三氧化二砷在体外抑制结肠癌细胞的研究

目的 在体外观察三氧化二砷(As2O3)对结肠癌细胞系HT-29的抑制作用,并探讨其作用机制,为其是否能作为结肠肿瘤的化疗药物提供理论基础.方法 将不同浓度As2O3作用于HT-29细胞不同时间后,用MTT检测细胞抑制率,光镜及透射电镜观察细胞形态学和超微结构的变化,通过流式细胞仪及共聚焦显微镜分析凋亡及自噬.结果 4.0μmol/L As2O3作用72h可明显抑制HT-29细胞增殖及诱发其凋亡,且抑制率与药物作用时间及浓度成正比.在凋亡早期细胞形态学变化在光镜下可见细胞缩小变圆,在电镜上可见细胞质浓缩、核固缩及自噬溶酶体.4.0μmol/L As2O3作用72h后HT-29细胞凋亡率为25%.结论 As2O3能明显抑制结肠癌细胞系HT-29的增殖,其作用机制与引起凋亡及自噬密切相关.     

丙戊酸钠诱导人结肠癌细胞HT-29自噬及其机制研究

目的对丙戊酸钠诱导人结肠癌细胞HT-29发生自噬性死亡的过程进行观察,并初步探讨其可能的机制。方法用不同浓度、不同作用时间的丙戊酸钠处理人结肠癌细胞系HT-29,用细胞计数试剂盒CCK8法观察其对细胞增殖的抑制作用,丹酰戊二胺染色法观察细胞自噬,荧光测试仪检测自噬水平,荧光定量PCR法检测以下基因表达水平的变化：微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LC3-Ⅱ）、自噬相关基因Beclin-1、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）和磷酸化核糖体蛋白S6激酶（p-p70S6K）。结果随着丙戊酸钠处理浓度的递增及作用时间的延长,其对人结肠癌细胞HT-29的增殖抑制率逐渐提高,呈剂量依赖性及时间依赖性（P均﹤0.01）;同时,随着药物浓度的增加,细胞中自噬泡数量增多,荧光强度增强,与对照组比较,差异有统计学意义（P均〈0.05）。经丙戊酸钠处理后,自2 mmol/L浓度始,人结肠癌细胞系HT-29自噬相关基因LC3-Ⅱ和Beclin-1表达水平明显升高（P均〈0.01）,而mTOR、p-Akt和p-p70S6K表达水平明显降低（P均〈0.01）。结论丙戊酸钠可诱导结肠癌细胞发生自噬,其诱导结肠癌细胞发生自噬的机制可能与阻断mTOR-Akt信号转导通路及激活Beclin-1信号转导通路有关。     

丹参酮ⅡA在体外对海马神经元细胞放射性损伤的保护作用

目的探讨丹参酮ⅡA在体外对海马神经元细胞放射性损伤的影响,以及其在放射性损伤保护过程中的相关机制。方法体外培养海马神经元细胞株HT-22,实验分为对照组(Control)、照射组(RT)、照射+丹参酮ⅡA处理组(RT+Tan)、照射+丹参酮ⅡA+自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA)处理组(RT+Tan+3-MA)。采用MTT法检测各组细胞的存活分数,流式细胞技术检测细胞凋亡,Western blot检测自噬相关蛋白LC3-I、LC3-Ⅱ的表达水平。结果照射后海马神经元细胞存活分数下降,而丹参酮ⅡA能提高放射线照射后海马神经元细胞的存活分数,并减少细胞凋亡。相对于单纯照射组,RT+Tan组的海马神经元细胞HT-22的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达上升。而加入自噬抑制剂3-MA后,放射处理后的海马神经元细胞LC3蛋白表达下降,且存活分数明显下降。结论丹参酮ⅡA能明显减轻放射线在体外对海马神经元细胞的放射损伤作用,其保护机制可能与调节放疗过程中自噬相关。     

曲古抑菌素A体外对结肠癌细胞凋亡及低氧状态下其缺氧诱导因子-1α表达的影响

目的:观察曲古抑菌素A(TSA)体外对结肠癌HT-29细胞凋亡及低氧状态下其缺氧诱导因子(HIF)-1α表达的影响.方法:体外培养结肠癌HT-29细胞,给予TSA 100、200、400、600、800 nmol/L分别处理12、24、48、72h,对照组加入同等体积的DMSO.MTT法检测各组HT-29细胞的存活率;Annexin V、TUNEL法检测HT-29细胞凋亡率;RT-PCR、免疫印迹法分别检测低氧状态下(37℃、1%O2)HT-29细胞HIF-1α mRNA及蛋白的表达.结果:MTT法检测结果发现,与对照组相比,TSA处理组HT-29细胞活力明显降低(P＜0.05),随着浓度的增大、时间的延长,其抑制作用逐渐增强.Annexin V、TUNEL法检测结果发现,TSA能诱导HT-29细胞的早期凋亡,TSA(200、400、600、800 nmol/L)处理组凋亡率明显高于对照组(P＜0.05).低氧条件下,TSA抑制HT-29细胞HIF-1α蛋白的表达,随着浓度的增大,其抑制作用逐渐增强;而对HIF-1α mRNA的表达无影响.结论:TSA体外可能通过抑制低氧条件下HT-29细胞HIF-1α蛋白的表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖.     

苏林酸诱导结肠腺癌HT-29细胞凋亡的实验研究

为观察苏林酸对结肠腺癌HT-29细胞有无促凋亡作用,采用流式细胞仪检测、DN A电泳和透射电镜观察苏林酸对HT-29细胞的促凋亡作用.结果:流式细胞术、DNA电泳和透射电镜观察均显示苏林酸可诱导HT-29细胞凋亡,且具有时间和剂量依赖性.用0.3mmol/L 、0.6mmol/L和1.2mmol/L苏林酸处理48小时,凋亡细胞分别占5.8%、7.6%和11.7%,处理72 小时则分别升为12.5%、15.4%和24.2%,而对照组凋亡细胞分别占2.9%和5.1%,处理组和对照组差异显著(P＜0.05).以上结果表明,本实验条件下,苏林酸可诱导HT-29细胞凋亡,抑制其增殖.     

CAPE对人结肠癌HT-29细胞生长抑制和凋亡的作用

目的 探讨咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)对结肠癌HT-29细胞增殖和凋亡的作用.方法 用不同浓度CAPE处理HT-29,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测CAPE对HT一29细胞的增殖抑制效应;采用AO/EB染色和流式细胞仪检测细胞凋亡的发生.结果 CAPE对HT-29细胞的生长具有明显抑制作用,呈剂量和时间依赖性.AO/EB染色发现CAPE作用后凋亡细胞数量增加.流式细胞仪检测细胞凋亡率显示,2.5、5.0、7.5、10 μg,/mL处理HT-29细胞24 h后,细胞凋亡率上升,呈剂量依赖性.结论 CAPE对人结肠癌HT-29细胞具有明显的生长抑制和诱导凋亡作用.     

三氧化二砷通过自噬作用抑制A549肺癌细胞的生长

目的探讨三氧化二砷对肺癌细胞生长的影响,揭示三氧化二砷抗癌作用的机制。方法培养人肺癌细胞A549,给予不同药物浓度三氧化二砷药物处理;利用CCK8检测三氧化二砷对A549细胞活力的影响;以自噬试剂盒观测细胞的自噬情况。结果 10、25、50和100μmol/L三氧化二砷明显抑制A549的细胞活力(P<0.05)。三氧化二砷处理后镜下见阳性自噬细胞增多,自噬率增加。结论 AS2O3可抑制A549肺癌细胞生长,这种效应可能通过诱导细胞自噬来发挥作用。     

在人类非小细胞肺癌细胞A549中沉默K-Ras降低自噬水平

目的:在人的非小细胞肺癌细胞A549中通过降低K-Ras表达研究其在自噬中的作用.方法:磷酸钙方法转染K-RasshRNA,Western blot检测自噬标志物的变化.结果:在A549细胞中,通过K-Ras-shRNA慢病毒转染显著地降低了K-Ras 的蛋白水平,同时自噬标志物LC3Ⅱ水平降低,自噬调控分子Beclin-1水平降低.结论:K-Ras knockdown引起细胞自噬水平的降低.     

抗菌肽LL-37对结肠癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及其机制

目的：探讨抗菌肽LL-37对结肠癌小鼠肿瘤生长和细胞凋亡的影响,阐明其抗肿瘤作用的可能分子机制。方法：构建LL-37过表达结肠癌HT-29细胞,采用qRT-PCR和Western blotting法检测HT-29细胞中LL-37 mRNA和蛋白表达水平。30只BALB/c小鼠随机分为对照组（给予未经感染的HT-29细胞）、空载组（给予感染空载质粒的HT-29细胞）、LL-37过表达组（给予感染LL-37过表达载体的HT-29细胞）、AMPK抑制剂组[给予感染空载体的HT-29细胞后,立刻尾静脉注射2 mg·kg^-1（Dorsomorphin,Dor）]和联合组（给予感染LL-37过表达载体的HT-29细胞后,立刻尾静脉注射2 mg·kg^-1 Dor）,每组6只。采用结肠癌HT-29细胞复制结肠癌小鼠模型,观察各组小鼠肿瘤体积并绘制生长曲线,感染24 d后剥离肿瘤测量质量并计算抑瘤率,TUNEL染色检测各组小鼠肿瘤细胞凋亡情况,Western blotting法检测各组小鼠肿瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ及AMPK/mTOR通路相关蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR及p-mTOR表达水平。结果：与对照组和空载组比较,LL-37过表达组小鼠结肠癌HT-29细胞中LL-37 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,肿瘤质量和体积明显降低（P<0.05）,抑瘤率升高（P<0.05）,肿瘤细胞凋亡数减少,肿瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值均明显升高（P<0.05）,p-mTOR/mTOR比值明显降低（P<0.05）;与空载组比较,AMPK抑制剂组小鼠肿瘤质量和体积明显升高（P<0.05）、抑瘤率降低（P<0.05）,肿瘤细胞凋亡数减少,自噬相关蛋白Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值明显降低（P<0.05）,p-mTOR/mTOR比值明显升高（P<0.05）;与LL-37过表达组比较,联合组小鼠肿瘤组织中Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值明显降低（P<0.05或P<0.01）,p-mTOR/mTOR比值明显升高（P<0.01）。结论：抗菌肽LL-37能激活AMPK/mTOR信号通路促进细胞自噬,进而抑制结肠癌HT-29荷瘤小鼠的肿瘤生长。     

印苦楝内酯通过阻滞细胞周期和上调p21蛋白抑制结肠癌细胞HT-29的增殖

印苦楝内酯(nimbolide)是从楝Azadirachta indica A.种子中提取的天然三萜类化合物,作者研究了该化合物对人结肠癌HT-29细胞生长的抑制作用。分别进行了细胞生长试验、细胞周期分析、DNA片断分析、Annexin V-PI实验、蛋白质印迹分析和碱性磷酸酶活性检测。结果显示,印苦楝内酯抑制HT-29细胞生长的作用具有浓度和时间相关性,以其(浓度为2.5~10μmol/L)处理细胞12、48h,抑制率分别为35%~68%和57%~89%。用2.5μmol/L的印苦楝内酯处理HT-29细胞12h,停滞在G2/M期的细胞数比对照组增加了6.5倍;且随作用时间的延长,在G2/M期细胞数的增加的…     

姜黄素对结肠癌HT-29细胞生长增殖、细胞周期分布及CyclinD1基因表达的影响

目的 观察姜黄素对人结肠癌HT-29细胞生长增殖、细胞周期分布的影响,并探讨可能的机制.方法 培养对数生长的人结肠癌HT-29细胞,用不同浓度的姜黄素-1640培养基进行培养.选取24、48、72 h时间节点,观察细胞生长的形态学差异.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测姜黄素对HT-29细胞的生存抑制率,流式细胞术检测加入姜黄素前后HT-29细胞的周期分布改变,并对药物处理前后的CyclinD1基因表达进行检测比较.结果 在加入姜黄素稀释液后,HT-29细胞生长明显变慢,形状由饱满变得细长,脱壁增多.MTT提示姜黄素能明显抑制HT-29细胞生长,并呈时间和浓度依赖性.流式细胞术显示姜黄素能诱导明显的G0/G1期阻滞,24、48、72 h时G1期比例分别为38.2％、44.6％、49.3％,相对对照组差异有统计学意义(P＜0.05).蛋白免疫印迹(Western blot)实验发现姜黄素能明显降低HT-29细胞中的CyclinD1基因表达,并随作用时间的延长,抑制作用更强.结论 姜黄素能明显抑制人结肠癌HT-29细胞细胞周期CyclinD1基因表达,并诱导细胞G1期阻滞.     

氯喹通过诱导凋亡增强5-氟尿嘧啶的抗结肠癌效果

目的:探讨结肠癌化疗药物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)与各个阶段的自噬抑制剂联合使用后,结肠癌细胞的增殖和凋亡情况,以寻找合适的治疗结肠癌的药物。方法:自噬三个阶段的抑制剂与5-FU联合使用处理结肠癌细胞系HT-29和SW480后,MTT方法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,western blot检测细胞自噬和凋亡情况。结果:5-FU能诱导结肠癌细胞的自噬和凋亡。3-甲基腺嘌呤(3 methyladenine,3-MA)和氯喹(Chloroquine,CQ)均能增强5-FU诱导的结肠癌细胞凋亡,而CQ的增强效果更加明显。同时,又进一步证明了CQ可诱导结肠癌细胞发生caspase依赖的结肠癌细胞凋亡。结论:CQ有望成为一种能与5-FU联合使用治疗结肠癌的有效化疗药物。     

曲古抑菌素A体外对结肠癌细胞凋亡及低氧状态下其缺氧诱导因子-1α表达的影响

目的：观察曲古抑菌素A（TSA）体外对结肠癌HT-29细胞凋亡及低氧状态下其缺氧诱导因子（HIF）-lα表达的影响。方法：体外培养结肠癌HT-29细胞，给予TSA100、200、400、600、800nmol／L。分别处理12、24、48、72h，对照组加入同等体积的DMSO。MTT法检测各组HT-29细胞的存活率；AnnexinV、TUNEL。法检测HT-29细胞凋亡率；RT-PCR、免疫印迹法分别检测低氧状态下（37℃、1％O2）HT-29细胞HIF-1α mRNA及蛋白的表达。结果：MTT法检测结果发现，与对照组相比，TSA处理组HT-29细胞活力明显降低（P〈0.05），随着浓度的增大、时间的延长，其抑制作用逐渐增强。AnnexinV、TUNEL法检测结果发现，TSA能诱导HT-29细胞的早期凋亡，TSA（200、400、600、800nmol／L。）处理组凋亡率明显高于对照组（P％0．05）。低氧条件下，TSA抑制HT-29细胞HIF-1α蛋白的表达，随着浓度的增大，其抑制作用逐渐增强；而对HIF-1α mRNA的表达无影响。结论：TSA体外可能通过抑制低氧条件下HT-29细胞HIF-1α蛋白的表达，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。     

β-淀粉样蛋白Aβ25-35诱导HT22细胞自噬及其对V-ATPase表达的影响

【目的】探讨β-淀粉样蛋白Aβ25-35诱导HT22细胞产生自噬及与V-ATPase变化的关系。【方法】将HT22细胞分为对照组、无血清培养组、Aβ处理组和Aβ+Bafilomycin A1组,不同浓度的Aβ25-35作用于HT22细胞24 h,用CCK8测定细胞活力变化,免疫细胞荧光检测自噬斑点变化,及Western blot检测LC3、V-ATPase蛋白变化。【结果】Aβ可以诱导HT22细胞出现明显的自噬现象,且这种自噬同Aβ的浓度以及作用时间具有一定的相关性。V-ATPase的表达伴随自噬的增多也逐渐增多。Bafilomycin A1可以进一步诱导V-ATPase增加,增加细胞内自噬体的聚积。【结论】Aβ25-35可诱导HT22细胞产生自噬,且与V-ATPase表达有关。     

自噬在电离辐射诱导的小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用

目的 探讨自噬在电离辐射诱导小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用.方法 将小鼠精母细胞GC-2分为空白对照组和不同剂量(2、4和8 Gy)60Co辐射处理组.采用原位末端转移酶标记法(TUNEL法)和流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过蛋白质印迹实验观察自噬相关蛋白LC3(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)和Beclin1表达水平的改变,使用荧光显微镜观察C,C-2细胞内自噬小体的变化.用5mmol/L自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,观察自噬抑制剂联合电离辐射对细胞凋亡率的影响以及自噬相关蛋白表达水平的改变.结果 与空白对照组相比,GC-2细胞经60Co辐射处理后细胞凋亡率升高(P＜0.05),荧光显微镜下可见细胞自噬体明显增多,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平增加(P＜0.05).预先用5mmol/L 3-MA处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平与未经3-MA处理组相比降低(P＜0.05),细胞凋亡率升高(P＜0.05).结论 电离辐射可以诱导精母细胞发生自噬,抑制细胞自噬后可增强电离辐射对精母细胞的杀伤作用.     

胃泌素拮抗剂和活化T淋巴细胞联合应用对结肠癌细胞的杀伤作用

目的:探讨联合应用胃泌素拮抗剂和CD28/CD80单克隆抗体共刺激活化的健康人外周血T淋巴细胞(PBLs)在体外对结肠癌细胞株HT-29的杀伤作用.方法:分离与体外培养外周血PBLs,并用CD28/CD80共刺激活化PBLs;用含活化的PBLs和(或)胃泌素拮抗剂CI-988的RPMI 1640培养基培养HT-29细胞.MTT法检测2者对HT-29细胞的杀伤率,并用电镜观察效应细胞杀伤结肠癌细胞株HT-29的超微结构及HT-29细胞的凋亡情况.结果:胃泌素拮抗剂与活化PBLs合用,对结肠癌细胞株HT-29的杀伤率((95.81±1.99)%)大于单用胃泌素拮抗剂((66.36±1.31)%)(P＜0.05).电镜结果显示,效应细胞作用12 h肿瘤细胞就发生部分坏死,部分肿瘤细胞可见凋亡.结论:联合应用活化的PBLs和胃泌素拮抗剂CI-988可以提高对结肠癌细胞株HT-29 杀伤作用.活化的淋巴细胞杀伤结肠癌细胞可能是通过诱导肿瘤细胞坏死及凋亡2条途径来实现.     

MitoQ通过NIX介导的线粒体自噬对肺腺癌A549细胞迁移及凋亡的影响

目的 探讨Mitoquinone(MitoQ)通过NIX介导的线粒体自噬对人肺腺癌A549细胞迁移及凋亡的影响.方法 不同浓度的MitoQ诱导A549细胞12 h,利用CCK-8检测细胞存活率,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot检测NIX、p62及Bax等线粒体自噬及凋亡相关蛋白表达.结果 与对照组比较,各MitoQ组细胞发生明显的增殖及细胞迁移抑制.并且随着凋亡的发生,自噬促进相关蛋白NIX表达上调,自噬抑制相关蛋白p62表达下调,凋亡促进相关蛋白BaX表达上调,并且伴随着MitoQ浓度的升高差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组相比,MitoQ组细胞表现出迁移及增殖能力下降,线粒体自噬及凋亡水平升高.结论 MitoQ能抑制A549细胞的迁移及增殖,促进A549细胞凋亡,其机制可能与MitoQ调节线粒体自噬通路上的关键分子诱导A549细胞自噬有关,该自噬的关键分子可能为NIX蛋白.     

姜黄素联用5-Fu对人结肠癌细胞凋亡的影响

目的 探讨姜黄素联用5-Fu对结肠癌细胞凋亡的影响.方法 以姜黄素与5-Fu联用的HT-29细胞作为实验组,5-Fu作用的HT-29细胞作为对照组,通过EMSA检测各组结肠癌HT-29细胞核转录因子-κB(NF-κB)的激活情况.利用MTT比色法检测各组细胞增殖的情况,吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)双染法显微镜观测以及PI/Annexin-V双染流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况.结果 应用了姜黄素的HT-29细胞NF-κB的激活明显受到抑制;与5-Fu作用的HT-29细胞组比较,5-Fu联合姜黄素作用于HT-29细胞后,HT-29细胞增殖受到明显抑制,5-Fu诱导HT-29细胞凋亡作用增强;姜黄素增强了5-Fu对HT-29细胞增殖抑制的能力以及诱导HT-29细胞凋亡的能力.结论 姜黄素抑制了肿瘤细胞NF-κB的激活,具有增强5-Fu诱导结肠癌细胞凋亡的能力,其可能的机制是抑制了肿瘤细胞NF-κB的激活,姜黄素对肿瘤的治疗以及预后起积极作用.     

α-生育酚通过抑制mTOR激活小鼠海马神经元细胞自噬

目的 探究α-生育酚对小鼠海马神经元细胞自噬的影响及分子机制.方法 分别以自噬抑制剂Compound C、α-生育酚处理小鼠海马神经元细胞,采用AO染色法检测不同处理后神经元内自噬泡的数量;利用透射电镜观察自噬小体;通过免疫蛋白质印记法检测自噬相关蛋白LC3-II、P62以及上游调控蛋白mTOR、AMPK和ULK1表达水平.结果 Compound C显著抑制LC3-II水平并且上调P62的表达,减少自噬泡及自噬小体的数量;加用α-生育酚处理后LC3-II表达提高,P62和mTOR水平均被抑制,且自噬泡和自噬小体数量提高.结论 α-生育酚能够诱导细胞发生自噬,这一作用可能与抑制mTOR信号通路相关.     

HT-29细胞生长增殖的影响及其机制初探

目的 研究经过温热、放射及热放联合处理后人大肠癌HT-29细胞系生长增殖的变化情况。方法 温热、放射及热放联合处理后，观察不同处理方法对体外培养人大肠癌TH-29细胞系在电镜下的形态改变。结果 与单纯温热或照射相比，联合处理后的HT-29细胞生长和增殖能力受到更明显的抑制，同时明显增加了HT-29细胞的凋亡比例：温热对HT-29细胞杀伤作用以胞浆损伤尤为明显，照射对HT-29细胞杀伤作用表现在以细胞凋亡形式为主的细胞核损伤，经联合处理造成胞浆与核的共同损伤。结论 与单纯温热或照射处理相比，联合处理能够更明显抑制HT-29细胞的生长增殖能力，加重细胞损伤；温热、照射联合杀伤效应机制可能在于两种处理侧重于不同的靶结构。