桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1137bp片段的克隆和序列分析

目的：克隆桂北五步蛇金属蛋白酶原基因,并对其进行序列分析。方法：采用一步法抽提广西桂北山区五步蛇蛇毒总RNA,经RT-PCR扩增纤溶酶金属蛋白酶原基因,将扩增产物克隆至pGEM-T Easy载体,挑选白色菌落。用酶切和PCR法对其进行鉴定。直接利用纯化PCR产物或提取阳性菌落进行测序并推导其编码的氨基酸序列。结果：RTPCR和PCR扩增得到一约1137bp产物,并将其克隆及测序。结论：和已报道的皖南五步蛇纤溶酶金属蛋白酶氨基酸序列相比较,二者之间有91％的同源性。     

桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因的克隆和序列分析

目的：克隆桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因,并对其进行序列分析。方法：从桂北五步蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ,采用一步法（ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ在同一管内进行）扩增出纤溶酶金属蛋白基因,利用平端连接的方法将ＰＣＲ扩增产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体,挑选白色菌落,用酶切和ＰＣＲ法对其进行鉴定,直接利用纯化ＰＣＲ产物进行测序或提取阳性菌落进行测序。结果：ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ扩增得到一６００ｂｐ产物,并被克隆     

一种新的五步蛇蛇毒类凝血酶Cdna的克隆和序列分析

目的：克隆出五步蛇的类凝血酶cDNA，为研究其结构和功能的关系。并为下一步基因表达开发抗血栓药物提供依据和基础。方法：从五步蛇蛇腺中提取了总RNA，通过反转录合成第一链cDNA，经PCR扩增出五步蛇毒腺中类凝血酶TLE1的cDNA片段，并将其连接到质粒载体扩增，然后进行DNA测序。结果：成功克隆出一种新的五步蛇类凝血酶的cDNA片段。此片段全长794bp，包括编码部分的全长为777bp。推导其编码的蛋白质序列为258个氨基酸，其中包括18个氨基酸的信号肽，6个氨基权的前肽和234个氨基酸的成熟氨基酸顺序。TLE1成熟肽与其它蛇毒类凝血酶相比，蛋白质一级结构具有较高的同源性。结论：从五步蛇中成功克隆出一 种新的类凝血酶cDNA，并确定了它的DNA顺序。     

短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白β亚基的基因克隆和序列分析

目的：克隆短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白（PBAP）β亚基基因,并对该基因进行序列分析。方法：从短尾蝮蛇的毒腺中提取总RNA,设计引物并采用RT-PCR技术进行体外扩增PBAPβ亚基cDNA序列,将PCR扩增产物克隆至载体PMD-19T,通过PCR进行鉴定后,提取阳性克隆菌体质粒进行测序。结果：序列分析结果显示：PBAPβ亚基cDNA序列长度为441bp,编码框由146个氨基酸组成,其中包括由23个氨基酸的信号肽,以及123个氨基酸组成的成熟肽。结论：PBAPβ亚基基因及其氨基酸序列和已报道的一些蛇毒凝集素β亚基的基因以及氨基酸序列相比较,有88%～99%的同源性。     

人类Vimentin基因第1，2，6，7内含子序列的测定

目的 人vimentin(VIM）基因位于10号染色本短臂1区3带,属于第Ⅲ型中间丝纤维蛋白基因。目前已知全部外显子序列及部分内含子序列。本测定了部分未知的VIM基因内含子序列。方法 通过已知VIM基因的外显子序列设计引物,用PCR扩增其未知的内含子片段,将PCR产物进行克隆测序。结果 共测得未知的4个内含子序列,内含子1长692bp,测得其全部序列;内含子2长2kb,测得其两端与外显子相接的序列,共1kb;内含子6长456bp,测得其全部旬;内含子7长404bp,测得其全部序列。结论 本研究PCR检测多例人VIM基因的内含子7大小为404bp,与献报道人类vimentin基因的内含子7大小为800bp相差很大,但引物两端外显子序列相同,另外,献报道的人类vimentin基因与外显子3相邻的第2内含子末端41nt的核苷酸序列与本研究所测的第2内含子末端序列完全不同。     

人类Vimentin基因第1,2,6,7内含子序列的测定

[目的]人vimentin(VIM)基因位于10号染色体短臂1区3带,属于第Ⅲ型中间丝纤维蛋白基因.目前已知全部外显子序列及部分内含子序列,本文测定了部分未知的VIM基因内含子序列.[方法]通过已知VIM基因的外显子序列设计引物,用PCR扩增其未知的内含子片段,将PCR产物进行克隆测序.[结果]共测得未知的4个内含子序列,内含子1长692bp,测得其全部序列;内含子2长2kb,测得其两端与外显子相接的序列,共1kb;内含子6长456bp,测得其全部序列;内含子7长404 bp,测得其全部序列.[结论]本研究PCR检测多例人VIM基因的内含子7大小为404 bp,与文献报道人类vi-mentin基因的内含子7大小为800bp相差很大,但引物两端外显子序列相同.另外,文献报道的人类vimentin基因与外显子3相邻的第2内含子末端41nt的核苷酸序列与本研究所测的第2内含子末端序列完全不同.     

金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP—1）的克隆与序列分析

目的：用基因工程技术构建金属蛋白酶组织抑制剂的克隆质粒。方法：从人乳腺癌细胞中分离提取总RNA,经逆转录PCR（RT－PCR）扩增出金属蛋白酶抑制因子1（TIMP－1）的c DNA,插入经NdeI和XhoI双酶切的PET19b载体中,构建了克隆质粒PET19bTIMP－1。结果：对此克隆质粒进行了限制性酶切鉴定和DNA序列分析,结果在扩增出的cDNA中624个碱基中与发表的TIMP－1cDNA序列相比,除361位碱基由A变为G外,其余均完全相同。结论：该突变导致编码的氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸,不影响本课题后期用该克隆化基因表达蛋白作为抗原制备单克隆抗体的目的。该DNA全长624bp,编码207个氨基酸。     

人载脂蛋白CⅡ成熟肽编码基因的克隆

目的：克隆人载脂蛋白CⅡ（ApoCⅡ）成熟肽编码基因。方法：以人基因组DNA为模板，利用聚合酶链反应（PCR）分别扩增ApoCⅡ成熟肽的编码基因外显子3和外显子4，继而采用外显子拼接法。以两种扩增产物为模板再次进行PCR，得到246bp的人ApoCⅡ基因编码片段。将ApoCⅡ基因编码片段重组入载体pUC18，并进行序列测定。结果：PCR扩增得到ApoCⅡ基因编码片段．经测序证实重组人载体pUC18中的ApoCⅡ编码片段的序列与Genbank中所检索到的编码序列完全一致。结论：利用外显子拼接法完成人ApoCⅡ成熟肽基因编码片段的克隆，为基因工程研制有生物活性蛋白提供了可行的技术手段。     

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析

目的：克隆并分析我国刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶（NTPase）的编码基因。方法：采用聚合酶链反应（PCR）扩增弓形虫RH株的NTPase基因,克隆入pGEM-TEasy载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定,并对获得的NTPase基因及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果：PCR扩增得到特异的弓形虫NTPase基因序列,测序结果表明,获得的弓形虫NTPase-Ⅱ基因全长1812bp,编码的603个氨基酸与Genebank报道的氨基酸序列同源性为100%。经DNAStar预测NTPase-Ⅱ存在6个潜在抗原表位。结论：成功克隆出序列正确的弓形虫NTPase-Ⅱ基因,为其相关研究奠定了基础。     

Pythium sp. GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的克隆与序列分析

目的 克隆Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因.方法 在已经克隆得到的Pythi-um sp.GYl938菌株类枯草菌素蛋白酶cDNA片段的基础上,首先通过PCR扩增得到与其相对应的基因组DNA片段,然后分别通过Mini基因组DNA文库法和Panhandle PCR法扩增其上游和下游未知片段,最后通过PCR法扩增得到类枯草菌素蛋白酶基因片段.结果 克隆得到1 519bp Pr1蛋白酶基因序列YP1977,DNAassist软件分析其中含有一个969bp的完整的开放阅读框,编码323个氨基酸,NCBI BkastX比对结果显示,该阅读框可能编码的氨基酸序列与多个物种的Pr1蛋白酶都具有较高的同源性.结论 YP1977很可能是Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的部分片段,但仍需要进一步通过构建表达系统加以验证.     

尖吻蝮蛇蛇毒纤溶酶的分离纯化及氨基酸序列测定

目的:从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化出高纯度的纤溶酶并对其进行初步性质研究和氨基酸序列分析。方法:采用DEAE-Sepharose FF离子交换和两次Superdex75PG凝胶过滤,从尖吻蝮蛇蛇毒中纯化出可直接溶解纤维蛋白原的蛋白酶。结果:分离到的纤溶酶相对分子质量为25kD,HPLC分析纯度在97%以上,氨基酸序列分析其N末端为MSTEF QRYME IVVNHS MVKKY NGDSD KIKAW。结论:采用此工艺可从尖吻蛇毒中分离出高比活的纤溶酶,为进一步研究其药理作用奠定了基础。     

北京鸭载脂蛋白AI cDNA的克隆及其组织表达

目的:克隆不易感动脉粥样硬化动物北京鸭载脂蛋白AI的基因。方法:分离提取北京鸭肝组织mRNA,以此为模板,反转录构建了鸭肝组织cDNA文库。利用制备的兔抗鸭载脂蛋白AI(apoAI)多抗血清为探针筛选该文库,获得10个阳性克隆,测序及序列分析。结果:包括18bp、240bp组成的5’和3’非翻译区,792bp组成的一个完整开放阅读框架,编码264个氨基酸的鸭apoAI前体,含18个氨基酸构成的信号肽、6个氨基酸的原肽片段和240肽的成熟蛋白。推译出的成熟肽与鸭apoAI氨基酸的直接测序结果完全一致。该新基因已被GenBank接受。Northern blot显示鸭apoAI mRNA不仅主要在肝和小肠组织表达;而且不同于人和哺乳类动物,亦可少量在脑、肾、肌肉组织分布。结论:结果为进一步研究不易感动脉粥样硬化动物北京鸭apoAI基因组结构、功能及其抗动脉硬化机制奠定了基础。     

树鼩载脂蛋白AI cDNA的克隆及其组织表达

目的克隆不易感动脉粥样硬化动物树（ｔｒｅｅｓｈｒｅｗ,ＴＳ）载脂蛋白ＡＩ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡＩ,ａｐｏＡＩ）的基因,比较分析其结构特点。方法以提取的肝组织ｍＲＮＡ为模板,反转录构建了ＴＳ肝组织ｃＤＮＡ文库。利用制备的兔抗ＴＳ载脂蛋白ＡＩ多抗血清为探针筛选该文库,对阳性克隆进行测序、序列分析及组织表达实验。结果克隆获得了ＴＳａｐｏＡＩｃＤＮＡ序列,全长序列由９００个核苷酸构成,包括２８ｂｐ组成的５′非翻译区;７９５ｂｐ组成的一个完整开放阅读框架,编码翻译２６５个氨基酸的ＴＳａｐｏＡＩ前体（含１８个氨基酸构成的信号肽、６个氨基酸的原肽片段及２４１肽的成熟蛋白）;两个终止密码ＴＧＡ、ＴＡＡ和随后７２ｂｐ的３′非翻译区。新基因已被ＧｅｎＢａｎｋ接受。对编码蛋白质的亲疏水性分析表明ＴＳａｐｏＡＩ的疏水性强于人的相应蛋白。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ显示ＴＳａｐｏＡＩ基因主要在肝脏和小肠组织表达。结论获得了不易感动脉粥样硬化动物ＴＳａｐｏＡＩ的新基因,编码的蛋白质结合胆固醇及胆固醇酯的能力可能大于人的ａｐｏＡＩ。     

树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA和蛋白质序列结构分析

目的克隆获得树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA序列并进行结构分析。方法以树鼩肝脏mRNA逆转录出的Ⅰ链cDNA为模板,运用SMARTRACEPCR扩增技术,扩增得到树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)cDNA序列,并推导出LCAT氨基酸序列。利用分子生物学软件DNAMAN对氨基酸序列的一、二级结构及主要结构域进行分析和比较。结果树鼩LCATcDNA序列由1340个核苷酸构成,开放阅读框架1320bp,编码440个氨基酸的LCAT前体(含24个氨基酸构成的信号肽和416个氨基酸组成的成熟蛋白)熏3'非翻译区18bp,终止密码TAA,加尾信号AATAAA和一个25bp的poly(A)尾。树鼩LCATcDNA序列已作为新基因被GenBank接受,登记号AF272861。树鼩与人和狒狒LCATcDNA的同源性分别为90%和89%。结论树鼩LCATcDNA序列与人及其他实验动物高度同源。     

长白山白眉蝮蛇毒类凝血酶的分离纯化

目的 建立一种分离纯化长白山白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的方法.方法 将长白山白眉蝮蛇蛇毒溶解后离心,取上清进行阴离子交换层析,所得蛋白进行分子筛层析.提纯的蛋白用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定及相对分子量测定.测定酶的N-末端氨基酸序列.结果 经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一区带,相对分子量为35.5kDa.N-末端氨基酸序列分析表明其N-末端氨基酸序列与立止血中巴曲酶N-末端氨基酸序列基本一致.提取率约为5mg类凝血酶/g蛇毒.结论 用上述方法可制得高纯度的类凝血酶.     

THE TREE SHREW APOLIPOPROTEIN C-I cDNA：SEQUENCE AND ITS EXPRESSION

A rabbit anti-serum to tree shrew apolipoprotein C-I (apo C-I) was used to screen an expression cDNA li-brary constructed by us from tree shrew (TS) liver tissue. Two apo C-I cDNA clones were obtained. The longerone consists of 380 nuclcotides, including 21 bp and 95 bp at the 5‘‘ and 3‘‘ and of the non-translated regions respectively, and a 264-bp fragment in an open reading frame encoding 88 amino acids prepropeptide which conrains 26 amino acids of signal peptide and a mature protein (62 amino acids). Comparing the amino-acid sequence deduced from this cDNA with those of the published mammalian apo C-Is reveals that it shared some struc-tural similarity with rat, mouse and dog ape C-I, but it had 5 more amino acids than that of human and baboon.The expression of ape C-I mRNA in 8 different tissues were also assayed with Northern blot. The results demonstrated that liver had the highest expression, intestine had much less expression and no expression in other tissues,which is much different from human and other species. This study has laid down a good foundation for further studying on the function and the stucture of tree shrew apo C-I gene.