五步蛇蛇毒类凝血酶的分离和纯化

用ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层析，从五步蛇粗毒中分离纯化出一种促凝组分（类凝血酶），并对其纯度和促凝活性作鉴定。     

桂北五步蛇金属蛋白酶原基因800bp片段的克隆和序列分析

目的：扩增桂北五步蛇金属蛋白酶原基因,并对其进行序列分析,方法：从广西桂北山区五步蛇毒腺中抽提蛇毒总RNA,采用一步法（RT－PCR和PCR在同一试管内进行）扩增金属蛋白酶原基因,对其进行电泳检测,得到3条特异的DNA条带,大小分别为1．5kb,1.3kb,和800bp,利用平端连接方法将800bp克隆至pGEM-T载体,挑选白色菌落,用酶切和PCR法对其进行鉴定,提取阳性菌落进行测序并推导编码的氨基酸序列。结果：信号肽和前肽和已报道的皖南五步蛇金属蛋白酶很相似。同源性为97．9％,但仅含有部分金属蛋白酶成熟肽的氨基酸序列。结论：推测此800bp片段为广西五步蛇金属蛋白酶原基因的一部分。     

江西蝮蛇蛇毒类凝血酶分离纯化及理化、酶学性质的鉴定

本文采用DEAE—纤维素DE—52离子交换层析及SephadexG—150凝胶过滤法,从江西蝮蛇蛇毒中分离、纯化类凝血酶。该酶为糖蛋白,分子量39,200,pI为4.96,酸性氨基酸含量较高。类凝血酶水解苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)的最适pH为8.0,km为3.57×10~(-4)M,其活性可被二异丙基氟磷酸(DFP)和苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制。N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)可迅速抑制该酶的酯酶活性。该酶能直接作用于纤维蛋白原使之转变为纤维蛋白引起凝聚,但其凝固速度较牛凝血酶慢。     

长白山白眉蝮蛇类凝血酶基因特异片段的制备与分析

目的：分离和纯化长白山白眉蝮蛇类凝血酶cDNA片段，为克隆全长类凝血酶cDNA奠定基础。方法：应用RT-PCR方法获得长白山白眉蝮蛇类凝血酶cDNA片段，克隆于pGEM-T载体上，进行测序和NCBI数据库同源性分析。结果：获得长白山白眉蝮蛇类凝血酶cDNA片段长度为289bp，该片段与其他种蝮蛇类凝血酶DNA片段有同源性。结论：本实验克隆了长白山白眉蝮蛇类凝血酶基因片段，根据不同种属蛋白质家族成员的保守性和同源性设计引物可以有效地克隆家族成同的DNA片段。     

桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1137bp片段的克隆和序列分析

目的：克隆桂北五步蛇金属蛋白酶原基因,并对其进行序列分析。方法：采用一步法抽提广西桂北山区五步蛇蛇毒总RNA,经RT-PCR扩增纤溶酶金属蛋白酶原基因,将扩增产物克隆至pGEM-T Easy载体,挑选白色菌落。用酶切和PCR法对其进行鉴定。直接利用纯化PCR产物或提取阳性菌落进行测序并推导其编码的氨基酸序列。结果：RTPCR和PCR扩增得到一约1137bp产物,并将其克隆及测序。结论：和已报道的皖南五步蛇纤溶酶金属蛋白酶氨基酸序列相比较,二者之间有91％的同源性。     

桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因的克隆和序列分析

目的：克隆桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因,并对其进行序列分析。方法：从桂北五步蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ,采用一步法（ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ在同一管内进行）扩增出纤溶酶金属蛋白基因,利用平端连接的方法将ＰＣＲ扩增产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体,挑选白色菌落,用酶切和ＰＣＲ法对其进行鉴定,直接利用纯化ＰＣＲ产物进行测序或提取阳性菌落进行测序。结果：ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ扩增得到一６００ｂｐ产物,并被克隆     

注射用蛇毒类凝血酶的Ⅰ期临床耐受性试验研究

注射用蛇毒类凝血酶为生物制品,经国家食品药品监督管理局批准同意对该药物进行临床研究（批件号2003L02190）,临床研究方案经伦理委员会审查批准同意后实施.本研究以同类产品reptilase为对照药品,评价注射用蛇毒类凝血酶对正常人体血液学指标的影响,以探索止血的有效剂量和安全性,为Ⅱ期临床试验用于止血的给药方案提供依据.     

白眉蝮蛇毒“类凝血酶”的抗炎作用

用多种实验模型，观察了白眉蝮蛇毒类凝血酶对急慢性炎症的影响，结果表明：其能抑制冰醋酸、二甲苯、蛋清所急性渗出性炎症，对慢性肉芽组织增生的炎症也有明显的抑制作用。能增加小鼠的免疫器官重量，明显提高小鼠对静注碳粒的廊清指数，增强网状内皮系统功能的活性，提示其抗炎作用与免疫促进作用有关。     

蕲蛇毒试剂临床前的基础研究

本文研究了蕲蛇毒试剂的作用性质、特点、稳定性及使用的实验室条件。结果表明,本试剂有类凝血酶作用,但与凝血酶不同点是不受肝素影响和不激活凝血因子ⅩⅢ,与国外同类产品比较,其作用性质、强度和特点相似。     

长白白眉蝮蛇类凝血酶的研究Ⅱ：理化,酶学性质的鉴定

长白白眉蝮蛇类凝血酶分子量为39 000,是一种糖蛋白。氨基酸组成分析表明,此酶共含303个氨基酸残基,其中酸性氨基酸含量较高,等电点为4.25。该酶对BAEE(苯甲酰-L-精氨酸乙酯)水解活力的最适pH值为8左右,Km为3.53×10~(-4)mol/L,其活性可被DFP(二异丙基氟磷酸)及PMSF(苯甲基磺酰氟)所抑制。催化降解纤维蛋白原过程中,只释放纤肽A,不释放纤肽B,形成的纤维蛋白可被5 mol/L尿素液溶解。     

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶对动物凝血功能的影响

目的：探讨尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶(Non—hemonrrhagic fibrinolytic enzyme，NHFLE)对动物凝血功能的影响。方法：用动物体内外实验方法观察NHFLE对富血小板血浆中经ADP诱导的血小板聚集的影响及NHFLE对凝血功能的影响。结果：NHFLE能明显延长全血凝固时间、活化的部分凝血酶原时间、凝血酶时间和凝血酶原时间，产生抗凝作用。动物体内注射NHFLE后血浆纤维蛋白原含量降低，优球蛋白的溶解时间缩短。结论：尖吻蝮蛇毒NHFLE对动物的凝血功能有影响，具有明显的抗凝作用。     

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶的纯化及其理化性质研究

目的：从蝮亚科尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus venom)中分离纯化出无出血活性纤维蛋白溶解酶(Non—hemonrrhagic fibrinolytic enzyme,NHFLE)并对其理化性质进行研究。方法：应用凝胶过滤和离子交换柱层析法分离纯化尖吻蝮蛇毒NHFLE，用纤维蛋白平板法测定其纤溶活力，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定其相对分子质量，用皮内出血实验测定其出血活性。结果：从短亚科尖吻蝮蛇毒中分离出一种单一组分的纤维蛋白溶解酶，它的相对分子质量为25000，没有出血活性，在普通纤维蛋白平板和加热平板上都能溶解纤维蛋白，相对活性为粗毒的3．2倍。结论：从尖吻蝮蛇毒中分离出相对分子质量为25000的纯化蛋白是具有直接溶解纤维蛋白活性，而无出血活性的单一的纤维蛋白溶解酶。     

器官灌流法对蛇毒引起狗DIC的鉴别作用

尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus venom,AAV)引起狗实验性DIC,並对肺、肾两脏器进行灌流。组织经常规制片,HE、PTAH及MSB染色后,光镜下观察,表明器官灌流法对降低DIC的假阳性具有一定作用,并能提高组织结构的清晰度。     

尖吻蝮蛇毒的神经毒性作用

以离体蟾蜍交感神经节作为实验模型,用细胞內电记录技术检测出尖吻蝮(五步蛇)蛇毒具有阻抑交感神经节烟碱型胆碱能性突触传递作用。这种抑制至少部分是通过突触后机制而起作用的。本文报告的AAV具有神经毒性,为解释尖吻蝮蛇伤患者呼吸肌乏力、麻痹提供了理论依据。     

五步蛇毒中血管紧张素转换酶抑制剂的研究

采用离子交换和凝胶过滤等方法，从中国五步蛇毒中分离提纯出一种血管紧张素转换酶抑制剂（ＡＣＥＩ），名为ＡＩ９３，该抑制剂经豚鼠回肠测定能加强舒缓激肽（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ，ＢＫ）的效应，再经高压纸电泳，ＨＰＬＣ和氨基酸组分分析鉴定为１３肽，不含脯氨酸，分子量约为１．４２ＫＤ，ＰＩ约为４．０，得率约是原毒的３．４‰，ＡＣＥ抑制活力测定ＩＣ５０浓度为１１．０μｍｏｌ／Ｌ，属竞争性抑制类型，Ｋｉ＝５．８μ     

江浙蝮蛇毒纤溶酶的分离纯化及性质研究

目的:江浙蝮蛇毒纤溶酶的分离纯化及部分生物化学和药理性质的研究.方法:应用DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱和HiPrep Sephacryl S 100柱分离纯化纤溶酶,以高效液相色谱仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯度、相对分子质量,应用等电聚焦电泳测定等电点,然后测定氨基酸组分及部分药理性质.结果:分离得到相对分子质量为59 100,等电点为4.98, SDS-PAGE为一条带,高效液相色谱分析为单一峰的纤溶酶.该组分属于金属蛋白酶类.氨基酸组成分析表明它含较多的酸性氨基酸.高浓度的纤溶酶对肿瘤细胞CEN2有抑制作用,有微弱的出血毒性.结论:分离纯化得到了一种有微弱出血毒,具有较强抗凝活性的单一组分的酸性金属蛋白酶.