原代人脂肪基质细胞体内成骨能力的检测

目的：检测原代人脂肪基质细胞（human adipose-derived stromal sells,hASCs）的体内成骨能力,为应用其构建组织工程化骨奠定基础。方法：酶消化法分离原代hASCs,细胞经成骨向和成脂肪向诱导后,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和茜素红矿化染色检测其成骨向分化的能力,油红O染色检测其成脂肪向分化的能力。体内实验使用12只裸鼠,于其背部一侧皮下植入原代hASCs + 支架材料作为实验组,同一裸鼠的另一侧植入单纯支架材料作为对照组。植入4周和8周后取材,制成组织切片,进行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果：300 mL脂肪组织中可以获得约6×10⁷个原代hASCs。体外实验证实原代hASCs具有成骨向和成脂肪向分化的潜能。HE染色可见,植入4周和8周后植入物中有类骨组织形成,免疫组织化学染色显示骨钙素、ALP和抗人核抗体呈阳性表达。结论：原代人脂肪基质细胞与支架材料构建的复合物可以在裸鼠体内成骨。     

体内成骨过程中人脂肪基质细胞对新骨形成的促进作用

目的：探索以人脂肪基质细胞（human adipose derived stromal cells,hASCs）为基础的组织工程骨在体内成骨过程中hASCs发挥的作用,为深入研究其体内成骨机制奠定基础。方法：酶消化法分离原代hASCs,进行传代培养。体内实验使用16只裸鼠,于其背部正中做皮肤切口,向两侧分离出4个皮下植入腔,分别植入：(1)空白;(2)单纯β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate, β-TCP）支架（支架对照组）;(3)β-TCP支架+人成纤维细胞（阴性细胞对照组）;(4)β-TCP支架+hASCs（实验组）。植入后1周、2周、4周、6周进行取材,每时间点取4只裸鼠,其中2只裸鼠的标本经处理后进行扫描电镜（scanning electron microscope, SEM）观察,另外2只裸鼠的标本制成组织学切片,进行HE染色分析。结果：SEM观察可见实验组植入2周后,hASCs周围即出现大量细胞外基质,至4周时细胞外基质开始出现明显的矿化,6周时可见矿化基质进一步增多。HE染色分析可见实验组植入2周后hASCs即开始分泌嗜酸性较强的均质细胞外基质,至4周时细胞外基质中出现了强嗜酸性的类骨组织,6周时新生类骨组织面积明显增大,结构更加典型。在其他组均未见矿化基质和类骨组织生成。结论：人脂肪基质细胞在体内成骨过程中发挥了关键的作用,包括分泌大量细胞外基质,促进细胞外基质矿化和引导新生类骨组织形成。     

兔脂肪基质细胞的分离培养及其成骨活性的研究

目的探讨兔脂肪组织来源脂肪基质细胞的分离培养方法及其成骨活性．方法取成年新西兰大白兔腹股沟皮下脂肪组织1～2mL,采用机械切割及Ⅰ型胶原酶消化法从脂肪组织中分离获得脂肪基质细胞,原代培养及传代以后,以诱导培养基（内含10mmol／Lβ-甘油磷酸钠、10～8mol／L地塞米松、50mg／L维生素C）进行诱导培养．实验评估：应用形态学观察、碱性磷酸酶钙-钴法染色检测碱性磷酸酶,Von Kossa钙化结节染色检测钙化结节的形成等方法来鉴定诱导分化所得细胞的成骨活性．结果行诱导培养的脂肪基质细胞呈多层成长,形态多为梭形,细胞外基质有白色钙化结节形成;细胞增殖速度减慢,生长周期变长．碱性磷酸酶钙钻法染色及Von Kossa钙化结节染色后均表现为阳性,未诱导培养的脂肪基质细胞则表现为阴性．结论初步建立了一套南脂肪组织分离培养脂肪基质细胞的方法,并证明该细胞在体外诱导培养条件下具备向成骨细胞分化的能力．     

Beagle犬骨髓基质细胞体外成骨诱导分化的实验研究

目的观察犬骨髓基质细胞在体外培养的条件及生物学特性,并向成骨方向定向诱导培养,为骨组织工程提供适宜的种子细胞。方法分离纯化犬骨髓基质细胞,并利用条件培养液将其向成骨方向诱导培养、扩增;采用倒置相差显微镜观察细胞形态;用Vonkossa及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色的方法鉴定其成骨性能。通过分光光度仪及MTT染色法描绘标准曲线及标准细胞浓度-光密度值（optical density,OD）曲线。结果原代培养18d后可分离得到骨髓基质细胞,经成骨条件培养液诱导培养后,形态相对稳定,具有成骨性能。结论可以通过在体外分离纯化骨髓基质细胞并诱导培养的方法,获得足够数量的具有成骨潜能的细胞作为骨组织工程的种子细胞,     

人脂肪基质细胞与骨再生——从实验室到临床

骨缺损不仅严重影响患者的生活质量和身心健康,同时也给社会经济带来巨大负担。骨组织工程(bonetissue engineering)技术被认为是本世纪前沿的、有望为广大骨缺损患者带来福音的骨再生技术。人脂肪基质细胞或脂肪来源干细胞(human adipose-derived stromal cells,or human adipose-derived stem cells,hASCs)是存在于人体脂肪组织中、具有多向分化潜能的成体干细胞,与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchy-mal stem cells,BMMSCs)相比,hASCs因其来源丰富、安全可靠、获取便捷、价格经济等优势,有望作为骨组织工程理想的种子细胞而成为近年来国内外骨再生研究的热点。这些研究为我们初步揭示了hASCs的成骨能力及成骨机制,也为尽快实现其临床转化奠定了理论基础,同时,将基于hASCs构建的组织工程骨应用于临床的实践也正在探索当中。     

人脂肪基质细胞在骨组织工程学中的应用

口腔颌面部及全身骨组织缺损是临床医生经常要面对的困境。造成骨缺损的原因有很多,包括先天发育异常、炎症、肿瘤、外伤等,然而治疗骨缺损的方法却十分有限,以往主要应用自体骨移植或人工骨替代材料,但是,自体骨移植取材受限并且会增加手术创伤,人工材料生物相容性差并且成骨能力有限,因此,骨组织工程技术有望在今后成为主要的骨     

利用微载体悬浮培养人脂肪基质干细胞

目的: 观察微载体悬浮培养系统(RCCS)对成人脂肪基质干细胞Adipose tissue-derived stromal cells(ADSCs) 的培养效果,为大量、快速扩增组织工程种子细胞提供实验依据.方法: RCCS系统采用微载体Cytodex 3为贴壁依赖性细胞ADSCs提供贴壁条件,浓度为5 g/L.静止培养在12孔培养板中.两系统细胞接种密度均为1×108cells/L.分别观察细胞增殖情况,并对用RCCS培养的细胞进行细胞表型、分化能力进行检测.结果: 微载体悬浮培养9 d后达到最大活细胞密度(1.60×109cells/L),静止培养第7日就达到最大活细胞密度(3.38×108cells/L).在微载体悬浮培养条件下,ADSCs生长更为旺盛,细胞产量更高,优于静止培养.11 d后,ADSCs依然保持其干细胞特性.结论: 利用生物反映器以及微载体技术有利于ADSCs的大规模扩增,是扩增组织工程种子细胞的有效方法.     

骨髓基质细胞体外成骨能力的实验研究

目的 研究骨髓基质细胞(BMSc)的体外成骨能力，为骨组织工程研究提供细胞来源。方法 采用密度梯度离心法将兔BMSc自小量骨髓中分离培养，并观察第2代BMSc在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠诱导条件下的生长及成骨分化情况。结果 BMSc呈成纤维细胞样表现，增殖能力强，在诱导条件下碱性酸酶活性明显增高，并出现矿化结节。结论 BMSc体外增殖能力强，成骨能力肯定。地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠可促进BMSc向成骨细胞分化。     

重组人肿瘤坏死因子α对人脂肪基质细胞体外成骨向分化的影响

目的:探讨一定浓度的重组人肿瘤坏死因子α(recombinant human tumor necrosis factor alpha,rhTNF-α)对人脂肪基质细胞(human adipose-derived stromal cells,hASCs)体外成骨向分化的影响。方法:采用第4代hASCs,根据培养基的不同分为4组:(1)基础培养[DMEM+10%FBS(体积分数)+100 U/mL青霉素+100 mg/L链霉素];(2)基础培养+10μg/L rhTNF-α;(3)成骨向诱导培养(基础培养+100 nmol/L地塞米松+50μmol/L维生素C+10 mmol/Lβ-甘油磷酸);(4)成骨向诱导培养+10μg/L rhTNF-α。各组每3天更换相应培养基。在第3、7、14天和第21天进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)定量检测;在第14和21天进行钙结节染色和矿化沉积定量检测;并用反转录PCR检测成骨向诱导组核心结合因子α1(core-binding factorα1,Cbfa1)、Osterix(Osx)和骨钙素(osteocalcin,OC)等成骨相关基因的表达;在成骨向诱导的第3天,用实时定量PCR检测rhTNF-α对hASCs成骨相关基因表达的影响。结果:对碱性磷酸酶定量检测,在成骨向诱导的第14天(3.527±0.415 vs.2.345±0.354,P0.01)和第21天(3.106±0.105 vs.2.442±0.163,P0.01),10μg/L的rhTNF-α可以促进其表达;同样对于矿化沉积检测,在成骨向诱导的第14天(2.896±0.173 vs.0.679±0.173,P0.01)和第21天(2.231±0.233vs.1.729±0.229,P0.01),10μg/L的rhTNF-α也促进其表达;反转录PCR和实时定量PCR也表明rhTNF-α可以促进Cbfa1,Osx和OC的表达。结论:10μg/L的rhTNF-α可以促进成骨向诱导的hASCs体外成骨向分化,并可以促进成骨相关基因Cbfa1、Osx和OC的表达。     

人脂肪来源干细胞复合纤维蛋白胶构建可注射型工程化脂肪组织的实验研究

目的 探讨构建可注射型组织工程化脂肪组织的可行性,为临床修复软组织缺损寻求简便、微创的方法 .方法 采用酶消化法从人脂肪抽吸术的抽吸物中脂质部分获取人脂肪来源干细胞(ASC),以经成脂诱导和未经成脂诱导的ASC作为种子细胞,行DiI体外荧光标记后,分别以1×107个/ml细胞密度与纤维蛋白胶可注射支架复合.取6只裸鼠,将成脂诱导ASC-支架复合物注射于其背部左下方皮下(诱导组),未诱导ASC-支架复合物注射于背部右下方皮下(未诱导组),不加细胞的纤维蛋白胶注射于颈部正中皮下(空白支架组),每点注射0.2 ml.第12周末处死裸鼠取出移植物,通过大体观察、湿重测定、常规组织病理学检测、油红O染色和DiI荧光标记检测判断体内成脂能力.结果 诱导组和未诱导组均获得了外观类似脂肪组织的新生物,新生物湿重分别为(28±15)、(22±t6)mg(t=23.238,P<0.01).诱导组新生物常规组织病理学检查及油红O染色均证实为成熟脂肪组织,DiI荧光标记呈阳性,证实为外源性ASC;未诱导组新生物中见少量成熟脂肪组织,大部分为纤维样结构;空白对照组未见新生组织形成.结论 从人吸脂术抽吸物脂质部分提取的ASC能作为种子细胞,经成脂诱导后与纤维蛋白胶可注射支架复合,可在体内成功构建成熟脂肪组织.     

低能量激光照射对人脂肪基质细胞增殖分化的影响

目的： 研究低能量激光照射（low level laser irradiation,LLLI）的照射剂量对人脂肪基质细胞（human adipose-derived stromal cells,hASCs）增殖与分化作用的影响,为LLLI进一步在骨组织工程中的应用奠定基础。方法： 将P4代hASCs接种于孔板中,24 h后利用半导体激光器（980 nm,100 mW~12 W）连续照射4 d。以增殖培养基为空白对照组(PM组),实验组接受2、4、6、8 J/cm2的激光照射,连续7 d进行细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）增殖检测。当细胞达到70%的融合后将一半细胞更换为成骨培养基（osteogenic medium,OM）,根据培养基及累计接受的激光总能量密度分为6组：PM、OM、PM+LLLI2 J/cm2、OM+LLLI2 J/cm2、PM+LLLI4 J/cm2、OM+LLLI4 J/cm2。于第7天进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色及定量检测,于第14、21天进行矿化沉积检测,于第7、14天进行实时定量PCR检测成骨相关基因的表达,探究低能量激光对hASCs成骨分化的影响,结果采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。结果： PM+LLLI4 J/cm2组细胞增殖速率最快,OM各组的ALP染色均呈阳性表达,且染色深度随激光能量密度的增高而加重。第14天时,OM各组随激光照射能量升高,矿化结节体积明显增大、数目增多;第21天时,OM组间茜素红染色结果无明显差异。ALP及茜素红定量结果均与相应染色结果趋势一致。hASCs实时定量PCR结果提示,LLLI可促进ALP和Runx2的表达,且促进作用与照射剂量呈正相关。结论： LLLI具有促进hASCs增殖分化的作用,且在一定剂量范围内,这种促进作用会随照射剂量的增大而加强,当达到峰值后随照射剂量的增大而减弱。     

炎症因子预处理的脂肪干细胞可明显抑制外周血单个核细胞增殖

目的：观察炎症因子预处理脂肪干细胞（adipose derived stem cells,ASCs）模拟异常炎症环境能否增强ASCs抑制外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）体外增殖的能力。方法：先用酶消化法对ASCs进行分离及体外培养,流式细胞仪检测其表面CD分子表达情况,用特定培养基诱导分化并鉴定其向脂肪组织和骨组织分化的能力。将PBMCs用CFSE标记后,与炎症因子预处理后的ASCs共培养,对照组无ASCs或使用未经炎症因子处理的ASCs,同时用CD3/CD28刺激PBMCs增殖,最后用流式细胞仪检测PBMC的母代细胞比例,从而判断其增殖情况。结果：ASCs形态为梭形,密集时可成鱼群状生长,可在诱导培养基培养下向脂肪组织和骨组织分化,表面CD分子表达情况与国际脂肪治疗联盟的关于ASCs的说明一致。PBMCs与ASCs体外共培养后,与无ASCs组相比,PBMCs的母代细胞比例有所增加,但效果并不显著,而将PBMCs与用炎症因子预处理后的ASCs共培养,PBMCs的母代细胞比例有明显增加（炎症因子处理后ASCs组 38.7%±10% vs. 无ASCs组28.4%±8.9%, P<0.05）, 说明炎症因子预处理的ASCs可明显抑制PBMCs的增殖。结论：炎症因子可增强ASCs的抗炎能力,该发现有助于ASCs更好地在组织修复领域发挥治疗作用。     

短时CaCl2刺激对人脂肪干细胞增殖与成骨向分化的影响

目的:观察CaCl2 溶液作为海藻酸钠/明胶交联剂短时作用于人脂肪间充质干细胞( human adipose-de-rived mesenchymal stem cells,hASCs)时,对其增殖和成骨向分化的影响,从而为后期三维生物打印实验选择合适浓度的CaCl2 溶液打下研究基础. 方法:取P3代hASCs,实验组分别用50、100、200、500 mmol/L的CaCl2 溶液对细胞处理5 min,对照组细胞不处理. P3代hASCs处理后第1、3、5、7天用CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞增殖情况. P3代hASCs成骨诱导7d后,采用碱性磷酸酶染色法观察细胞成骨向分化情况,并用碱性磷酸酶活性定量法测定各实验组与对照组碱性磷酸酶活性表达的差异. P3代hASCs成骨诱导14天后,用茜素红染色法观察细胞矿化结节形成情况进行定量分析. 采用SPSS 17. 0软件,运用单因素方差分析对结果进行分析,两两比较采用SNK法.结果:不同浓度CaCl2 溶液处理组细胞的增殖水平在第1、3、5、7天的差异均无统计学意义;成骨诱导7天后,随着CaCl2 溶液浓度的升高,碱性磷酸酶活性先升高后降低,除50 mmol/L与100 mmol/L CaCl2 溶液处理组之间,以及成骨诱导培养基组与200 mmol/L CaCl2 溶液处理组之间差异无统计学意义外,其余组间差异均有统计学意义( P<0. 05);成骨诱导14天后,随着CaCl2 溶液浓度的升高,矿化结节由散在片状逐步变为层叠片状,矿化结节定量结果显示各实验组之间以及与各对照组间的差异均有统计学意义(P<0. 05). 结论:短时高浓度钙离子刺激对hASCs增殖无影响,但对hASCs的成骨向分化有促进作用,且随着钙离子浓度增加,促进作用加强,因此可以选用高浓度CaCl2 溶液作为三维生物打印用材料的交联剂.     

构建一种可评价脂肪间充质干细胞成骨向分化的荧光素酶报告系统

目的：构建一种可用于评价人脂肪间充质干细胞（human adipose-derived stem cells, hASCs）成骨向分化的荧光素酶报告系统,以期能够快捷、特异且定量的检测出细胞在体外的成骨向分化情况,并且使将来活体监测小型实验动物外源移植细胞的成骨分化成为可能。方法：将骨钙素（osteocalsin, OC）基因的启动子克隆到荧光素酶luciferase报告基因的上游,构建pLVX-OCpro -Luc-Puro载体,进行慢病毒包装后感染人脂肪间充质干细胞,嘌呤霉素（puromycin）筛选阳性克隆,获得稳定整合OCpro-Luc-Puro的细胞株,将该细胞在成骨诱导培养基中培养的第7和14天,观察其在成骨诱导环境下分化的情况。在成骨诱导培养的第7和14天检测荧光素酶的活性,同时进行茜素红（Alizarin red S）染色定量及成骨相关基因表达水平的检测,通过比较验证该荧光素酶报告系统用于成骨评价的可行性。结果：成功构建pLVX-OCpro-Luc-Puro 载体获得稳定整合报告基因的hASCs细胞株。在OCpro-Luc-Puro-hASCs成骨诱导的第7和14天,茜素红钙化结节染色结果均为阳性,且第14天的染色及定量结果明显强于第7天。OC、Runx2及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）基因的mRNA水平在成骨分化刺激下,其表达水平逐渐上升,同时,荧光素酶被激活,且荧光素酶的活性在第14天明显强于第7天,即荧光素酶表达的趋势与茜素红染色定量及成骨相关基因表达水平一致。结论：成功构建了一种可用于评价成骨向分化的荧光素酶报告系统,并通过与传统的检测成骨向分化方法（茜素红染色定量、成骨相关基因表达）对比,验证了该系统的有效性。     

人、兔、大鼠脂肪基质细胞的生物学性状对比

目的：探讨在同一质量控制条件下,人、兔、大鼠来源脂肪基质细胞(adipose tissue-derived stromal cells,ADSCs)的体外生物学性状的异同。方法：分离培养人吸脂来源ADSCs、兔及大鼠腹股沟皮下脂肪垫来源ADSCs,体外观察3种细胞原代和传代细胞的形态及生长情况,MTT法检测细胞增殖情况。以相同密度将第2代细胞接种于24孔板,并诱导其成骨及成脂向分化。成骨诱导培养基包含100 nmol/L地塞米松、50 μmol/L抗坏血酸二磷酸酯和10 mmol/L β-甘油磷酸钠,在成骨向诱导后的第3、7、14、21天行碱性磷酸酶染色,第14、28天行茜素红染色,定量分析3种细胞体外钙沉积能力。成脂向诱导培养基包含1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰岛素、200 μmol/L 吲哚美辛和0.5 mmol/L异丁基黄嘌呤,在成脂向诱导后的第7、14天行油红O染色检测细胞的成脂分化状况。结果：3种来源的脂肪均可分离培养出“成纤维细胞样”细胞,均能成脂向分化和成骨向分化,但兔ADSCs在成骨向分化时碱性磷酸酶染色呈弱阳性,无明显钙结节形成,与其他两种细胞比较,兔ADSCs的成骨向分化能力较差。结论：与人来源和大鼠来源ADSCs比较,兔皮下脂肪来源ADSCs的体外成骨能力较差,将其用于体内成骨研究时需慎重。     

骨形态发生蛋白2／7异二聚体对人脂肪间充质干细胞成骨分化的促进作用

目的：探讨新型成骨诱导生长因子骨形态发生蛋白2/7异二聚体（bone morphogenetic protein 2/7 heterodimer,BMP-2/7）在诱导人脂肪间充质干细胞（human adipose-derived stem cells,hASCs）成骨分化中的作用。方法：体外培养hASCs,以成骨诱导培养基（osteogenic medium,OM）中添加150 μg/L BMP-2/7为实验组,以单纯OM为阳性对照组（OM组）, 以常规增殖培养基（proliferation medium,PM）为阴性对照组（PM组）。体外诱导的第1、4和7天检测细胞DNA含量,第7和14天进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色及定量检测,第21和28天进行茜素红染色及定量检测,第1、4、7和14天分别进行成骨相关基因的检测。体内实验使用6只裸鼠,于其背部正中做皮肤切口,向两侧分离出4个皮下植入腔,分别植入：（1）单纯β 磷酸三钙（β-tricalcium phosphate,β-TCP）支架（支架对照组）;（2）β-TCP支架+hASCs（体外PM培养1周）（增殖细胞对照组）;（3）β-TCP支架+hASCs（体外OM培养1周）（诱导细胞对照组）;（4）β-TCP支架+hASCs（体外OM+150 μg/L BMP-2/7培养1周）（实验组）。植入后4周进行取材,标本制成组织学切片,进行HE和Masson三色染色分析。结果：体外诱导后第1天,实验组细胞DNA含量与PM组差异没有统计学意义（P>0.05）,第4天时实验组细胞DNA含量较PM组升高（P<0.05）,第7天时组间DNA含量没有明显差异（P>0.05）。诱导7天和14天后,实验组的ALP染色及定量检测均高于OM组和PM组（P<0.05）;第21和28天矿化结节染色及钙沉积定量检测均高于OM和PM组（P<0.05）。诱导第1天时实验组的成骨相关基因（Runx2、ALP、COL-1A1）的表达量即高于PM组 (P<0.05),诱导第4天时骨钙素（osteocalcin,OC）基因表达量即开始升高,第4、7和14天的基因表达量较OM和PM组显著升高（P<0.05）。HE染色分析可见实验组和诱导细胞对照组的hASCs能分泌出嗜酸性较强的均质细胞外基质,出现了强嗜酸性的类骨组织;与诱导细胞对照组相比,实验组的细胞外基质嗜酸性更强,类骨组织的面积更大,结构更加典型;其他两对照组均未见矿化基质和类骨组织生成。Masson三色染色分析可见实验组呈强阳性表现,细胞基质中充满绿染的胶原;诱导细胞对照组和增殖细胞对照组的细胞基质中有不同程度的阳性表现,但较之实验组,胶原的数量明显减少;单纯支架组未见胶原的表达。结论：BMP-2/7在hASCs的成骨分化过程中发挥了重要作用,能够有效促进hASCs的体外和体内成骨分化。