基于FOK1酶体系的PCR防污染法及在产前诊断中的应用

目的：建立一种有效、实际操作强的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）防污染法并用于产前检测叶酸利用能力。方法：在1条引物的5′端加入限制性内切酶FOK1的识别序列，将FOK1酶加入PCR扩增反应体系中，切断污染的前PCR产物，考察体系中FOK1酶的用量、酶切扩增一体式反应体系成分的比例及污染量的可控程度，并应用于亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因上C677T突变位点的分析。结果：FOK1酶最佳反应体系却抑制PCR扩增；在TaKaRa反应体系中，0.5 U FOK1酶可完全切割≤0.1 μL含有酶切位点的前扩增产物，且成功扩增，而不加入FOK1酶无法控制假阳性结果。FOK1酶切防污染法成功用于MTHFR C677T的测序检测。结论：本方法有效便捷，完全实现了闭管防止PCR污染，不影响后续测序反应，不仅可适用于以PCR扩增为基础的产前诊断等测序分析，更可广泛应用于所有涉及核酸扩增诊断的实验室防治PCR污染中。

Controlling carryover PCR contamination based on FOK1 enzyme system and its application in prenatal diagnosis