人参RAPD指纹鉴定的毛细管PCR方法

本实验建立并优化了用毛细管PCR扩增人参RAPD指纹的反应体系，讨论了用毛细管PCR方法扩增RAPD指纹在中药材鉴别上的应用前景。     

补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR条件优化

目的对补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系及扩增程序进行优化,检测PCR优化体系的适用性和灵敏性。方法通过改进引物设计、改变PCR反应过程中Mg2＋浓度、引物浓度、退火温度、模板DNA浓度及反应循环次数,分析比较PCR扩增效果。结果优化后的补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系中,Mg2＋浓度在2-4mmol/L,引物浓度在0.025-0.4μmol/L,循环次数在30-45次之间均能扩增得到清晰均一的特异性条带;同时,引物退火温度在55.5℃-69.6℃范围内均适用;优化后PCR体系能够检测的最低DNA浓度为1.41ng/μl,即模板DNA在反应体系中的总量为约2.82ng.结论已经建立的优化后的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

RT-SHIV rt基因单拷贝PCR扩增方法的建立及初步应用

目的建立RT-SHIV病毒全长rt基因单拷贝PCR扩增方法,用于HIV-1 rt基因体内遗传与变异研究。方法 Oligo软件设计RT-SHIV rt基因特异性扩增引物,梯度稀释方法进行特异性和灵敏度筛选,进而优化退火温度和PCR反应最佳循环数等条件,建立rt基因PCR扩增方法;在此基础上将模板进行有限稀释,摸索rt基因单拷贝PCR扩增条件;使用该方法扩增感染猴体内RT-SHIV病毒rt基因,BioEdit软件进行基因序列分析。结果筛选得到一组巢式PCR引物,成功建立了RT-SHIV rt基因PCR扩增方法;当模板浓度为100 copies/μL时,扩增产物为单拷贝序列;测序结果显示RT-SHIV感染猴d266和d294血浆样本分别存在1处和6处氨基酸突变。结论本研究建立的全长rt基因单拷贝PCR扩增方法特异性好、灵敏度高、重复性强,可以应用于各类RT-SHIV病毒的全长rt基因分析。     

DMSO对PCR扩增反应的影响

为解决扩增δ－受体基因屡次失败的问题,观察了在PCR体系加入不同浓度DMSO时对DNA扩增反应的影响。结果表明：一定浓度在DMSO可显著提高PCR扩增的特异性和扩增效率。     

基于FOK1酶体系的PCR防污染法及在产前诊断中的应用

目的：建立一种有效、实际操作强的聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）防污染法并用于产前检测叶酸利用能力。方法：在1条引物的5′端加入限制性内切酶FOK1的识别序列,将FOK1酶加入PCR扩增反应体系中,切断污染的前PCR产物,考察体系中FOK1酶的用量、酶切扩增一体式反应体系成分的比例及污染量的可控程度,并应用于亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR）基因上C677T突变位点的分析。结果：FOK1酶最佳反应体系却抑制PCR扩增;在TaKaRa反应体系中,0.5 U FOK1酶可完全切割≤0.1 μL含有酶切位点的前扩增产物,且成功扩增,而不加入FOK1酶无法控制假阳性结果。FOK1酶切防污染法成功用于MTHFR C677T的测序检测。结论：本方法有效便捷,完全实现了闭管防止PCR污染,不影响后续测序反应,不仅可适用于以PCR扩增为基础的产前诊断等测序分析,更可广泛应用于所有涉及核酸扩增诊断的实验室防治PCR污染中。     

基于pJFH-1的HCV全基因组扩增方法的建立

目的基于pJFH-1建立能稳定扩增HCV全基因组的长链PCR方法。方法以pJFH-1为测试模板,通过优化PCR扩增中各个重要环节,包括引物的选择、甘油和/或DMSO最适浓度的筛选、循环条件的摸索等,建立能稳定扩增HCV全基因组的长链PCR方案。结果高Tm值(>65℃)的引物更有利于HCV全基因组的扩增;5%、10%甘油或5%DMSO可显著提高PCR扩增的特异性和扩增效率,且甘油的促进作用优于DMSO;双温法较三温法能获得更高产量的PCR产物。结论通过优化长链PCR反应体系及条件,成功实现HCV基因全长的扩增。     

PCR扩增肺癌组织puma基因第四外显子的实验研究

目的探讨PCR扩增肺癌组织中puma基因第四外显子（GC含量76．44％）的最适实验条件．方法通过改变PCR反应体系各组分的浓度和反应条件,探讨PCR反应体系最适浓度和反应条件．结果PCR反应体系为dNTP200μmol／L,普通MgCl2 1．0mmol／L,引物500nmol／L,TaqDNA聚合酶0．1U／μL,模板量不低于4000ng,普通10×扩增体系缓冲液5μL,总体积50μL.反应条件为94℃预变性5min,94℃ 45s、61℃ 45s、72℃ 45s循环33次,最后72℃延伸5min．结论确立了puma基因第四外显子的PCR扩增条件,为后续的突变研究奠定了基础．     

多重PCR技术筛选Co^a、Lu^b、Yt^a、Kp^b阴性稀有血型方法的建立

目的采用多重PCR筛选技术建立一个PCR反应体系,同时扩增Co^a、Lu^b、Yt^a、Kp^b阴性稀有血型,并应用于无偿献血人群稀有血型的筛选与建库。方法根据Co^a、Lu^b、Yt^a、Kp^b血型基因核心序列设计相应引物,采用多重PCR体系对献血者模版DNA进行扩增,对扩增产物进行电泳分析,根据是否扩增出对应片段图谱判断该稀有血型基因的存在。结果随机抽取500名献血者进行筛选鉴定,没有发现Co^a、Lu^b、Yt^a、Kp^b阴性的稀有血型。结论该方法能在一个反应体系内同时扩增4个稀有血型,具有准确、高效的优点,可在无偿献血人群稀有血型的筛选与建库工作中应用。     

引物浓度与退火温度不当导致巢式PCR非特异性扩增

目的 探索巢式PCR非特异性扩增的产生原冈及消除方法.方法 以巢式PER扩增乙型肝炎病毒(HBV)S gene为模型,分别使用小同退火温度组合与不同引物浓度组合进行巢式PCR扩增,观察并分析实验结果.结果 降低引物浓度或提高退火温度均可消除巢式PCR的非特异性扩增,但提高退火温度有可能影响反应的扩增效率,导致产物量下降甚至得不到产物.结论 巢式PCR发牛非特异性扩增时,可以提高退火温度或降低引物浓度对反应体系进行优化.     

采用多重PCR技术筛选k、Js~b及Di~b阴性稀有血型

目的利用多重PCR筛选技术,建立一个PCR-ssp反应体系同时扩增k、Jsb、Dib阴性稀有血型。方法根据k、Jsb、Dib血型基因核心序列设计相应引物,采用序列特异引物引导的PCR反应(PCR-SSP)体系对献血者模板DNA进行扩增,对扩增产物进行电泳分析,根据是否扩增出目标片段图谱判断该稀有血型基因的存在。结果随机抽取参加献血的600例进行筛选鉴定,没有发现k、Jsb、Dib阴性的稀有血型。结论该方法能在一个反应体系内同时扩增3个稀有血型,具有准确、高效的优点,可应用于献血人群k、Jsb、Dib阴性稀有血型的筛选与建库工作。     

用PCR技术直接检测白色念珠菌DNA的实验研究

目的建立和评价直接用PCR从血标本中检测白色念珠菌核酸的方法。方法用红、白细胞裂解液、破壁酶和真菌DNA提取盒直接处理血标本,得到的微量靶DNA用白色念珠菌种特异性引物进行扩增。结果在白色念珠菌制备的人血标本中检测出靶DNA,其敏感性达10个孢子/ml以下,从处理标本到报告结果仅需6h。结论用PCR法可特异、敏感地从血标本中直接检测白色念珠菌核酸,有助于临床快速诊断深部白色念珠菌感染。     

改良的降落PCR与普通PCR结果比较

目的：设计并验证一改良的降落PCR(MTD—PCR)程序。方法：自盐藻bardawi1中提取基因组DNA作为PCR模板，使用TaqDNA聚合酶及pfu DNA聚合酶，运用普通PCR和MTD—PCR程序，扩增胡萝卜素生物合成相关基因(cbr)上游启动子序列，并电泳比较PCR扩增产物的特异性。结果：使用普通Taq酶进行PCR，普通PCR程序产生200bp，500bp和1272bp的3条带，而MTD—PCR程序仅克隆出1272bp的特异带；利用高保真的pfu DNA聚合酶作PCR，在MTD—PCR泳道中也仅有1272bpl条带，而普通PCR除了产生1272bp的特异带外，还出现1条500bp的非特异带。结论：无论使用普通Taq酶或高保真酶pfu，改良的MT—PCR程序均明显提高PCR的特异性，提示它可用于克隆普通PCR难以克隆的基因片段，或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

DNA甲基化PCR方法的优化

【目的】优化DNA甲基化PCR的反应体系及扩增参数，为基因甲基化的研究建立一个最佳的PCR方法。【方法】以MHCC-97H肝癌细胞株AFP基因启动子区为模板，分析DNA甲基化反应体系中Mg^2＋、TaqDNA聚合酶用量、加入时间、退火温度及循环方式对甲基化PCR扩增的影响。【结果】反应体系20μl：模板DNA（MoDNA），2μl；正向引物，1μl；反向引物，1μl；10×PCR Buffer，2．5μl；2mmol／LdNTPs，2．5μl；Taq酶，0．4μl；MgCl2，2μl；H2O，8．6μl。PCR程序采用Touch Down PCR。【结论】优化了适用于AFP基因甲基化PCR的反应体系，为利用甲基化PCR分析方法研究肝癌等肿瘤发生机制奠定基础。     

荧光定量PCR在医学诊断中的应用

实时荧光定量PCR(Real time fluorescent quantitative PCR)是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术。该技术通过荧光信号的积累来实时监测整个PCR进程,使PCR扩增和终产物检测全部处在封闭的条件下进行,从而具有实时监测、无污染、快速、灵敏、精确、特异等特点,极大地克服了原有PCR技术的不足。目前该技术已经广泛应用于肿瘤学、遗传学、免疫学、微生物学、寄生虫学和基因治疗等领域。     

荧光定量PCR在医学诊断中的应用

实时荧光定量PCR(Real time fluorescent quantitative PCR)是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术。该技术通过荧光信号的积累来实时监测整个PCR进程,使PCR扩增和终产物检测全部处在封闭的条件下进行,从而具有实时监测、无污染、快速、灵敏、精确、特异等特点,极大地克服了原有PCR技术的不足。目前该技术已经广泛应用于肿瘤学、遗传学、免疫学、微生物学、寄生虫学和基因治疗等领域。     

Real-time PCR与常规PCR在Q热立克体检测中的比较

目的比较与评价Real-time PCR与常规PCR,寻求适合于Q热患者早期诊断的方法。方法应用Taq Man探针定量PCR、SYBR Green染料定量PCR、巢式PCR和普通PCR四种方法分别对T-A克隆的Q热立克次体基因htp AB片断进行灵敏性、特异性和重复性检测及评价。结果 Taq Man PCR方法的灵敏度分别为SYBR Green PCR、巢式PCR和普通PCR的10倍、10倍和100倍。重复性测试Taq Man法Ct变异系数CV:0.2%~3.0%,SYBR Green法的CV:0.3%~6.0%。Taq Man和SYBR Green PCR均耗时约1h,巢式PCR耗时约2.5h,普通PCR耗时约1.5h。四种方法检测25种相关病原菌结果均为阴性。结论 Taq Man探针定量PCR方法具有很好的特异性、灵敏性、重复性和可操作性,可用于Q热患者临床早期诊断。     

LightCycler实时监测PCR定量分析血清HBV DNA

目的 检验LightCycler实时监测PCR（real-time detection PCR,RTD-PCR)对血清中HBV DNA定量检测的灵敏性和可重复性，探讨HBV血清标志物与HBV DNA定量的关系。方法 HBV定量按深圳匹基公司乙肝PCR荧光检测试剂盒使用说明，对乙肝标志物已明确的773例血清中HBV DNA定量结果进行统计分析。结果 实时监测PCR对血清中HBV DNA定量检测的灵敏性高，可检测低至1000拷贝／ml血清；可重复性好，批间误差＜20％；各种标志物类型的血清HBV DNA含量分布情况表明，HBV血清标志物中HBeAg与HBV DNA含量有明显的关系，一般HBeAg阳性血清HBV DNA含量较高，但也有相当一部分例外。结论 LightCycler实时监测PCR对血清中HBV DNA定量检测灵敏性高可重复性好；仅根据HBV血清标志物往往不能确定乙肝患者HBV DNA复制水平的高低，HBV DNA定量检测具有十分重要的临床意义。     

多重巢式和定量PCR联合应用提高SARS病毒检测率

目的寻求一种可靠、可行的对急性严重呼吸道综合征病毒的早期诊断方法。方法应用多重巢式PCR联合荧光实时定量方法，对广州地区91份确诊和疑似病例标本、25份健康志愿者标本同时进行检测。结果25份健康志愿者标本经两种方法检测均为阴性。91份确诊和疑似病例标本经多重巢式PCR方法检测，阳性标本数53例，总阳性检测率58．24％；荧光实时定量PCR检测阳性标本数68例，阳性检出率74．73％；两种方法联合，阳性标本数76例，阳性检出率83．52％。结论多重巢式PCR联合荧光实时定量方法可进一步提高SARS病毒的阳性检出率，也为今后应对可能发生的其它突发性传染病病毒的检测提供分子诊断基础。     

鉴定定量PCR不同引物对的扩增效率

目的:采用载体构建及荧光定量PCR的方法比较BCL2等位基因不同部位PCR引物在定量分析中的扩增效率,判断其用于不同等位基因转录活性分析的可靠性。方法:用PCR扩增包含定量PCR目的片段的序列,然后将扩增产物分别插入pGEM-TEasy载体中,构建TA3重组载体,再以TA3载体为模板,采用荧光定量PCR方法比较引物对之间扩增效率。结果:定量PCR结果显示引物对之间扩增效率无明显差异。结论:所检测的PCR引物对之间的扩增效率一致,可用于比较分析mbr /mbr-Nalm-6杂合子细胞系中两个等位基因表达活性。