体内成骨过程中人脂肪基质细胞对新骨形成的促进作用

目的：探索以人脂肪基质细胞（human adipose derived stromal cells,hASCs）为基础的组织工程骨在体内成骨过程中hASCs发挥的作用,为深入研究其体内成骨机制奠定基础。方法：酶消化法分离原代hASCs,进行传代培养。体内实验使用16只裸鼠,于其背部正中做皮肤切口,向两侧分离出4个皮下植入腔,分别植入：(1)空白;(2)单纯β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate, β-TCP）支架（支架对照组）;(3)β-TCP支架+人成纤维细胞（阴性细胞对照组）;(4)β-TCP支架+hASCs（实验组）。植入后1周、2周、4周、6周进行取材,每时间点取4只裸鼠,其中2只裸鼠的标本经处理后进行扫描电镜（scanning electron microscope, SEM）观察,另外2只裸鼠的标本制成组织学切片,进行HE染色分析。结果：SEM观察可见实验组植入2周后,hASCs周围即出现大量细胞外基质,至4周时细胞外基质开始出现明显的矿化,6周时可见矿化基质进一步增多。HE染色分析可见实验组植入2周后hASCs即开始分泌嗜酸性较强的均质细胞外基质,至4周时细胞外基质中出现了强嗜酸性的类骨组织,6周时新生类骨组织面积明显增大,结构更加典型。在其他组均未见矿化基质和类骨组织生成。结论：人脂肪基质细胞在体内成骨过程中发挥了关键的作用,包括分泌大量细胞外基质,促进细胞外基质矿化和引导新生类骨组织形成。     

原代人脂肪基质细胞体内成骨能力的检测

目的：检测原代人脂肪基质细胞（human adipose-derived stromal sells,hASCs）的体内成骨能力,为应用其构建组织工程化骨奠定基础。方法：酶消化法分离原代hASCs,细胞经成骨向和成脂肪向诱导后,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和茜素红矿化染色检测其成骨向分化的能力,油红O染色检测其成脂肪向分化的能力。体内实验使用12只裸鼠,于其背部一侧皮下植入原代hASCs + 支架材料作为实验组,同一裸鼠的另一侧植入单纯支架材料作为对照组。植入4周和8周后取材,制成组织切片,进行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果：300 mL脂肪组织中可以获得约6×10⁷个原代hASCs。体外实验证实原代hASCs具有成骨向和成脂肪向分化的潜能。HE染色可见,植入4周和8周后植入物中有类骨组织形成,免疫组织化学染色显示骨钙素、ALP和抗人核抗体呈阳性表达。结论：原代人脂肪基质细胞与支架材料构建的复合物可以在裸鼠体内成骨。     

低能量激光照射对人脂肪基质细胞增殖分化的影响

目的： 研究低能量激光照射（low level laser irradiation,LLLI）的照射剂量对人脂肪基质细胞（human adipose-derived stromal cells,hASCs）增殖与分化作用的影响,为LLLI进一步在骨组织工程中的应用奠定基础。方法： 将P4代hASCs接种于孔板中,24 h后利用半导体激光器（980 nm,100 mW~12 W）连续照射4 d。以增殖培养基为空白对照组(PM组),实验组接受2、4、6、8 J/cm2的激光照射,连续7 d进行细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）增殖检测。当细胞达到70%的融合后将一半细胞更换为成骨培养基（osteogenic medium,OM）,根据培养基及累计接受的激光总能量密度分为6组：PM、OM、PM+LLLI2 J/cm2、OM+LLLI2 J/cm2、PM+LLLI4 J/cm2、OM+LLLI4 J/cm2。于第7天进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色及定量检测,于第14、21天进行矿化沉积检测,于第7、14天进行实时定量PCR检测成骨相关基因的表达,探究低能量激光对hASCs成骨分化的影响,结果采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。结果： PM+LLLI4 J/cm2组细胞增殖速率最快,OM各组的ALP染色均呈阳性表达,且染色深度随激光能量密度的增高而加重。第14天时,OM各组随激光照射能量升高,矿化结节体积明显增大、数目增多;第21天时,OM组间茜素红染色结果无明显差异。ALP及茜素红定量结果均与相应染色结果趋势一致。hASCs实时定量PCR结果提示,LLLI可促进ALP和Runx2的表达,且促进作用与照射剂量呈正相关。结论： LLLI具有促进hASCs增殖分化的作用,且在一定剂量范围内,这种促进作用会随照射剂量的增大而加强,当达到峰值后随照射剂量的增大而减弱。     

不同质量分数N,[KG-3]O-CMC/β-TCP复合材料在模拟体液降解中的pH值变化及其对MG63细胞生长的影响

目的:探讨不同质量分数N,[KG-3]O-羧甲基壳聚糖/β-磷酸三钙（N,[KG-3]O-CMC/β-TCP）复合材料在模拟体液(SBF)中的pH值变化及其对成骨样细胞（MG63细胞）生长的影响,并阐明其机制,为骨修复材料的进一步研发提供参考。方法:以质量分数为2/1、1/1和1/2的N,[KG-3]O-CMC/β-TCP作为实验组［分别为N,[KG-3]O-CMC/β-TCP(2/1)组、N,[KG-3]O-CMC/β-TCP(1/1）组和N,[KG-3]O-CMC/β-TCP（1/2）组)］,纳米磷酸钙胶原基骨修复材料作对照组;将不同质量分数材料浸泡在SBF中,分别在浸泡的第7、14、21和28天用pH计测量SBF的pH值。MG 63细胞以1×105mL-1密度分别接种于实验组和对照组材料上,并置于培养板中共培养,在培养的第2、4和6天用扫描电镜观察MG63细胞在各组材料上的黏附和形态变化,采用MTT法检测细胞增殖情况。结果: N,[KG-3]O-CMC/β-TCP(1/2）组和N,[KG-3]O-CMC/β-TCP（2/1）组SBF的 pH值在6.70~7.25范围波动,N,[KG-3]O-CMC/β-TCP(1/1）组SBF的 pH值基本稳定于7.15。扫描电镜观察, N,[KG-3]O-CMC/β-TCP（2/1）组中的细胞形态欠饱满,铺展面小且分泌物少;N,[KG-3]O-CMC/β-TCP(1/1）组和N,[KG-3]O-CMC/β-TCP（1/2）组中细胞形态饱满,伪足相互连通,铺展面广且分泌物多。与对照组比较, N,[KG-3]O-CMC/β-TCP(1/1）组和N,[KG-3]O-CMC/β-TCP（2/1）组细胞相对增殖率差异无统计学意义（P>0.05）,而N,[KG-3]O-CMC/β-TCP(1/2）组细胞相对增殖率降低（P<0.05）。结论：不同质量分数N,[KG-3]O-CMC/β-TCP材料在SBF中的pH值变化较小,基本处于中性;促进MG63细胞生长的N,O-CMC/β-TCP质量分数按作用大小依次为1/1、2/1及1/2。     

原代人脂肪基质细胞体内成骨能力的检测

目的:检测原代人脂肪基质细胞(human adipose-derived stromal sells,hASCs)的体内成骨能力,为应用其构建组织工程化骨奠定基础。方法:酶消化法分离原代hASCs,细胞经成骨向和成脂肪向诱导后,碱性磷酸酶(al-kaline phosphatase,ALP)染色和茜素红矿化染色检测其成骨向分化的能力,油红O染色检测其成脂肪向分化的能力。体内实验使用12只裸鼠,于其背部一侧皮下植入原代hASCs+支架材料作为实验组,同一裸鼠的另一侧植入单纯支架材料作为对照组。植入4周和8周后取材,制成组织切片,进行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果:300 mL脂肪组织中可以获得约6×107个原代hASCs。体外实验证实原代hASCs具有成骨向和成脂肪向分化的潜能。HE染色可见,植入4周和8周后植入物中有类骨组织形成,免疫组织化学染色显示骨钙素、ALP和抗人核抗体呈阳性表达。结论:原代人脂肪基质细胞与支架材料构建的复合物可以在裸鼠体内成骨。     

小核仁RNA宿主基因5对骨髓间充质干细胞成骨分化和凋亡的影响

目的 探究小核仁RNA宿主基因5（SNHG5）在调控骨髓间充质干细胞成骨分化和凋亡中的作用。方法 成骨诱导液诱导骨髓间充质干细胞成骨分化,不同质粒转染分组,Western blotting法检测成骨标志物（OCN、OSX、COL1A1）的蛋白相对表达量,茜素红染色和碱性磷酸酶（ALP）检测成骨效果,实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测SNHG5和OCN mRNA相对表达量。将细胞随机分为两组,实验组下调SNHG5表达,对照组不下调,同法进行成骨诱导,检测OCN、OSX及COL1A1的蛋白相对表达量,检测成骨效果,检测OCN、OSX、COL1A1及SNHG5 mRNA相对表达量。采用流式细胞术检测细胞凋亡,并检测Caspase-3活性。结果 成骨诱导后第14天的OCN、OSX及COL1A1蛋白相对表达量高于诱导后第7天和诱导前（P <0.05）,诱导后第7天高于诱导前（P <0.05）。成骨诱导前、诱导后第7天、诱导后第14天的ALP活性和茜素红浓度比较,差异有统计学意义（P <0.05）。成骨诱导前、诱导后第1天、第3天、第5天、第7天、第14天的SNHG5和OCN mRNA相对表达量随时间推移逐渐升高（P <0.05）。转染不同质粒后,各组SNHG5 mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义（P <0.05）,细胞转染质粒后第14天实验组OCN、OSX及COL1A1 mRNA和蛋白相对表达量低于对照组（P <0.05）,细胞转染质粒后第14天实验组ALP活性和茜素红浓度低于对照组（P <0.05）,实验组细胞凋亡率和Caspase-3活性高于对照组（P <0.05）。结论 SNHG5参与骨髓间充质干细胞成骨分化和凋亡,可能在骨质疏松症的发展中起促进作用,为改善颌骨骨质疏松的治疗提供新靶点。     

构建一种可评价脂肪间充质干细胞成骨向分化的荧光素酶报告系统

目的：构建一种可用于评价人脂肪间充质干细胞（human adipose-derived stem cells, hASCs）成骨向分化的荧光素酶报告系统,以期能够快捷、特异且定量的检测出细胞在体外的成骨向分化情况,并且使将来活体监测小型实验动物外源移植细胞的成骨分化成为可能。方法：将骨钙素（osteocalsin, OC）基因的启动子克隆到荧光素酶luciferase报告基因的上游,构建pLVX-OCpro -Luc-Puro载体,进行慢病毒包装后感染人脂肪间充质干细胞,嘌呤霉素（puromycin）筛选阳性克隆,获得稳定整合OCpro-Luc-Puro的细胞株,将该细胞在成骨诱导培养基中培养的第7和14天,观察其在成骨诱导环境下分化的情况。在成骨诱导培养的第7和14天检测荧光素酶的活性,同时进行茜素红（Alizarin red S）染色定量及成骨相关基因表达水平的检测,通过比较验证该荧光素酶报告系统用于成骨评价的可行性。结果：成功构建pLVX-OCpro-Luc-Puro 载体获得稳定整合报告基因的hASCs细胞株。在OCpro-Luc-Puro-hASCs成骨诱导的第7和14天,茜素红钙化结节染色结果均为阳性,且第14天的染色及定量结果明显强于第7天。OC、Runx2及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）基因的mRNA水平在成骨分化刺激下,其表达水平逐渐上升,同时,荧光素酶被激活,且荧光素酶的活性在第14天明显强于第7天,即荧光素酶表达的趋势与茜素红染色定量及成骨相关基因表达水平一致。结论：成功构建了一种可用于评价成骨向分化的荧光素酶报告系统,并通过与传统的检测成骨向分化方法（茜素红染色定量、成骨相关基因表达）对比,验证了该系统的有效性。     

短时CaCl2刺激对人脂肪干细胞增殖与成骨向分化的影响

目的:观察CaCl2 溶液作为海藻酸钠/明胶交联剂短时作用于人脂肪间充质干细胞( human adipose-de-rived mesenchymal stem cells,hASCs)时,对其增殖和成骨向分化的影响,从而为后期三维生物打印实验选择合适浓度的CaCl2 溶液打下研究基础. 方法:取P3代hASCs,实验组分别用50、100、200、500 mmol/L的CaCl2 溶液对细胞处理5 min,对照组细胞不处理. P3代hASCs处理后第1、3、5、7天用CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞增殖情况. P3代hASCs成骨诱导7d后,采用碱性磷酸酶染色法观察细胞成骨向分化情况,并用碱性磷酸酶活性定量法测定各实验组与对照组碱性磷酸酶活性表达的差异. P3代hASCs成骨诱导14天后,用茜素红染色法观察细胞矿化结节形成情况进行定量分析. 采用SPSS 17. 0软件,运用单因素方差分析对结果进行分析,两两比较采用SNK法.结果:不同浓度CaCl2 溶液处理组细胞的增殖水平在第1、3、5、7天的差异均无统计学意义;成骨诱导7天后,随着CaCl2 溶液浓度的升高,碱性磷酸酶活性先升高后降低,除50 mmol/L与100 mmol/L CaCl2 溶液处理组之间,以及成骨诱导培养基组与200 mmol/L CaCl2 溶液处理组之间差异无统计学意义外,其余组间差异均有统计学意义( P<0. 05);成骨诱导14天后,随着CaCl2 溶液浓度的升高,矿化结节由散在片状逐步变为层叠片状,矿化结节定量结果显示各实验组之间以及与各对照组间的差异均有统计学意义(P<0. 05). 结论:短时高浓度钙离子刺激对hASCs增殖无影响,但对hASCs的成骨向分化有促进作用,且随着钙离子浓度增加,促进作用加强,因此可以选用高浓度CaCl2 溶液作为三维生物打印用材料的交联剂.     

脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化和Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的 探讨脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields, PEMFs）对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）增殖、成骨分化以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法 将培养的第3代大鼠BMSCs分为3组。3个组均以LG-DMEM完全培养基培养1 d,待细胞贴壁后更换新鲜培养基,对照组不做干预处理; PEMFs组进行8 Hz、3.8 mT的PEMFs干预,每天40 min,持续21 d;成骨诱导基(OM)组加入成骨诱导剂,不予磁场干预。采用MTT法测定增殖活性;碱性磷酸酶（ALP）、茜素红S染色进行成骨分化鉴定;利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测Wnt/β-catenin信号通路及成骨分化相关基因的表达。结果 相较对照组,成骨诱导剂在干预第7、14、21 d可提高BMSCs的增殖活性（P<0.05）;PEMFs促增殖作用不明显。在BMSCs分化方面,PEMFs组及OM组ALP、茜素红S染色阳性强度均高于对照组（P<0.05）。定量RT-PCR结果显示,PEMFs组及OM组Wnt1、Wnt3a、LRP5、β-catenin、BMP-2、Runx2、ALP、OC mRNA的表达相较于对照组在相应时间点均有所上调（P<0.05）。PEMFs组各检测结果较OM组低,但趋势基本一致。结论 PEMFs在8 Hz、3.8 mT条件下可促进BMSCs的成骨分化,这可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。     

重组人肿瘤坏死因子α对人脂肪基质细胞体外成骨向分化的影响

目的:探讨一定浓度的重组人肿瘤坏死因子α(recombinant human tumor necrosis factor alpha,rhTNF-α)对人脂肪基质细胞(human adipose-derived stromal cells,hASCs)体外成骨向分化的影响。方法:采用第4代hASCs,根据培养基的不同分为4组:(1)基础培养[DMEM+10%FBS(体积分数)+100 U/mL青霉素+100 mg/L链霉素];(2)基础培养+10μg/L rhTNF-α;(3)成骨向诱导培养(基础培养+100 nmol/L地塞米松+50μmol/L维生素C+10 mmol/Lβ-甘油磷酸);(4)成骨向诱导培养+10μg/L rhTNF-α。各组每3天更换相应培养基。在第3、7、14天和第21天进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)定量检测;在第14和21天进行钙结节染色和矿化沉积定量检测;并用反转录PCR检测成骨向诱导组核心结合因子α1(core-binding factorα1,Cbfa1)、Osterix(Osx)和骨钙素(osteocalcin,OC)等成骨相关基因的表达;在成骨向诱导的第3天,用实时定量PCR检测rhTNF-α对hASCs成骨相关基因表达的影响。结果:对碱性磷酸酶定量检测,在成骨向诱导的第14天(3.527±0.415 vs.2.345±0.354,P0.01)和第21天(3.106±0.105 vs.2.442±0.163,P0.01),10μg/L的rhTNF-α可以促进其表达;同样对于矿化沉积检测,在成骨向诱导的第14天(2.896±0.173 vs.0.679±0.173,P0.01)和第21天(2.231±0.233vs.1.729±0.229,P0.01),10μg/L的rhTNF-α也促进其表达;反转录PCR和实时定量PCR也表明rhTNF-α可以促进Cbfa1,Osx和OC的表达。结论:10μg/L的rhTNF-α可以促进成骨向诱导的hASCs体外成骨向分化,并可以促进成骨相关基因Cbfa1、Osx和OC的表达。     

系统性红斑狼疮模型鼠骨 BMP/Smads信号通路状态的研究

目的 :探讨狼疮鼠(MRL/lpr)骨BMP/Smads信号通路表达情况。方法 :分离小鼠股骨制备组织切片,常规苏木素-伊红(HE)染色,观察骨质情况;免疫组化观察骨组织中骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)表达;密度梯度离心法和贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞(bone marrow masenchymal stem cells,BMMSCs),细胞爬片后免疫荧光法观察BMP-2、p-Smad1/5/8蛋白表达情况;BMP-2诱导BMMSCs向成骨细胞分化,RT-PCR法检测BMMSCs ALP、Runx2基因m RNA水平,ALP染色鉴定早期成骨情况。结果:狼疮鼠骨皮质较正常鼠减少,皮质骨占骨体积比例较正常鼠减低(P<0.01);狼疮鼠股骨BMP-2表达与正常鼠无明显差别(P>0.05);细胞免疫荧光显示狼疮鼠BMMSCs BMP-2、p-Smad1/5/8表达减弱(P<0.05);狼疮鼠BMMSCs BMP-2刺激7 d后ALP活性较正常鼠减低,BMP-2刺激3 d后ALP m RNA水平较正常鼠减弱(P<0.01),Runx2 m RNA水平较正常鼠无明显差别(P>0.05)。结论 :狼疮鼠骨BMP/Smads信号通路处于抑制状态。