hASCs能分泌出嗜酸性较强的均质细胞外基质,出现了强嗜酸性的类骨组织;与诱导细胞对照组相比,实验组的细胞外基质嗜酸性更强,类骨组织的面积更大,结构更加典型;其他两对照组均未见矿化基质和类骨组织生成。Masson三色染色分析可见实验组呈强阳性表现,细胞基质中充满绿染的胶原;诱导细胞对照组和增殖细胞对照组的细胞基质中有不同程度的阳性表现,但较之实验组,胶原的数量明显减少;单纯支架组未见胶原的表达。结论：BMP-2/7在hASCs的成骨分化过程中发挥了重要作用,能够有效促进hASCs的体外和体内成骨分化。     

脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化和Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的 探讨脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields, PEMFs）对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）增殖、成骨分化以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法 将培养的第3代大鼠BMSCs分为3组。3个组均以LG-DMEM完全培养基培养1 d,待细胞贴壁后更换新鲜培养基,对照组不做干预处理; PEMFs组进行8 Hz、3.8 mT的PEMFs干预,每天40 min,持续21 d;成骨诱导基(OM)组加入成骨诱导剂,不予磁场干预。采用MTT法测定增殖活性;碱性磷酸酶（ALP）、茜素红S染色进行成骨分化鉴定;利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测Wnt/β-catenin信号通路及成骨分化相关基因的表达。结果 相较对照组,成骨诱导剂在干预第7、14、21 d可提高BMSCs的增殖活性（P<0.05）;PEMFs促增殖作用不明显。在BMSCs分化方面,PEMFs组及OM组ALP、茜素红S染色阳性强度均高于对照组（P<0.05）。定量RT-PCR结果显示,PEMFs组及OM组Wnt1、Wnt3a、LRP5、β-catenin、BMP-2、Runx2、ALP、OC mRNA的表达相较于对照组在相应时间点均有所上调（P<0.05）。PEMFs组各检测结果较OM组低,但趋势基本一致。结论 PEMFs在8 Hz、3.8 mT条件下可促进BMSCs的成骨分化,这可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。     

姜黄素促进大鼠骨髓间充质干细胞的体外增殖及成骨分化

目的：研究姜黄素对大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow mesenchymal stem cell,rBMSC）生物学行为的影响。方法：将含不同浓度梯度姜黄素溶液的完全培养基与rBMSC共培养,通过CCK?8法检测细胞增殖情况,确定姜黄素溶液的最适浓度;将rBMSC与4 μg/mL姜黄素共孵育,0 μg/mL姜黄素处理组作为对照,通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和活性检测评估其早期成骨分化水平;使用茜素红染色评估成骨分化晚期细胞外基质矿化情况;利用实时荧光定量逆转录PCR检测细胞成骨诱导7、14 d时成骨指标骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein?2,Bmp2）、核心结合因子α1（core binding factor alphal α1,Runx2）、骨钙素（osteocalcin,Ocn）、骨桥蛋白（osteopontin,Opn）、成骨细胞特异基因（osterix,Osx）的表达。结果：CCK?8结果显示含不同浓度姜黄素溶液的培养基中的rBMSC均能持续增殖,4 μg/mL姜黄素组对rBMSC增殖的促进作用最为显著（与对照组相比,P < 0.001）;ALP活性检测及染色结果显示姜黄素组细胞的ALP活性高于对照组（P < 0.001）;茜素红染色结果显示姜黄素组的细胞外基质矿化水平高于对照组;实时荧光定量逆转录PCR结果显示姜黄素组细胞的相关成骨基因Bmp2、Runx2、Ocn、Opn、Osx的表达均高于对照组（P < 0.05）。结论：姜黄素能够促进rBMSC的体外增殖及成骨分化。     

原代人脂肪基质细胞体内成骨能力的检测

目的：检测原代人脂肪基质细胞（human adipose-derived stromal sells,hASCs）的体内成骨能力,为应用其构建组织工程化骨奠定基础。方法：酶消化法分离原代hASCs,细胞经成骨向和成脂肪向诱导后,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和茜素红矿化染色检测其成骨向分化的能力,油红O染色检测其成脂肪向分化的能力。体内实验使用12只裸鼠,于其背部一侧皮下植入原代hASCs + 支架材料作为实验组,同一裸鼠的另一侧植入单纯支架材料作为对照组。植入4周和8周后取材,制成组织切片,进行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果：300 mL脂肪组织中可以获得约6×10⁷个原代hASCs。体外实验证实原代hASCs具有成骨向和成脂肪向分化的潜能。HE染色可见,植入4周和8周后植入物中有类骨组织形成,免疫组织化学染色显示骨钙素、ALP和抗人核抗体呈阳性表达。结论：原代人脂肪基质细胞与支架材料构建的复合物可以在裸鼠体内成骨。     

构建一种可评价脂肪间充质干细胞成骨向分化的荧光素酶报告系统

目的：构建一种可用于评价人脂肪间充质干细胞（human adipose-derived stem cells, hASCs）成骨向分化的荧光素酶报告系统,以期能够快捷、特异且定量的检测出细胞在体外的成骨向分化情况,并且使将来活体监测小型实验动物外源移植细胞的成骨分化成为可能。方法：将骨钙素（osteocalsin, OC）基因的启动子克隆到荧光素酶luciferase报告基因的上游,构建pLVX-OCpro -Luc-Puro载体,进行慢病毒包装后感染人脂肪间充质干细胞,嘌呤霉素（puromycin）筛选阳性克隆,获得稳定整合OCpro-Luc-Puro的细胞株,将该细胞在成骨诱导培养基中培养的第7和14天,观察其在成骨诱导环境下分化的情况。在成骨诱导培养的第7和14天检测荧光素酶的活性,同时进行茜素红（Alizarin red S）染色定量及成骨相关基因表达水平的检测,通过比较验证该荧光素酶报告系统用于成骨评价的可行性。结果：成功构建pLVX-OCpro-Luc-Puro 载体获得稳定整合报告基因的hASCs细胞株。在OCpro-Luc-Puro-hASCs成骨诱导的第7和14天,茜素红钙化结节染色结果均为阳性,且第14天的染色及定量结果明显强于第7天。OC、Runx2及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）基因的mRNA水平在成骨分化刺激下,其表达水平逐渐上升,同时,荧光素酶被激活,且荧光素酶的活性在第14天明显强于第7天,即荧光素酶表达的趋势与茜素红染色定量及成骨相关基因表达水平一致。结论：成功构建了一种可用于评价成骨向分化的荧光素酶报告系统,并通过与传统的检测成骨向分化方法（茜素红染色定量、成骨相关基因表达）对比,验证了该系统的有效性。     

光动力疗法对增生性瘢痕成纤维细胞增殖影响的研究

目的 探讨以5-氨基酮戊酸(ALA)为光敏剂的光动力疗法(PDT)在体外对增生性瘢痕成纤维细胞(FB)增殖的影响,并探寻合适的光敏剂浓度和激光能量密度.方法 组织块法体外培养人增生性瘢痕FB.实验分为空白对照组、激光组(仅予不同能量密度激光照射)、光敏剂组(仅予不同浓度光敏剂同时培养)和ALA-PDT组(光敏剂培养+激光照射).用CCK-8检测各组细胞增殖抑制率,根据结果选出最佳的ALA浓度和激光能量密度的组合,检测该组合干预后的FB增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平.结果 激光组和光敏剂组对增生性瘢痕FB增殖无明显抑制作用.ALA-PDT组中,当激光剂量≥10 J/cm2与药物浓度≥0.125 mmol/L时,抑制作用明显,随激光能量和药物浓度的同时增大,抑制作用逐渐增大.而当ALA浓度达到0.5 mmol/L,激光能量密度达到20 J/cm2后,再增大药物浓度和激光能量抑制率无明显升高,在此条件下的ALA-PDT组PCNA表达水平低于空白对照组(30.33±2.08 vs.78.33±3.79,P＜0.05).结论 ALA-PDT对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞增殖有明显抑制作用,其抑制作用随药物浓度和激光能量密度增加而增加.最佳参数:ALA浓度为0.5 mmol/L,He-Ne激光能量密度为20 J/cm2.     

低剂量激光联合阿魏酸对成骨细胞分化成熟及成骨信号通路表达的影响

目的:研究低剂量激光(LLLI)联合阿魏酸对成骨细胞分化成熟及成骨信号通路表达的影响。方法:取新生24小时以内SD大鼠的颅盖骨,分离培养成骨细胞后分为对照组、阿魏酸组、LLLI组、阿魏酸+LLLI组,不同条件连续处理3天后检测成骨细胞分化标志物、增殖分子、信号通路分子的表达量。结果:处理后3天时,阿魏酸组、LLLI组、阿魏酸+LLLI组细胞中Bax、Bid的mRNA表达量均显著低于对照组,Bcl-2、CyclinD1、E2F、Col-I、OC、ALP的mRNA表达量以及Wnt、β-catenin、Runx2、cAMP、PKA的蛋白表达量均显著高于对照组(P<0.05);阿魏酸+LLLI组细胞中Bax、Bid的mRNA表达量均显著低于阿魏酸组和LLLI组,Bcl-2、CyclinD1、E2F、Col-I、OC、ALP的mRNA表达量以及Wnt、β-catenin、Runx2、cAMP、PKA的蛋白表达量均显著高于阿魏酸组和LLLI组(P<0.05),阿魏酸组和LLLI组细胞中Col-I、OC、ALP、Bax、Bid、Bcl-2、CyclinD1、E2F的mRNA表达量以及Wnt、β-catenin、Runx2、cAMP、PKA的蛋白表达量无显著性差异(P>0.05)。结论:低剂量激光联合阿魏酸能够促进成骨细胞分化成熟、激活成骨信号通路。     

短时CaCl2刺激对人脂肪干细胞增殖与成骨向分化的影响

目的:观察CaCl2 溶液作为海藻酸钠/明胶交联剂短时作用于人脂肪间充质干细胞( human adipose-de-rived mesenchymal stem cells,hASCs)时,对其增殖和成骨向分化的影响,从而为后期三维生物打印实验选择合适浓度的CaCl2 溶液打下研究基础. 方法:取P3代hASCs,实验组分别用50、100、200、500 mmol/L的CaCl2 溶液对细胞处理5 min,对照组细胞不处理. P3代hASCs处理后第1、3、5、7天用CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞增殖情况. P3代hASCs成骨诱导7d后,采用碱性磷酸酶染色法观察细胞成骨向分化情况,并用碱性磷酸酶活性定量法测定各实验组与对照组碱性磷酸酶活性表达的差异. P3代hASCs成骨诱导14天后,用茜素红染色法观察细胞矿化结节形成情况进行定量分析. 采用SPSS 17. 0软件,运用单因素方差分析对结果进行分析,两两比较采用SNK法.结果:不同浓度CaCl2 溶液处理组细胞的增殖水平在第1、3、5、7天的差异均无统计学意义;成骨诱导7天后,随着CaCl2 溶液浓度的升高,碱性磷酸酶活性先升高后降低,除50 mmol/L与100 mmol/L CaCl2 溶液处理组之间,以及成骨诱导培养基组与200 mmol/L CaCl2 溶液处理组之间差异无统计学意义外,其余组间差异均有统计学意义( P<0. 05);成骨诱导14天后,随着CaCl2 溶液浓度的升高,矿化结节由散在片状逐步变为层叠片状,矿化结节定量结果显示各实验组之间以及与各对照组间的差异均有统计学意义(P<0. 05). 结论:短时高浓度钙离子刺激对hASCs增殖无影响,但对hASCs的成骨向分化有促进作用,且随着钙离子浓度增加,促进作用加强,因此可以选用高浓度CaCl2 溶液作为三维生物打印用材料的交联剂.     

抑瘤素M对人脐带间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的：探讨抑瘤素M（OSM）对体外培养的人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）增殖及成骨分化的影响,阐明OSM是一种有效的成骨诱导活性因子。方法：体外培养hUCMSCs,流式细胞术检测第3代hUCMSCs表面标志物;CCK-8法测定不同剂量（0.1、1.0和10.0 μg·L^-1）重组人抑瘤素M（rhOSM）处理后hUCMSCs的增殖活性。将hUCMSCs分为对照组、经典成骨诱导剂组和不同剂量（0.1、1.0和10.0 μg·L^-1） rhOSM组,于成骨诱导第4、7和14天,采用BCIP/NBT法进行碱性磷酸酶（ALP）染色并定量检测细胞中ALP活性,茜素红染色法检测钙结节的生成情况并半定量分析细胞矿化活性,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测hUCMSCs中Runt相关转录因子2（Runx2）和OCN mRNA表达水平。结果：hUCMSCs符合间充质干细胞（MSCs）鉴定标准。rhOSM处理hUCMSCs 72 h,与对照组比较,10.0 μg·L^-1 rhOSM组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）;处理96 h,与对照组比较,各剂量rhOSM组细胞增殖活性均明显降低（P<0.05）,且各剂量rhOSM组组间比较差异有统计学意义（P<0.01）。成骨诱导第4、7和14天,与经典成骨诱导剂组比较,各剂量rhOSM组细胞中ALP活性和Runx2 mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）;与0.1 μg·L^-1 rhOSM组比较,1.0和10.0 μg·L^-1 rhOSM组ALP活性和Runx2 mRNA表达水平明显升高（P<0.05）;与成骨诱导第7天比较,诱导第14天各剂量rhOSM组细胞中ALP活性和Runx2 mRNA表达水平略降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。成骨诱导第7、14和21天,与经典成骨诱导剂组比较,各剂量rhOSM组细胞矿化活性均明显升高（P<0.01）;与0.1 μg·L^-1 rhOSM组比较,1.0和10.0 μg·L^-1 rhOSM组细胞矿化活性明显升高（P<0.05）。与经典成骨诱导组比较,各剂量rhOSM组OCNmRNA表达水平均明显升高（P<0.05）;成骨诱导第7、14和21天,与0.1μg·L^-1rhOSM组比较,1.0和10.0μg·L^-1rhOSM组细胞中OCNmRNA表达水平明显升高（P<0.05）,具有时间-剂量依赖性。结论：rhOSM通过上调Runx2和OCN的表达及增加成骨细胞ALP的活性和钙盐沉积促进hUCMSCs体外成骨分化,是一种有效的成骨诱导活性因子。     

原代人脂肪基质细胞体内成骨能力的检测

目的:检测原代人脂肪基质细胞(human adipose-derived stromal sells,hASCs)的体内成骨能力,为应用其构建组织工程化骨奠定基础。方法:酶消化法分离原代hASCs,细胞经成骨向和成脂肪向诱导后,碱性磷酸酶(al-kaline phosphatase,ALP)染色和茜素红矿化染色检测其成骨向分化的能力,油红O染色检测其成脂肪向分化的能力。体内实验使用12只裸鼠,于其背部一侧皮下植入原代hASCs+支架材料作为实验组,同一裸鼠的另一侧植入单纯支架材料作为对照组。植入4周和8周后取材,制成组织切片,进行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果:300 mL脂肪组织中可以获得约6×107个原代hASCs。体外实验证实原代hASCs具有成骨向和成脂肪向分化的潜能。HE染色可见,植入4周和8周后植入物中有类骨组织形成,免疫组织化学染色显示骨钙素、ALP和抗人核抗体呈阳性表达。结论:原代人脂肪基质细胞与支架材料构建的复合物可以在裸鼠体内成骨。     

罗格列酮对小鼠胚胎成骨细胞增殖和成骨分化的影响

目的 体外观察罗格列酮对小鼠胚胎成骨细胞增殖和成骨分化的影响.方法 于中国科学院上海细胞库购买小鼠胚胎成骨细胞并传代,使用不同浓度下的罗格列酮（1、5 μmol/L）处理细胞,对照组用等量二甲亚砜（DMSO）;观察不同浓度罗格列酮下小鼠胚胎成骨细胞的细胞增殖状况;使用不同浓度罗格列酮的细胞培养基,培养7、14 d,行碱性磷酸酶染色;细胞培养7 d,Real-time PCR检测转录因子Runx2、成骨标志物碱性磷酸酶、骨钙素基因的表达.结果 实验组和对照组相比,小鼠胚胎成骨细胞的细胞增殖能力减弱.随着罗格列酮浓度的升高,碱性磷酸酶染色颜色逐渐变浅.聚合酶链式反应结果显示Runx2 mRNA表达分别下降了（54.7＆#177;8.2）%和（52.3＆#177;7.2）%,碱性磷酸酶 mRNA表达分别下降了（18.7＆#177;5.1）%和（37.8＆#177;8.5）% ,骨钙素 mRNA表达分别下降了（43.4＆#177;5.6）%和（60.4＆#177;4.3）%;差异均有统计学意义（P＆lt;0.05）.结论 罗格列酮能抑制小鼠胚胎成骨细胞的细胞增殖和成骨细胞分化,这可能就是2型糖尿病患者服用噻唑烷二酮类药物后并发骨质疏松的原因之一.     

携带重组腺病毒 BMP-2的巨噬细胞对 C3H10细胞成骨分化的影响

目的：探讨携带 BMP-2（Bone Morphogenetic protine-2）腺病毒的巨噬细胞对小鼠 C3H10细胞的增殖和成骨分化的作用。方法：感染重组腺病毒 BMP-2的巨噬细胞与小鼠 C3H10细胞共培养。MTT 方法检测共培养体系中 C3H10细胞的增殖能力;共培养7 d 对 C3H10细胞进行 ALP 染色和活性检测;细胞培养至21 d,进行标茜素红染色检测矿化结节;定量 PCR 实验验证过表达腺病毒载体 BMP-2有效性并且检测 Runx2的表达;Western blot检测细胞中磷酸化 Smad1/5/8蛋白表达。结果：与对照组相比,巨细胞过表达 BMP-2与 C3H10细胞共培养后,可以促进 C3H10细胞增殖;ALP 染色程度和活性上升;矿化结节增多;定量 PCR 结果显示 Ruxn2 RNA 表达增加, Western blot 结果显示 Ruxn2蛋白表达上升。结论：过表达 BMP-2的巨噬细胞可以促进小鼠 C3H10细胞的增殖,并且可能通过 BMPs 经典途径促进 C3H10细胞的成骨分化。     

人脱落乳牙牙髓干细胞与人恒牙牙髓干细胞成骨分化及破骨能力的差异

目的比较处于生理性根吸收时期的自然脱落乳牙牙髓干细胞（SHED）和恒牙牙髓干细胞（DPSCs）的成骨分化及破骨能
力,探讨两者在成骨和破骨相关分子的表达情况。方法体外分离、培养和纯化处于生理性根吸收时期的自然脱落乳牙牙髓干
细胞与恒牙牙髓干细胞;两种干细胞在成骨诱导14 d 和21 d,分别进行ALP染色、茜素红染色,并通过Real-time PCR检测
SHED和DPSCs矿化诱导后的成骨与破骨相关基因表达。结果倒置显微镜下观察,SHED和DPSCs形态均为长梭形;两种干
细胞经矿化诱导后,茜素红染色可见SHED的矿化结节计数多于DPSCs（P<0.05）,SHED的ALP活性亦强于DPSCs（P<0.05）。
RT-PCR检测结果显示,经矿化诱导后两种干细胞均表达成骨与破骨相关基因Runx2、OCN、ALP、OPG和RANKL,但DPSCs的
Runx2、OCN 和ALP的表达水平均低于SHED（P<0.05）,且SHED反应细胞破骨/成骨能力的RANKL/OPG 的比值显著高于
DPSCs（P<0.05）。结论与DPSCs相比,SHED不仅具有较强的成骨分化能力,还兼有较强的破骨能力,为SHED参与生理性根
吸收骨改建的调控机制提供实验依据。