不同激活剂对巨噬细胞肿瘤坏死因子－α产量及其基因表达的作用

研究γ－干扰素（ＩＦＮ－γ），ＴＮＦ－α和脂多糖（ＬＰＳ）或它们的联合应用诱导巨噬细胞产生ＴＮＦ－α及其ｍＲＮＡ表达的作用。ＬＰＳ和ＴＮＦ－α均能诱导巨噬细胞ＴＮＦ－α合成并伴随着ｍＲＮＡ表达。ＩＦＮ－γ虽能诱导ＴＮＦ－αｍＲＮＡ表达，却未能检测到其蛋白质合成．．ＩＦＮ－γ能协同ＴＮＦ－α增加ＴＮＦ－αｍＲＮＡ表达水平，而不能增加其蛋白质合成。ＩＦＮ－γ能协同ＬＰＳ增加ＴＮＦ－γｍＲＮＡ表达水平和蛋白质合成。     

丝裂原活化蛋白激酶通路对脂多糖诱导RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α基因表达的协同调节作用

目的 探讨脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因表达过程中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的协同调节作用及其分子机制。方法 用蛋白激酶活性测定分析LPS刺激RAW264．7细胞引起的激酶活性变化;用报告基因技术和反转录聚合酶链反应（RT－PCR）方法研究LPS诱导的TNF－α基因转录的分子机制。结果 LPS刺激RAW264．7细胞可引起细胞外信号调节激酶1（ERK1）、c-Jun氨基末端激酶1（JNK1）和p38MAPK的一过性激活,用MAPK上游激酶的活性突变体分别转染RAW264．7均可不同程度地诱导TNF－α启动子转录活性;而且,这些MAPK通路激活诱导的TNF－α启动子转录活性表现出明显的协同效应;三种MPAPK的无活性突变体均显示出对LPS刺激引起的TNF－α启动子转录激活的抑制效应;RT－PCR的结果证实,ERK、JNK和p38MAPK的特异性抑制剂对TNF－αmRNA表达具有不同程度的抑制作用。结论 LPS刺激引起的TNF－α启动子转录活性增加,可能涉及了ERK、p38和JNK三条通路的激活;这些通路通过协同效应共同发挥对TNF－α基因表达的调控。     

人黑色素瘤单抗VH—TNF融合蛋白基因的构建和表达

在大肠杆菌中表达人黑色素瘤单抗ＶＨ－ＴＮＦ融合蛋白基因。方法；在人肿瘤坏死因子基因上游插入了抗黑色素瘤单抗Ｍｅｌ３的重链可变区基因，将此融合基因插入大肠杆菌表达系统ｐＧＥＸ－２Ｔ的ＧＳＴ基因下游，ＩＰＴＧ诱导表达，表达产物经凝血酶消化后，测定其对Ｌ９２９细胞的杀伤活性，并进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，用抗ＴＮＦ抗体进行蛋白印迹分析。     

免疫抑制豚鼠肺部炎症反应中TNF—α的表达

目的 探讨免疫抑制宿主（ＩＣＨ）肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ－α）介导的肺部炎症机制。方法 采用醋酸可的松联合环磷酰胺建立ＩＣＨ动物模型，ＩＣＨ活体肺经气管给予内毒素（ＬＰＳ）诱导ＩＣＨ肺部炎症反应，刺激前及刺激后１、３、５、８、２４ｈ行支气管肺泡灌洗（ＢＡＬ），异硫氰酸胍一步法抽提肺组织总ＲＮＡ。随机引物ＤＮＡ标记方法制备ＴＮＦ－α ｃＤＮＡ探针，点杂交测定ＴＮＦ－α ｍＲＮＡ。结果 ＬＰＳ刺激后肺     

细菌脂多糖诱导THP1细胞丝裂原信号传导通路活化及细胞因子释放

丝裂原活化的蛋白激酶(ＭＡＰＫ)系列包括一蛋白激酶瀑布群,即癌基因ｐ21ｒａｓ和或蛋白激酶Ｃ(ＰＫＣ),ｒａｆ1蛋白激酶,丝裂原活化蛋白激酶的激酶1和2(ＭＥＫ)以及ＭＡＰＫ(也称细胞外信号调节的蛋白激酶ＥＲＫ)。细菌脂多糖是巨噬细胞的强力活化剂,能刺激巨噬细胞释放多种细胞因子和二十烷类免疫反应介质。已有报道,细菌内毒素脂多糖(ＬＰＳ)刺激ＭＡＰＫ磷酸化及活化并诱导肿瘤坏死因子(ＴＮＦα)和ＩＬ1β产生[1]。为明确ＬＰＳ及癌基因ｒａｓ和蛋白激酶ｒａｆ在调节丝裂原信号传导通路活性中的作用,更好了解ＬＰＳ激活单核巨噬细胞的…     

腺病毒介导的细胞因子基因转染对小鼠巨噬细胞功能的影响

探讨重组腺病毒介导的细胞因子基因转染对巨噬细胞体外抗肿瘤免疫功能的影响。方法通过重组腺病毒的介导，将白细胞介素４（ＩＬ－４）及巨噬细胞集落刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）基因转染至小鼠腹腔内巨噬细胞，并检测其上清中ＩＬ－４及Ｍ－ＣＳＦ的水平；同时检测基因转染后巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，及其分泌的肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ－１、一氧化氮（ＮＯ）水平与主要组织相容性抗原复合物（ＭＨＣ）Ⅱ类分子的表达情况。结果基因转染后４小时，巨噬细胞即可表达较高水平的ＩＬ－４和（或）Ｍ－ＣＳＦ，转染后１８小时，巨噬细胞上清中ＩＬ－４水平为９５Ｕ／ｍｌ，Ｍ－ＣＳＦ为３５Ｕ／ｍｌ；转染后巨噬细胞杀伤活性明显升高，两者联合应用并以内毒素脂多糖（ＬＰＳ）协同刺激时，这一升高更为明显；其上清中ＴＮＦ、ＩＬ－１及ＮＯ水平均有不同程度的升高；ＭＨＣⅡ类分子的表达在ＩＬ－４及Ｍ－ＣＳＦ联合转染组有所增强。结论巨噬细胞中ＩＬ－４及Ｍ－ＣＳＦ基因的表达可以增强其抗肿瘤免疫功能。     

TNF,IFN,MHCⅠ类分子基因“正反馈”式放大表达的重组腺病？…

目的 为使外源性ＴＮＦ,ＩＦＮ基因和内源性主要组织相容性复合物Ⅰ类ＭＨＣⅠ）分子基因表达呈现“正反馈”式放大效应,构建在ＨＬＡ－Ｂ７启动子调控、ＩＲＥＳ连接下协同表达ＴＮＦα和ＩＦＮβ基因的重组腺病毒载体。方法和结果 从ｐＧＬ３Ｂ７ＴＮＦ及ｐＩＲＩＦ中切下Ｂ７ｐｒｏ－ＴＮＦ和ＩＲＥＳ－ＩＦＮβ基因片段,先后插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓｋ（＋）,构建成ｐＢＬＢ７ＴＮＩＲＩＦ。回收ＴＮＦα－ＩＲＥＳ     

α肿瘤坏死因子（TNFα）基因的分离鉴定及在人肝癌细胞中的表达

应用不连续密度梯度法分离获得人肝癌浸润性单个核细胞（ＴＩＭ），ＲＮＡ斑点杂交提示ＴＩＭ中有明显的ＴＮＦαｍＲＮＡ转录。经ＲＴ－ＰＣＲ扩增反应分离得到一特异的７００ｂｐ左右的ＤＮＡ片段，ＤＮＡ序列分析证实这一ＤＮＡ片段中包含编码人ＴＮＦα成熟肽所需的的全部ｃＤＮＡ序列。将这一人ＴＮＦαｃＤＮＡ克隆到真核细胞表达质粒ｐＳＶＫ３，获得真核细胞表达重组ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ，用磷酸钙沉淀法将ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ导入人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１中的细胞培养上清中可检测到ＴＮＦα的一过性表达。结果提示ＴＩＭ可成为获取ＴＮＦα基因的来源，获得的ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ重组质粒为肝癌的基因治疗奠定了基础。     

商陆皂甙甲对人外周血单核细胞产生肿瘤坏死因子的抑制作用

研究商陆皂甙甲对脂多糖刺激人外周血单核细胞产生肿瘤坏死因子的影响。方法：用Ｌ９２９细胞作靶细胞的生物测定法，检测与ＥｓＡ共育的受ＬＰＳ刺激的人外周血单核细胞上清中ＴＮＦ的含量。结果：当ＥｓＡ浓度在１和１０μｍｏｌ／Ｌ时，受ＬＰＳ刺激的人单核细胞产生ＴＮＦ显著减少。     

中晚期大肠癌患者外周血单核细胞释放TNF的动态观察

用生物活性测定法观察了ＬＰＳ、ＩＦＮ－γ及ＬＰＳ＋ＩＦＮ－γ诱导正常人和中晚期大肠癌患者（ＰＢＭ）释放ＴＶＦ的动态变化．结果；在上述诱生剂诱导下正常人ＰＢＭ均可释放ＴＮＬ并且存在明显的时间效价关系，以ＬＰＳ＋ＩＦＮ－γ所诱生的ＴＮＦ活性最高。在中晚期大肠癌患者中单独应用ＬＰＳ或ＩＦＮ－γ均不能诱导ＰＢＭ释放ＴＮＦ，而ＬＰＳ和ＩＦＮ－γ联合作用ＰＢＭ后可使其分泌较高水平的ＴＮ；但其ＴＮＦ的动态变化与正常人有明显的不同。上述结果提示：中晚期大肠场患者ＰＢＭ释放ＴＮＦ的能力受到抑制或损害，经适当的诱导可在一定程度上改善和提高ＴＮＦ产量。     

Activation of p~(38) mitogen activated protein kinase induced by lipopolysaccharide and its role in TNF a gene expression

Mitogen--activatedproteinkinase(MAPKs)aremajormediatorsineukaryoticcellstotransductextracellularsignalsintocellularresponses['].Thereareatleast4subgroupsofMAPKsidentifiedinmammaliancells:extracellularsignal--regulatedkinase(ERK),c--JunN--terminalkinase(JNK)orstressactivatedproteinkinase(SAPK),ERKSorBMK1andp38['"].MAPKsareactivatedbyvariousstimulitomediatemanycellularprocessesorresponses,includingcellgrowth,death,cellcycle,inflammationandstressresponses,elc.[l.31.ActivationofMAPKs…     

LPS刺激对RAW264.7细胞p38蛋白激酶的细胞内定位的影响

目的 探讨p38蛋白激酶信号传导的过程及其在细胞中的特异性作用机制。方法 应用间接荧光标记免疫探针技术及共聚焦激光扫描技术观察单核细胞中p38蛋白激酶的分布及LPS对其分布的影响。结果p38在未受刺激的静息单核细胞及内皮生长因子（EGF）刺激的单核细胞胞浆和胞核中荧光强度均呈弥散性分布;脂多糖（LPS）刺激使细胞核区的荧光强度明显增强,而胞浆区域的荧光强度降低。激酶动力学的研究显示,p38激活先于p38移位。LPS刺激后30 min,p38激酶活性即达到高峰,随后2 h内逐步下降,p38激酶活性呈一过性增高;LPS刺激45 min后,核区荧光强度达到峰值,且在2 h内维持在高水平。结论 单核细胞由LPS激活后,其p38蛋白激酶由胞浆转位到胞核,反应具有一定的特异性;p38移位入核依赖于p38磷酸化活化及由细胞浆移位到细胞核是一系列连续发生的事件。     

Studies on the translocation of p38 mitogen-activated protein kinase in cardiomyocytes of nude mice on the stimulation of LPS

Milogen-activate(l I)rotejn kinase (MAPK) is the major mediator to lransduce the extracellular signals from tilem(fll]1)rarle to internal nucleus"l. p38 MAPK pathway isone of 1\he 4 pathways that have been identified sofar',.,"'. l[ was proved that the aotivati(,n of I)38 MAPKall'e(fled Ills I)r(>(t'fsses of (tell growth, cell 'lycle and aPOptosis. afl(1 was involve(l ifl the uvula[1()n of inflammationan(l sir(>ss l-c):il)onses. Tile sin(ly ')f the exa(II (lellular location oj' I)n)lo…     

p38丝裂原激活蛋白激酶对人胚胎肾293细胞一氧化氮合酶基因转录的调控

目的：探讨p38丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）家族四种亚型对诱导型一氧化氮合酶（iNOS)基因的转录调控。方法：以人胚胎肾293（HEK293）细胞为靶细胞，采用脂质体（LPS）介导的细胞基因共转染技术，荧光素酶报告基因技术，分别将FLAG－tagged p38MAPK4种亚型，含有鼠iNOS基因启动子区的荧光素酶报告基因质粒（piNOS-Luc)，空载体（pcDNA3),β－半乳糖苷酶表面质粒（pCMV－β）共转染，检测并比较荧光素酶相对活性。结果（1）未加刺激时，在HEK293细胞中，p38MAPK中仅有p38α的诱导作用亦有明显，结论：（1）LPS能够在HEK293细胞中诱导iNOS基因转录活性；（2）在HEK293细胞中，p38MAPK参与了静息时及LPS刺激下对iNOS基因的转录调控。     

丝裂原活化蛋白激酶对佛波酯诱导滋养细胞MMP-9基因表达的影响

目的 探讨佛波酯(PMA)诱导细胞滋养层细胞(CTB)MMP-9基因表达的调控机制。方法 用细胞ELISA法测定CTB细胞的蛋白激酶活性变化;用反转录聚合酶链反应检测CTB中MMP-9的基因表达。结果 100 nmol/L PMA能迅速激活CTB中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)以及p38 MAPK激酶的活性。100 nmol/L PMA刺激CTB引起MMP-9 mRNA表达显著增加,能被ERK或p38 MAPK的特异性抑制剂所抑制。结论 ERK和p38 MAPK可能是PMA诱导CTB中MMP-9基因表达增加的重要调节物质。     

Simvastatin attenuates lipopolysaccharide-induced airway mucus hypersecretion in rats

Background Mucus hypersecretion in the respiratory tract and goblet cell metaplasia in the airway epithelium contribute to the morbidity and mortality associated with airway inflammatory diseases. This study aimed to examine the effect and mechanisms of simvastatin on airway mucus hypersecretion in rats treated with lipopolysaccharide （LPS）. Methods Mucus hypersecretion in rat airways was induced by intra-tracheal instillation of LPS. Rats treated with or without LPS were administered intra-peritoneally simvastatin （5 and 20 mg/kg） for 4 days. Expression of Muc5ac, RhoA and mitogen-activated protein kinases （MAPK） p38 in lung were detected by real-time polymerase chain reaction （PCR）, immunohistochemistry or Western blotting. Tumor necrosis factor （TNF）-α and IL-8 in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were assayed by an enzyme-linked lectin assay and enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results Simvastatin attenuated LPS-induced goblet cell hyperplasia in bronchial epithelium and Muc5ac hypersecretion at both the gene and protein levels in lung （P 〈0.05）. Moreover, simvastatin inhibited neutrophil accumulation and the increased concentration of TNF-α and IL-8 in BALF follows LPS stimulation （P 〈0.05）. The higher dose of simvastatin was associated with a more significant reduction in Muc5ac mRNA expression, neutrophil accumulation and inflammatory cytokine release. Simultaneously, the increased expression of RhoA and p38 MAPK were observed in LPS-treated lung （P 〈0.05）. Simvastatin inhibited the expression of RhoA and p38 phosphorylation in lung following LPS stimulation （P 〈0.05）. However, the increased expression of p38 protein in LPS-treated lung was not affected by simvastatin administration. Conclusions Simvastatin attenuates airway mucus hypersecretion and pulmonary inflammatory damage induced by LPS. The inhibitory effect of simvastatin on airway mucus hypersecretion may be through, at least in part, the suppression of neutrophil accumulation and     

丝裂原活化蛋白激酶对佛波酯诱导滋养细胞MMP-9基因表达的影响

目的 探讨佛波酯(PMA)诱导细胞滋养层细胞(CTB)MMP-9基因表达的调控机制。方法 用细胞ELISA法测定CTB细胞的蛋白激酶活性变化；用反转录聚合酶链反应检测CTB中MMP-9的基因表达。结果 100nmol／L PMA能迅速激活CTB中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)以及p38 MAPK激酶的活性。100nmol／L PMA刺激CTB引起MMP-9 mRNA表达显著增加，能被ERK或p38 MAPK的特异性抑制剂所抑制。结论 ERK和p38 MAPK可能是PMA诱导CTB中MMP-9基因表达增加的重要调节物质。     

Biochemical pathways in the antiatherosclerotic effect of berberine

Background This study investigated the inhibitory effect of berberine （BBR） on lipopolysaccharide （LPS） induced cyclooxygenase-2 （COX-2） expression via the mitogen activated protein kinase （MAPK） signalling cascade pathways in human peripheral blood monocytes （PBMC）.
Methods PBMC from whole blood were isolated and cultured for up to 24 hours after division into 5 groups treated with LPS, LPS＋BBR 25 μmol/L, LPS＋BBR 50 μmol/L or LPS＋BBR 100 μmol/L and untreated. Monocytes were extracted for RT-PCR and Western blot analyses to examine COX-2 mRNA and protein activated expression of p38 mitogen activated protein kinase （p38MAPK）, Jun N-terminal kinase （JNK） and extracellular regulated kinases 1/2 （ERK1/2） signalling pathways.
Results COX-2 mRNA and protein expression decreased to a minimum at 12 hours after BBR treatment （P 〈0.05）. With the increasing concentration of BBR treatment, the COX-2 expression decreased progressively （P 〈0.01）. With BBR treatment for 6, 12 or 24 hours at three doses, ERK1/2 protein expression was significantly inhibited. For the JNK pathway, only with the treatment of BBR at the concentration of 100 μmol/L was JNK protein expression inhibited compared with the LPS stimulation group （P 〈0.01）. Irrespective of the BBR concentration, no difference was shown between the BBR group and the LPS group for p38MAPK protein expression. Human monocytes COX-2 mRNA, by RT-PCR, and protein expression, by Western blot analysis, were inhibited when incubated with PD98059, SP600125 and SB203580 （P 〈0.05）.
Conclusions Berberine inhibits COX-2 expression via the ERK1/2 signalling pathway and, possibly, at a high dosage via the JNK pathway. P38MAPK may have no relationship with the effect of BBR in PBMC. Berberine inhibited COX-2 mRNA and protein expression in a dose dependent manner and suppressed COX-2 expression to a minimal level after 12 hours of berberine treatment.