尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶的纯化及其理化性质研究

目的：从蝮亚科尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus venom)中分离纯化出无出血活性纤维蛋白溶解酶(Non—hemonrrhagic fibrinolytic enzyme,NHFLE)并对其理化性质进行研究。方法：应用凝胶过滤和离子交换柱层析法分离纯化尖吻蝮蛇毒NHFLE，用纤维蛋白平板法测定其纤溶活力，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定其相对分子质量，用皮内出血实验测定其出血活性。结果：从短亚科尖吻蝮蛇毒中分离出一种单一组分的纤维蛋白溶解酶，它的相对分子质量为25000，没有出血活性，在普通纤维蛋白平板和加热平板上都能溶解纤维蛋白，相对活性为粗毒的3．2倍。结论：从尖吻蝮蛇毒中分离出相对分子质量为25000的纯化蛋白是具有直接溶解纤维蛋白活性，而无出血活性的单一的纤维蛋白溶解酶。     

尖吻蝮蛇血凝酶N末端序列测定及其止血活性分析

目的：测定尖吻蝮蛇血凝酶N末端氨基酸序列，并对其止血活性进行分析。方法：采用Edman法测定尖吻蝮蛇血凝酶N末端氨基酸序列，采用毛细管电泳估算其等电点，根据纤维蛋白出现时间和全血凝时间研究其止血活性。结果：尖吻蝮蛇血凝酶N末端氨基酸序列为VIGGNECDTNEEHFL，等电点为6．59，使用后能明显缩短纤维蛋白出现时间和全血凝时间。结论：尖吻蝮蛇血凝酶具有较强的止血活性。     

尖吻蝮蛇毒去纤酶治疗视网膜静脉阻塞初步报告

视网膜静脉阻塞多发生于高血压、动脉硬化的老年患者。对本病的治疗至今方法不多,效果不理想,是眼科临床上有待进一步研究解决的课题。尖吻蝮蛇毒去纤酶是中国科学院昆明动物研究所,从尖吻蝮蛇的毒液中提纯出的一种蛇毒酶新制剂,命名为尖吻蝮蛇毒去纤维蛋白酶(以下简称去纤酶)。经药理实验证明去纤酶     

尖吻蝮蛇毒去纤酶治疗视网膜静脉阻塞(附60例报告)

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒纤维蛋白原酶是中国科学院昆明动物研究所从尖吻蝮蛇的毒液中提出的一种蛇毒酶新制剂,命名为尖吻蝮蛇毒去纤维蛋白酶,简称去纤酶。它有使纤维蛋白原下降的独特作用,产生非常显著的抗凝血效应。我们自1981年3月起至1984年7月的三年中用去纤酶对视网膜静脉阻塞患者60例61只眼进行治疗,现报告如下:     

抗尖吻蝮蛇蛇毒金属酶类共同基序IgY抗体的制备与研究

[目的]制备针对尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶类共同基序的IgY抗体,并对其中和蛇毒活性的作用进行研究.[方法]通过分析尖吻蝮蛇蛇毒各类金属蛋白酶类共有序列,设计合成与其酶活性密切相关且高度保守的抗原肽PT1和PT2;偶联复合物KLH-PT1、KLH-PT2免疫母鸡获得IgY抗体.采用ELISA和Western blot等方法对IgY效价及与尖吻蝮蛇蛇毒和短尾蝮蛇蛇毒的交叉反应特性进行初步研究;最后通过抗小鼠皮下出血实验对IgY中和活性进行评价.[结果]ELISA、Western blot结果表明,抗KLH-PT1、抗尖吻蝮蛇蛇毒IgY均可与尖吻蝮蛇蛇毒、短尾蝮蛇蛇毒发生交叉反应且后者显著强于前者;抗KLH-PT2 IgY在体外与尖吻蝮蛇蛇毒、短尾蝮蛇蛇毒无明显交叉反应,在体内抗出血实验中却表现出很强的中和毒性作用,并且显著优于前两者.[结论]通过设计金属蛋白酶共有序列抗原肽,制备了能与多种血循型蛇毒交叉反应的IgY抗体,这为制备特异、高效、低毒性且广谱的抗出血型蛇毒抗体奠定了基础.     

尖吻蝮蛇蛇毒纤溶因子单克隆抗体的制备

目的：制备从尖吻蝮蛇蛇毒中分离的纤溶因子的单克隆抗体，为克隆基因提供特异性的探针。方法；将纤溶因子免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，取脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，筛选稳定分泌抗体的细胞株。     

尖吻蝮蛇毒素组双向电泳和二维液相色谱研究

目的：初步研究尖吻蝮蛇蛇毒的蛋白质组分及其活性。方法：利用双向电泳和二维色谱（IEX＋HPLC）分析尖吻蝮蛇蛇毒蛋白质组，并制备分离样品研究蛇毒中酶和毒素活性。结果：双向电泳分离检测得到128种蛋白质，其中24种蛋白质丰度较高，73种为酸性蛋白质，加种为碱性蛋白质。二维色谱展现58种蛋白质，其中26种蛋白质丰度较高。初步活性研究表明，尖吻蝮蛇蛇毒蛋白质多数属于丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和磷脂酶A2家族，部分蛋白质可能属于去整合素家族。结论：双向电泳和二维色谱相互结合．有效分析了尖吻蝮蛇毒的蛋白盾组成和生物活性．     

白眉蝮蛇蛇毒糖基化蛋白的质谱分析

[目的]蛋白质组学方法分析和初步鉴定旅顺产白眉蝮蛇（Gloydius blomhoffi Brevicaudus）蛇毒中的糖蛋白。[方法]SDS-PAGE用于白眉蝮蛇粗毒蛋白质组份分离,糖蛋白凝胶荧光染料Pro-Q-Emerald染糖基化蛋白,采用胰蛋白酶酶解蛋白质,用反相C18-HPLC分离肽段混合物,用纳升电喷雾电离串联质谱（nESI-MS/MS）系统进行的质谱数据采集,蛋白质鉴定用Biowroks软件搜索NCBInr数据库完成。[结果]旅顺产白眉蝮蛇蛇毒L-氨基酸氧化酶、金属蛋白酶、谷氨酰环化酶、salmobin、纤溶酶原激活物、contortrixobin、磷脂酶A2,神经增长因子和较小分子量的L-氨基酸氧化酶被初步鉴定为糖蛋白,其匹配的肽段数分别为8、4、7、2、3、3、4、2和5个。L-氨基酸氧化酶的纯化与表征结果验证了其糖基化,并以多种糖基化形式存在。[结论]采用蛋白质组学手段从旅顺产白眉蝮蛇蛇毒中鉴定出了8种糖蛋白,该方法简便、快速、准确。     

去纤酶和tPA对血管平滑机细胞迁移和增生的影响

血管平滑肌细胞(SMC)的迁移和增殖是引起经皮冠脉腔内成形术(PTCA)后再狭窄的关键因素之一。组织型纤溶酶原激活物(tPA)是纤溶系统的主要成份之一,用于冠心病等的溶栓治疗,效果较好,但其对动脉SMC迁移和增殖的作用及机制和临床意义研究尚少。tPA在正常和罹病血管的分布仍大部分未被揭示,血管损伤后tPA的改变和局部SMC增殖和激活状态间的关系仍未被详细揭示,研究结果也不一致。tPA与高血脂对SMC增殖的作用有何相互影响,尚未见报道。去纤酶是我国首次从主产于我国的尖吻蝮蛇蛇毒中分离、纯化并第一通过国家鉴定的蛇毒制剂,由于其去纤抗凝作用,用于血管闭塞性疾病等的治疗。但其对血管SMC增殖的作用及其机理研究尚少,其与tPA作用     

长白山白眉蝮蛇毒类凝血酶的分离纯化

目的 建立一种分离纯化长白山白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的方法.方法 将长白山白眉蝮蛇蛇毒溶解后离心,取上清进行阴离子交换层析,所得蛋白进行分子筛层析.提纯的蛋白用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定及相对分子量测定.测定酶的N-末端氨基酸序列.结果 经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一区带,相对分子量为35.5kDa.N-末端氨基酸序列分析表明其N-末端氨基酸序列与立止血中巴曲酶N-末端氨基酸序列基本一致.提取率约为5mg类凝血酶/g蛇毒.结论 用上述方法可制得高纯度的类凝血酶.     

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶对动物凝血功能的影响

目的：探讨尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶(Non—hemonrrhagic fibrinolytic enzyme，NHFLE)对动物凝血功能的影响。方法：用动物体内外实验方法观察NHFLE对富血小板血浆中经ADP诱导的血小板聚集的影响及NHFLE对凝血功能的影响。结果：NHFLE能明显延长全血凝固时间、活化的部分凝血酶原时间、凝血酶时间和凝血酶原时间，产生抗凝作用。动物体内注射NHFLE后血浆纤维蛋白原含量降低，优球蛋白的溶解时间缩短。结论：尖吻蝮蛇毒NHFLE对动物的凝血功能有影响，具有明显的抗凝作用。     

桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1137bp片段的克隆和序列分析

目的：克隆桂北五步蛇金属蛋白酶原基因,并对其进行序列分析。方法：采用一步法抽提广西桂北山区五步蛇蛇毒总RNA,经RT-PCR扩增纤溶酶金属蛋白酶原基因,将扩增产物克隆至pGEM-T Easy载体,挑选白色菌落。用酶切和PCR法对其进行鉴定。直接利用纯化PCR产物或提取阳性菌落进行测序并推导其编码的氨基酸序列。结果：RTPCR和PCR扩增得到一约1137bp产物,并将其克隆及测序。结论：和已报道的皖南五步蛇纤溶酶金属蛋白酶氨基酸序列相比较,二者之间有91％的同源性。     

桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因的克隆和序列分析

目的：克隆桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因,并对其进行序列分析。方法：从桂北五步蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ,采用一步法（ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ在同一管内进行）扩增出纤溶酶金属蛋白基因,利用平端连接的方法将ＰＣＲ扩增产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体,挑选白色菌落,用酶切和ＰＣＲ法对其进行鉴定,直接利用纯化ＰＣＲ产物进行测序或提取阳性菌落进行测序。结果：ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ扩增得到一６００ｂｐ产物,并被克隆     

桂北五步蛇金属蛋白酶原基因800bp片段的克隆和序列分析

目的：扩增桂北五步蛇金属蛋白酶原基因,并对其进行序列分析,方法：从广西桂北山区五步蛇毒腺中抽提蛇毒总RNA,采用一步法（RT－PCR和PCR在同一试管内进行）扩增金属蛋白酶原基因,对其进行电泳检测,得到3条特异的DNA条带,大小分别为1．5kb,1.3kb,和800bp,利用平端连接方法将800bp克隆至pGEM-T载体,挑选白色菌落,用酶切和PCR法对其进行鉴定,提取阳性菌落进行测序并推导编码的氨基酸序列。结果：信号肽和前肽和已报道的皖南五步蛇金属蛋白酶很相似。同源性为97．9％,但仅含有部分金属蛋白酶成熟肽的氨基酸序列。结论：推测此800bp片段为广西五步蛇金属蛋白酶原基因的一部分。     

江浙蝮蛇毒纤溶酶的分离纯化及性质研究

目的:江浙蝮蛇毒纤溶酶的分离纯化及部分生物化学和药理性质的研究.方法:应用DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱和HiPrep Sephacryl S 100柱分离纯化纤溶酶,以高效液相色谱仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯度、相对分子质量,应用等电聚焦电泳测定等电点,然后测定氨基酸组分及部分药理性质.结果:分离得到相对分子质量为59 100,等电点为4.98, SDS-PAGE为一条带,高效液相色谱分析为单一峰的纤溶酶.该组分属于金属蛋白酶类.氨基酸组成分析表明它含较多的酸性氨基酸.高浓度的纤溶酶对肿瘤细胞CEN2有抑制作用,有微弱的出血毒性.结论:分离纯化得到了一种有微弱出血毒,具有较强抗凝活性的单一组分的酸性金属蛋白酶.     

五步蛇蛇毒类凝血酶的分离和纯化

用ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层析，从五步蛇粗毒中分离纯化出一种促凝组分（类凝血酶），并对其纯度和促凝活性作鉴定。     

Purification and characterization of anti-clotting protein component （ACPF-7221） from venom of Agkistrodon acutus

Background Snake venom contains a number of components with different pharmacological and biological activities, especially in cancer therapy, and has increasingly become a research focus. This study was designed to isolate and purify a novel anti-clotting protein component from the venom of Agkistrodon acutus, and to explore its physico-chemical properties and biological activity. Methods The venom of Agkistrodon was isolated and purified by ion-exchange chromatography on diethylaminoethyl （DEAE）-Sepharose Fast Flow, molecular sieve filtration through Sephadex G75, SP-Sepharose Fast Flow and molecular sieve filtration through Sephadex G50. We detected the activated partial thromboplastin time （APTT） of the eluant to select the anti-clotting protein component of interest. The molecular weight was determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamid gel electrphoresis （SDS-PAGE） and liquid chromatography. Its protein content was detected by bicinchoninic acid （BCA）. Results SDS-PAGE vertical gel electrophoresis showed that the anticoagulant factor is a tripolymer composed of three proteins whose molecular weights are 25 KDa, 30 KDa and 50 KDa. The factor contains about 65% percent protein. Conclusions A novel anti-clotting protein component was purified by ion-exchange chromatography and molecular sieve filtration from the venom of Agkistrodon acutus and was found to be composed of three kinds of proteins.