腺病毒介导TK/GCV基因系统联合肿瘤坏死因子对膀胱癌细胞的体外杀伤作用

目的 研究腺病毒介导TK/GCV系统联合肿瘤坏死因子(TNF-?)对膀胱癌细胞的体外杀伤作用.方法 采用含有TK基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒(adv )转染MB49细胞,观测转染率,RT-PCR检测转染细胞TK基因产物.以MB49细胞为对照,测定不同浓度TNF-?作用下MB49细胞、不同浓度GCV作用下MB49/TK细胞的存活率,采用GCV联合低浓度TNF-?对MB49/TK细胞进行体外杀伤研究;流式细胞仪检测TK/GCV、TNF-?、TNF-? TK/GCV对MB49细胞作用8 h后细胞凋亡情况.结果 随着浓度的增高GCV对MB49/TK细胞、TNF-?对MB49细胞的生长抑制率逐渐增高.GCV联合TNF-?对细胞杀伤率均较同浓度下单纯GCV及单纯TNF-?作用时的细胞杀伤率有明显增强,且随TNF-?浓度增高联合治疗组杀伤效率增强:单纯50 ?g/ml GCV组、5 ?g/ml TNF-? 50 ?g/ml GCV组、20 ?g/ml TNF-? 50 ?g/ml GCV组杀伤率分别(24.39±1.10)％、(40.05_ 0.97)％、(65.47±0.67)％.流式细胞仪检测细胞周期示TK/GCV、TNF-?、TK/GCV TNF-?组作用细胞8 h均可见典型sub-G1期细胞凋亡峰,联合作用组凋亡率最高.结论 TNF-?能明显增强TK/GCV自杀基因系统对膀胱癌的杀伤作用,两者联合能够有效促进膀胱癌细胞的凋亡.     

腺病毒介导的HSV-TK/GCV系统对PVNS滑膜细胞的杀伤作用

目的〓〖HTK〗探讨腺病毒介导HSV-TK/GCV系统对色素沉着绒毛结节滑膜炎(PVNS)滑膜细胞的体外杀伤作用。〖HTW〗方法〓〖HTK〗将含LacZ基因的重组腺病毒载体Ad-LacZ转染PVNS滑膜细胞, X-gal染色法确定腺病毒对该细胞的转染效率，PCR检测转染细胞中HSV-TK基因的表达，MTT法检测TK阳性细胞对GCV的体外敏感性及旁观者效应，流式细胞仪检测HSV-TK/GCV系统作用后细胞的凋亡及坏死。〖HTW〗结果〓〖HTK〗感染复数为120时，近100％的细胞可被转染。HSV-TK/GCV系统对PVNS滑膜细胞的杀伤作用十分明显，且存在明显的旁观者效应。HSV-TK/GCV系统作用后细胞出现明显的凋亡及坏死。〖HTW〗结论〓〖HTK〗HSV-TK/GCV系统可明显杀伤PVNS中过度增殖滑膜细胞，可望用于PVNS的治疗。     

HSV-TK/GCV系统对鼠膀胱癌远距离旁观者效应的实验研究

目的探讨单纯疱疹病毒胸腺激酶(HSV-TK）基因联合羟基无环鸟苷(GCV)对体内膀胱癌的远距离旁观者效应的效果。方法将转染HSV-TK基因的膀胱癌细胞和未转染HSV—TK的膀胱癌细胞分别种植于小鼠双侧背部;给予GCV治疗,观察肿瘤的大小变化,小鼠存活天数改变,及膀胱癌细胞病理学改变。结果在HSV—TK/GCV系统作用下,转染HSV-TK的TK 肿瘤大小明显小于对照组,肿瘤生长受到抑制;但对侧未转染HSV-TK基因的TK-肿瘤产生远距离旁观者效应不明显。结论HSV—TK／GCV系统对体内其他部位未转染HSV-TK基因膀胱癌细胞产生远距离旁观者效应不明显。     

腺病毒介导的HSV-tk/GCV系统对肺癌细胞的杀伤作用

目的：用含HSV-tk重组腺病毒载体转染Lewis肺癌细胞,探讨其对肺癌细胞的杀伤作用。 方法：利用同源重组技术构建含HSV-tk基因的重组腺病毒载体(AdCMVtk),将含LacZ基因的腺病毒载体(AdCMVLacZ)转染Lewis肺癌细胞,X-gal染色后,测定腺病毒对该细胞的转染率,并观察AdCMVtk/GCV系统对Lewis肺癌细胞存活率的影响。 结果：随着AdCMVLacZ的病毒量（MOI）增加,对Lewis细胞转染率也增加,当MOI为500时,转染率可达100%。AdCMVtk/GCV系统可明显杀伤Lewis细胞, 且随着AdCMVtk的MOI增加,或GCV浓度的增加,细胞存活率减少,但单独使用AdCMVtk或GCV时,对Lewis细胞无杀伤作用。AdCMVtk/GCV系统对该细胞的杀伤作用具有明显的旁观者效应,20%Lewis细胞被AdCMVtk转染可引起74%细胞死亡。 结论：AdCMVtk/GCV系统杀伤肿瘤细胞既有效又安全。     

hTERT启动子调控的野生型p53基因对膀胱癌细胞的靶向性抑制作用

目的:探讨人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的野生型p53基因的靶向性表达,观察对人膀胱癌细胞株T24的选择性杀伤效应及细胞凋亡的影响。方法:采用脂质体转染法,将构建的含hTERT启动子调控表达人野生型p53基因和报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,分别转染膀胱癌细胞株T24和正常人胎肺成纤维细胞,应用荧光显微镜、电镜、台盼蓝拒染法及流式细胞仪等方法,观察基因的靶向性表达及对膀胱癌细胞株T24细胞形态学、生长抑制曲线及细胞周期变化的影响。结果:转染hTERT启动子调控的目的基因可在端粒酶阳性的膀胱肿瘤细胞中靶向性表达发出绿色荧光。靶向转染野生型p53基因能抑制膀胱癌细胞生长,72h后细胞生长抑制率分别为48.5%、高于常规培养组3.6%和阴性对照组2.5%,差异有显著性意义(P<0.05)。电镜可见典型的凋亡细胞。细胞周期分析G0和G1期细胞比例明显增高,并出现凋亡峰。结论:构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥靶向性抑制膀胱癌细胞生长作用。     

CD-TK双自杀基因系统对前列腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨CD-TK融合双自杀基因对前列腺细胞的杀伤作用.方法 应用缺陷性腺病毒载体将CD-TK融合双自杀基因以及绿色荧光蛋白基因(GFP)转染RM-1细胞,以GFP是否表达作为间接鉴定转染成功的标志,以RT-PCR鉴定作为是否转染的标准.联合前药5-FC和/或GCV作用于转染了CD-TK基因的RM-1细胞,以MTT法检测自杀基因系统对转染后的RM-1细胞的杀伤作用,以未转染的RM-1细胞作对照.结果 以腺病毒感染RM-1细胞72 h后,在荧光显微镜下可见每个细胞都能发出淡绿色荧光,表明该基因已转染到RM-1细胞中,RT-PCR可检测到转染双基因的RM-1细胞含有CD-TK基因.与对照组相比较,当GCV浓度为125 μg/ml时,转染了CD-TK基因的RM-1细胞的存活率为47.27%;与对照组相比较,当5-FC浓度为160 μg/ml时,RM-1细胞的存活率为71.56%;而两种前药联合应用时RM-1细胞的存活率为18.45%,低于单一用药组(P＜0.05).结论 CD/5-FC、TK/GCV自杀基因系统对前列腺癌细胞具有较强的杀伤作用,而应用CD-TK融合自杀基因系统明显优于单一的自杀基因系统.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶丙氧鸟苷自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用的研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对人宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用及其旁观效应。方法：采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染Hela细胞,得到带有HSV-TK基因的Hela／TK细胞,并将其用于体外实验。结果：载体HSV-TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示,当Hela／TK细胞数占混合细胞10％时,低浓度(10mg／L)的GCV就可将50％左右的肿瘤细胞杀死。GCV作用后的实验组Hela／TK细胞基因组经琼脂糖凝胶电泳后可观察到典型的DNA梯状条带。结论：逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌Hela细胞并获稳定表达,HSV-TK／GCV自杀基因系统在体外对宫颈癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观效应。     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用。方法 应用PA317细胞包装的逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统,在体外以逆转录病毒上清感染法将TK基因导入MKN28人胃癌细胞,并初步观察更昔洛韦（GCV）对转染TK基因的MKN28胃癌细胞的杀伤作用。结果：TK基因可成功转导入MKN28细胞,且对细胞的生长状态无明显影响。但对GCV的敏感性却显增加;同时还观察到显的“旁观效应”。结论：逆转录病毒介导的HSV-TK系统对人胃癌细胞有较高的转染效率,GCV对转染阳性的胃癌细胞有显的杀伤作用。     

胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞体外杀伤作用

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞的杀伤作用。方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒感染膀胱癌细胞株Mb49细胞,RT-PCR检测CD及TK表达,MTT法测定感染病毒Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性及旁观者效应。结果RT-PCR可检测到腺病毒感染的Mb49细胞中CD及TK表达,腺病毒感染的Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性增强,且细胞存活率随前药浓度增加而明显降低,联合应用杀伤效果更强。在混合培养细胞中转染细胞为10%时,GCV组、5-FC组、GCV 5-FC组细胞存活率分别为(79.55±0.88)%、(77.17±3.38)%、(49.21±1.78)%,有较强的旁观者效应。结论腺病毒载体能有效转导CD-TK融合双自杀基因在膀胱癌细胞中表达,CD-TK融合双基因系统对膀胱癌细胞有更强杀伤效果和更明显的旁观者效应,优于单基因系统,值得进一步研究。     

放疗联合TK/GCV自杀基因系统对肺腺癌细胞凋亡活性的影响

目的研究放疗联合高效表达的胸苷激酶/丙氧鸟苷(TK/GCV)自杀基因系统对人肺腺癌细胞株A549细胞凋亡活性的影响,探寻肺腺癌放化疗联合治疗的新途径。方法利用前期研究成功构建的可调控自杀基因TK高效表达的pfos-iNOS/TK治疗载体转染A549细胞筛选阳性克隆。将阳性转染细胞(转染治疗载体组)和未转染的对照细胞(未转染组)分别给予2 Gy的X射线照射和10μmol/L、1000μmol/L的GCV。荧光显微镜观察细胞凋亡情况,检测各组细胞的凋亡率。结果给予10μmol/L、1000μmol/L的GCV作用后,治疗载体组凋亡率高于未转染(P<0.05);X射线照射联合GCV作用后,转染治疗载体组大量细胞发生凋亡,而未转染组仅有少量细胞发生凋亡(P<0.01)。结论放疗联合高效表达的TK/GCV自杀基因系统显著提高了对肺腺癌细胞的杀伤作用,为肺癌治疗带来了新的希望。     

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的：研究以逆转录病毒载体介导的HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞株的旁观者效应。方法：应用脂质体及ploybrene转染技术，将重组逆转录病毒载体PLXSN－HSV－tk，导入PA317包装细胞，以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌ME180细胞（ME），建立ME／TK转化细胞株。观察GCV对ME、ME／TK细胞的存活率及旁观者效应。结果：从病毒滴度、电镜及PCR检查，证实tk基因随病毒的感染已成功地导入PA317及ME180细胞。ME／TK细胞对GCV的敏感性显著高于亲代ME细胞。ME／TK及ME＋ME／TK混合细胞还随GCV浓度的增加受到明显的抑制。ME＋ME／TK混合细胞的存活率，随ME／TK细胞比例的增加而降低，说明TK／GCV系统不但能杀伤tk^ 细胞，也能杀伤未导入tk的细胞，存在明显的旁观者效应。结论：HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞具有明显的杀伤及旁观者效应。     

5-FU、HCPT诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究

目的观察两种传统抗癌药5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin,HCPT)对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响,从细胞凋亡的角度探讨其抗癌机制,为它们的临床应用提供实验依据。方法用不同浓度的5-FU(2.5、5、7.5、15、25 mg/L)和HCPT(0.25、0.5、1、1.5、2 mg/L)分别干预人肝癌SMMC-7721细胞生长,采用倒置相差显微镜、荧光显微镜、透射电镜和DNA凝胶电泳方法观察培养不同时间(12、24、48、72 h)人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡,并比较两种药物诱导人肝癌细胞凋亡的效果。结果5-FU、HCPT均能诱导人肝癌SMMC-7721细胞产生凋亡,产生最高凋亡率的作用时间均为48 h,最佳浓度分别为7.5、1 mg/L,最高凋亡率分别为38.7%、42.6%,5-FU、HCPT两种药物诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的效果相当,而与对照组有显著性差异(P<0.01)。结论5-FU、HCPT均能诱导人肝癌SMMC-7721细胞产生凋亡,小剂量的5-FU、HCPT有望作为凋亡诱导剂用于临床肝癌治疗。     

HyTK基因转导联合丙氧鸟苷对鼠膀胱癌细胞的体外杀伤作用

目的　探索HyTK基因转导丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)对鼠膀胱癌细胞的影响。方法　脂质体介导法将PL(HyTK)SN质粒转染PA3 17细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,用逆转录病毒上清液感染T73 9细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,命名为T73 9 TK。RT PCR对T73 9 TK细胞进行鉴定。然后观察其在体外膀胱癌细胞的杀伤作用。结果　RT PCR证实HyTK基因已插入T73 9细胞并有其mRNA的表达 ,经不同浓度GCV处理后的T73 9 TK细胞均表现出有杀伤作用 ,而T73 9细胞在各个剂量的GCV作用下生长均良好。结论　GCV对转导了HyTK基因的T73 9细胞有显著杀伤作用     

自杀基因引导的旁观者效应对鼠膀胱癌的作用

目的研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase, HSVtk)基因联合丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)治疗对膀胱癌的旁观者效应.方法用逆转录病毒载体HSVtk转染鼠源性膀胱癌细胞株T739,体外检测其对GCV的敏感性.将不同比例的T739和T739TK细胞共培养观察体外旁观者效应.在同基因鼠,将不同比例的T739和T739TK细胞混合建立膀胱癌腹腔肿瘤模型.当肿瘤B超显示0.5～0.8 cm,腹腔GCV给药6 d,然后观察肿瘤大小变化及动物存活时间.结果转染HSVtk基因的T739细胞对GCV的敏感性,RT-PCR分析证实TK基因mRNA的表达.细胞混合培养发现,当T739TK细胞占10%强时就可显示出明显的旁观者效应.在GCV的作用下,动物体内肿瘤生长受到显著抑制,动物存活时间明显延长,证明存在体内旁观者效应.结论转染HSVtk基因的鼠膀胱癌细胞可引导产生体内外旁观者效应,这种效应有助于加强 HSVtk/GCV系统对膀胱肿瘤的抗癌作用.     

羟基喜树碱抑制肺癌A549细胞的体外增殖并下调Bcl-2基因的表达

摘要：目的研究羟基喜树碱对肺癌A549细胞生长抑制、细胞周期和细胞凋亡的影响。方法羟基喜树碱处理A549细胞后用吖
啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色观察细胞形态学变化,琼脂糖凝胶检测DNA片段化,用流式细胞仪测定其对细胞周期影响。利用
Annexin V-FITC/PI 检测细胞凋亡,RT-PCR 检测凋亡相关基因Bcl-2 的表达变化。结果A549 细胞经羟基喜树碱作用,提取
DNA进行琼脂糖凝胶电泳可见梯状条带。经AO/EB染色,荧光显微镜下观察到早期凋亡细胞细胞核被染成绿色,呈碎片状,晚
期凋亡细胞核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状,细胞周期S期由20%升高到60%。经1 μmol/L 羟基喜树碱处理24 h后,流
式细胞术显示A549细胞的凋亡率为18.11%,明显高于对照组细胞凋亡率（0.09%,P<0.05）。经羟基喜树碱作用后,A549细胞
Bcl-2基因表达下调70%（P<0.05)。结论羟基喜树碱可以明显抑制A549细胞增殖,诱导其凋亡,并下调Bcl-2基因表达,提示
Bcl-2下调参与了羟基喜树碱对A549细胞的抑制作用。
     

腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统靶向性治疗前列腺癌的实验研究

目的：观察腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,丙氧鸟苷（HSV—tk／GCV）自杀基因系统在人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控下对人前列腺癌细胞的靶向性体外杀伤效应。方法：利用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因感染前列腺癌细胞LNCaP和人成纤维细胞MRC-5,荧光显微镜下观察其感染效率：利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad—hTERT-HSV／TK以及Ad—CMV—HSV／TK感染LNCaP和MRC-5细胞,加入不同浓度GCV,MTY法观察受转染细胞的存活率。结果：重组腺病毒Ad—hTERT—EGFP能特异地转染LNCaP,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高（P〈0．01）,MOI为1时转染率为8．3％,MOI为1000时转染率达100％;应用GCV处理后,Ad—CMV—HSV／TK对LNCaP和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad—hTERTp—HSV／TK只杀伤LNCaP（P〈0．001）,随着MOI和GCV浓度的增加,LNCaP细胞存活率明显降低（P〈0．01）,MOI为1和GCV浓度为1μmol/L时存活率为95．4％。MOI为100和GCV浓度为1000μmol／L时存活率仅为6．1％,并有旁观者效应。结论：重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率;hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统对人前列腺癌细胞有靶向杀伤作用。