间充质干细胞复合同种异体脱钙骨的形态学观察

目的：探讨以间质干细胞（MSC）与同种异体脱钙骨复合培养法构建组织工程化生物衍生骨的可行性。方法：预先制备同种异体脱钙骨，取健康成人骨髓，用单核细胞分离液分离MSC，间充质干细胞基础培养基原代和传代培养。倒置显微镜下观察细胞生物学特性，用FITC标记的抗CD105对第3例细胞进行流式细胞鉴定，并与同种异体脱钙骨复合培养1周后行扫描电镜观察。结果：原代及传代培养的MSC增殖迅速，第3代CD105阳性细胞占64．1％，复合同种异体脱钙骨培养1周后细胞生长状态良好，增殖迅速，在材料表面形成细胞层。结论：未诱导的MSC是骨组织工程适宜的种子细胞，与同种异体脱钙骨复合可作为骨组织工程的载体。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化的实验研究

目的:探索体外分离子与培养人骨髓间充质干细胞的方法,同时研究其细胞生物学特性,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,hBMSCs),通过常规培养,在体外观察其生长特性、抗原表达等特征;然后通过条件培养基定向诱导,观察其分化潜能。结果:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,常规培养条件下,原代培养需要2～3周,转代后生长速度加快;应用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原,CD44、CD29、CD105阳性,CD45、CD06、CD34以及HLA-DR阴性;在相应条件培养基的诱导作用下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞。结论:人骨髓间充质干细胞可以从骨髓中分离并在体外培养增殖,同时在体外具有多向分化潜能,可以分化成为骨细胞,符合骨组织工程种子细胞的要求。     

人脐带间充质干细胞生物学特性及向成骨细胞分化的研究

目的:体外分离、纯化及培养人脐带间充质干细胞(WJ～MSCs),观察其生物学特性并研究其定向分化成成骨细胞的能力。方法:将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小段,剥离血管后酶解,释放细胞贴壁生长,倒置显微镜观察细胞形态,绘制第3代生长曲线;流式细胞仪测定细胞表面标记(CD105、CD73、CD90、CD34、CD45、CD14和HLA～DR);化学染色检测其体外诱导成骨分化的能力。结果:原代人脐带间充质干细胞呈现典型的成纤维样形态;流式细胞仪检测培养细胞间充质干细胞的表面标志CD105、CD73和CD90阳性表达,但不表达造血细胞的表面标志CD34、CD45、CD14及HLA-DR阴性表达,HLA-ABC低表达。体外诱导实验证实,该细胞具有成骨分化能力。结论:WJ-MSCs体外诱导成骨能力确切,具有类似骨髓间充质干细胞的特异性表面标记,且具有同种异体移植的低免疫原性。     

同种异体组织工程骨猪皮下植入后IL-2及TNF-α的表达

目的检测同种异体组织工程骨植入小香猪皮下后白细胞介素2（IL-2）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达,探讨同种异体骨髓间充质干细胞（MSCs）作为种子细胞构建组织工程骨的可行性。方法猪骨髓间充质干细胞体外诱导分化为成骨细胞,与猪源生物衍生骨材料复合培养,构建组织工程骨,植入15头免疫功能健全的异体小香猪背侧脊柱旁左侧皮下作为实验组,对侧植入单纯的脱钙骨基质（DBM）作为对照,于术后1、2、4、8和12周抽取静脉血,并行双侧局部组织取材,组织块作低温匀浆,ELISA法检测IL-2及TNF-α的水平变化。结果实验组和对照组术后各时间点IL-2及TNF-α水平无统计学差异,IL-2及TNF-α水平在术后第2周开始增高,第2~4周维持高水平,8周后随时间的延长而下降。外周血无明显变化。结论小香猪MSCs和DBM复合构建组织工程骨,植入异体小香猪体内引发微弱的免疫反应,同种异体MSCs可选择作为构建骨组织工程的种子细胞。     

Lewis大鼠骨髓间充质干细胞分离培养和鉴定

目的建立从Lewis大鼠骨髓中分离、培养间充质干细胞的方法,并对分离、培养的间充质干细胞进行鉴定.方法采用Percoll（1.073g/L）密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法分离培养Lewis大鼠的骨髓间充质干细胞（MSC）.MSC细胞鉴定：采用相差显微镜观察MSC的形态学特征;流式细胞仪检测细胞表面标志抗原CD29,CD90,CD34和CD45的表达率;苏丹Ⅳ染色检测MSC成脂细胞分化;碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测MSC成骨分化.结果原代培养的MSC于24 h后贴壁,48～72 h形成集落,12～15 d可达到80%～90%融合.第1代细胞表面标记物CD29,CD90,CD34和CD45的阳性率分别为80.41%,66.27%,2.73%,0.74%.第3代细胞表面标记物CD29,CD90,CD34和CD45的阳性率分别为89.91%,88.17%,0.81%,0.17%.细胞周期分析显示,第5代细胞G0/G1期细胞占68.9%,S＋G2＋M期为31.1%.用α-MEM培养液培养的第6代细胞部分分化为成骨和成脂细胞.结论采用Percoll（1.073g/L）密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法能够成功分离和培养大鼠的MSC.第5代MSC细胞保持分化潜能.     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离培养及鉴定。方法：应用贴壁筛选法分离培养Wistar大鼠髓间充质干细胞,用直接荧光抗体染色法对培养的细胞进行鉴定。结果：体外培养的原代MSC 9d融合,荧光抗体染色CD44、CD105表达阳性,CD14、CD34表达阴性。结论：贴壁筛选法在体外很容易分离培养和扩增MSC,可作为获得MSC的一种有效手段。     

短端粒小鼠与正常小鼠间充质干细胞的分离培养比较

目的 建立从小鼠微粒骨中获取间充质干细胞(MSC)方法,并观察比较野生型小鼠(WT鼠)和端粒酶基因敲除小鼠(Terc-/-鼠)MSC生物学特性的差异.方法采用体外细胞培养技术,从小鼠自体微骨片中分离纯化WT鼠和Terc -/-鼠的同充质干细胞,通过培养和传代,研究其增殖及生长特征.结果 原代培养及传代培养显示,WT鼠自体骨间充质干细胞比Terc -/ -鼠具有活跃的增殖倍增能力.结论 从鼠的微骨片获取MSC的方法重复性好,细胞纯度和细胞数量优于以往从骨髓获取MSC的方法,Terc -/ -鼠MSC生长增殖能力明显弱于WT鼠,其机制的研究有待深入.     

犬骨髓间充质干细胞的培养及生物学特性

目的 研究探讨犬骨髓间充质干细胞的分离、培养方法以及生长增殖特性.方法 无菌技术抽取比格犬骨髓,密度梯度离心法获取细胞.加入含胎牛血清体积分数为0.1的低糖DMEM培养基中进行原代培养;待细胞生长至80%～90%融合时,1:3传代培养.倒置显微镜观察细胞形态.MTT法测定3、5和10代细胞生长曲线.流式细胞仪检测第5代细胞的表面抗原分子.结果 原代培养24h后看见微少贴壁细胞,初起为小圆形,3 d后可见梭形类成纤维细胞呈漩涡样生长.10代以后细胞逐渐有宽大梭形样变,增殖逐渐减缓,偶有细胞飘零.流式细胞仪检测传5代细胞有96%表达CD44,95%表达CD29,而只有5%表达CD34.生长曲线显示,传3、5代骨髓间充质干细胞均有较强的增殖能力,其中传3代细胞更为明显,而传10代细胞的增殖能力较前有所减弱.结论 犬骨髓间充质干分离提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,能够长期培养,符合组织工程种子细胞的基本条件.     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和表型鉴定

目的建立成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的分离培养方法,并对其表面标志进行检测,研究骨髓间质干细胞(MSC)基本生物学特性.方法采用Percoll(1.073 g/mL)梯度离心分离hMSCs,体外扩增,流式细胞仪检测hMSCs表面抗原表达.结果成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代及传代培养显示,hMSCs具有活跃增殖的能力,每10 mL骨髓可获得(1.25±0.56)×106个原代细胞,7代可获得(5.32±1.15)×1010个细胞(n=5),随着传代次数的增加,细胞的增殖能力下降.流式细胞仪检测生长良好的第3代hMSC显示CD29、CD44、CD106、CD105、CD166、HLA-A/B/C表达阳性,CD34、CD45、CD14、CD31、CD49d、CD54、HLA-DR/DP/DQ表达为阴性.细胞周期分析显示,hMSCs中,S+G2+M期的细胞约占(16.25±3.18)%,其中S期为(4.12±2.35)%;而处于G0+G1期的细胞总数占(76.35±5.28)%,说明大部分细胞仍然处于静止期.流式细胞仪检测表明分离的hMSCs具有间充质干细胞的特征.结论 hMSCs有很强的自我更新能力,在体外传代培养可维持良好的干细胞生物学特性,为进一步深入研究hMSCs作为组织工程种子细胞的应用提供参数.     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和表型鉴定

目的 建立成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的分离培养方法,并对其表面标志进行检测,研究骨髓间质干细胞(MSC)基本生物学特性。方法 采用Percoll(1.073 g/mL)梯度离心分离hMSCs,体外扩增,流式细胞仪检测hMSCs表面抗原表达。结果成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代及传代培养显示,hMSCs具有活跃增殖的能力,每10 mL骨髓可获得(1.25±0.56)×106个原代细胞,7代可获得(5.32±1.15)×1010个细胞(n=5),随着传代次数的增加,细胞的增殖能力下降。流式细胞仪检测生长良好的第3代hMSC显示CD29、CD44、CD106、CD105、CD166、HLA-A/B/C表达阳性,CD34、CD45、CD14、CD31、CD49d、CD54、HLA-DR/DP/DQ表达为阴性。细胞周期分析显示,hMSCs中,S+G2+M期的细胞约占(16.25±3.18)％,其中s期为(4.12±2.35)％;而处于G0+G1期的细胞总数占(76.35±5.28)％,说明大部分细胞仍然处于静止期。流式细胞仪检测表明分离的hMSCs具有间充质干细胞的特征。结论 hMSCs有很强的自我更新能力,在体外传代培养可维持良好的干细胞生物学特性,为进一步深入研究hMSCs作为组织工程种子细胞的应用提供参数。     

骨髓间质干细胞体外预构组织工程化肌腱的实验研究

目的探讨骨髓间质干细胞与胶原-聚羟基乙酸的细胞相容性,为构建组织工程化肌腱寻求理想方法.方法以贴壁法分离、培养骨髓间质干细胞,并检测CD44.在实验组中将骨髓间质干细胞置入含胶原-聚羟基乙酸的DMEM培基中培养:在对照组中将骨髓间质干细胞置入DMEM培基中培养.通过MTT方法比较两组的细胞活性和生长情况,并对实验组进行超微观察.以骨髓间质干细胞为种子细胞,以胶原-聚羟基乙酸为支架在体外预构组织工程化肌腱.结果以贴壁法原代培养骨髓间质干细胞,11天细胞即汇合成片,检测CD44示阳性.骨髓间质干细胞接种于胶原-聚羟基乙酸中混合培养后14天生长良好,始终保持89%以上的细胞活力,与对照组比较无显著差别;实验组细胞数未发生明显改变,而对照组从第4天开始即发生增殖.透射电镜示实验组细胞培养14天后仍保持旺盛的分泌功能.体外预构的组织工程化肌腱具有良好的形态,细胞伸展成梭形,沿聚羟基乙酸缝线大致平行排列.结论骨髓间质干细胞与胶原-聚羟基乙酸的细胞相容性好.以骨髓间质干细胞为种子细胞,以胶原-聚羟基乙酸为支架可在体外初步预构组织工程化肌腱.     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物特性的观察

目的：观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养的生物学特性和作为组织工程的种子细胞的可能性。方法：将人骨髓MSCs自骨髓中分离、纯化和培养，观察原代和传代培养的增殖及生长特征。结果：原代培养及传代培养显示，在体外培养条件下人骨髓MSCS有活跃的增殖能力。结论：体外获得的人骨髓MSCs的生物年龄较为年轻，可以为组织工程的进一步研究提供种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养

目的 通过提取兔骨髓中间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)并加以纯化，在体外培养条件下研究其增殖及生长特性。方法 从骨髓中提取间充质干细胞，体外培养扩增，再以相差显微镜、电镜观察并绘制生长曲线。结果 原代培养及传代培养显示，兔自体骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力；骨髓间充质干细胞内细胞器与其生物活性变化相一致。结论 骨髓间充质干细胞体外培养成功，为今后利用自体间充质干细胞通过组织工程学方法修复软骨、骨、肌肉系统的组织缺损奠定了基础。     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨的实验研究

目的：通过诱导兔骨髓间充质干细胞（MSCs），观察干细胞向软骨细胞的分化效果。方法：纯化兔骨髓间充质干细胞；用含转化生长因子β1的诱导液培养骨髓间充质干细胞；以MTT测定诱导细胞的增殖活性；免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白的表达；诱导后的细胞移植于白兔膝关节内，X线摄片观察软骨修复形成情况。结果：诱导液可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化，且骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化所需的特异性细胞外基质——Ⅱ型胶原明显升高，移植后效果明显。结论：兔骨髓间充质干细胞定向诱导后移植修复关节软骨是有效的。因此骨髓间充质干细胞有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

自体间充质干细胞构建组织工程骨修复人长骨缺损的临床观察

目的观察个体化组织工程骨用以修复患者长骨缺损的疗效与安全性。方法利用组织工程技术，通过抽取临床上骨源缺乏的患者少量骨髓分离出其中的人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cell，hMSCs），并在体外对其进行扩增培养并诱导分化后，与自制的同种异体脱钙骨基质相复合，构建个体化的组织工程骨并应用于临床，通过临床随访其放射学及血液学结果评价其疗效与安全性。结果30例个体化组织工程骨临床应用患者均达到随访半年以上，随访资料显示成骨速度及效果均与自体骨类似，且术后肝肾功、血沉等指标均无明显异常，最长随访达4年未发现病灶复发。结论由患者自体间充质干细胞构建的组织工程骨具有良好的生物安全性和成骨效能。     

骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞转染增强型绿色荧光蛋白基因后复合生物衍生骨的研究

目的:探讨绿色荧光蛋白(GFP)基因转染本身是否可以改变细胞复合材料的生物学特性,从而影响材料生物相容性的正确评价?方法:将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因技术成功标记人源骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化的成骨样细胞,再与人源生物衍生骨复合培养;同时设立未转染EGFP基因的骨髓MSCs诱导分化的成骨样细胞直接与人源生物衍生骨复合培养作为对照,通过倒置显微镜?荧光显微镜?扫描电镜对比观察?结果:发现转染EGFP基因的MSCs诱导分化的成骨样细胞能够成功地复合于人源生物衍生骨上,且生长状态较好?与未转染组细胞复合材料的情况相比,转染组与其没有明显差异?结论:EGFP基因转染技术没有对MSCs诱导分化的成骨样细胞复合衍生骨的能力以及增殖生长活性造成明显损害,从而不会影响对于材料生物相容性的正确评价?     

In Vitro Chondrogenic Phenotype Differentiation of Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells

In order to study the chondrogenic phenotype differentiation of adult sheep bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) in a defined medium as potential seed cells for cartilage tissue engineering, MSCs were isolated by density centrifugation with Percoll solution from bone marrow aspirated from sheep iliac crest. The third passage of MSCS were induced with H-DMEM containing TGF-β3 .IGF-I, Dexamethasone and VitC. The shape and ultrastructure of cells were observed, toluidine blue stain for GAG and immunohistochemistry for type II collagen were applied for chondrogenic phenotype identification. After 14 days of induction, MSCs changed from a spindlelike appearance to a polynal shape, a large amount of endoplasmic reticulum, Golgi complex and mitochondria were observed, and the differentiation of MSCs chondrogenic phenotype was verified by positive staining of toluidine blue and immunohistochemistry. MSCs derived from bone marrow can differentiate to chondrogenic phenotype when induced in vitro and can be used as optimal seed cells for cartilage tissue engineering.