黄芩苷通过抑制小胶质细胞活化缓解吗啡耐受

探讨黄芩苷对小胶质细胞活化和慢性耐受的影响并考察其作用机制。应用RT-PCR和ELISA法考察细胞释放炎症因子IL-1β和TNF-α的变化,Western blot法检测细胞中p-p38MAPK和IBA-1蛋白表达变化,热板法检测慢性吗啡耐受小鼠热板痛阈变化。实验结果发现,黄芩苷(1,10,100 μmol/L)剂量依赖性地抑制吗啡活化的BV2细胞释放IL-1β和TNF-α,100 μmol/L黄芩苷明显降低p-p38MAPK水平。鞘内注射黄芩苷(20,40,60 μg)可剂量依赖性地改善慢性吗啡耐受,鞘内注射黄芩苷60 μg可模拟出小胶质细胞抑制剂米诺环素的作用并能显著抑制慢性吗啡耐受小鼠脊髓p-p38MAPK以及IBA-1的表达。本研究表明,黄芩苷可通过抑制p38MAPK信号通路抑制吗啡引起的小胶质细胞活化,进而显著改善慢性吗啡耐受。     

米诺环素对慢性低氧高二氧化碳模型小鼠小胶质细胞活化的影响

目的：观察米诺环素对慢性低氧高二氧化碳模型的小鼠小胶质细胞活化的影响。方法：C57BL/6野生小鼠30只随机分为3组：空白对照组（NC组）、盐水造模组（MS组）、米诺环素造模组（MM组）。将造模组小鼠置于常压低氧高二氧化碳舱内,通过氮气调节舱内氧浓度,使其维持在9%～11%,通入二氧化碳使其浓度维持在5%～6%,每天8 h,共4周。造模2周后,每天造模结束MM组立即腹腔注射米诺环素（45 mg/kg）,MS组以等量的0.9%氯化钠溶液腹腔注射。小鼠饲养到规定时间后,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,处死小鼠快速分离出两侧海马,右侧用于免疫组化检测小胶质细胞的活化,左侧用于荧光定量PCR测定IBA-1 mRNA、MMP-9 mRNA的表达。结果：NC组海马区可见静息态、呈树枝状、胞体小、突起多的小胶质细胞,MS组可见胞体肥大、突起较少的小胶质细胞,MM组有散在的小胶质细胞激活。与NC组相比,MS组IBA-1 mRNA、MMP-9 mRNA表达上调;与MS组相比,MM组IBA-1 mRNA、MMP-9 mRNA表达减少。结论：慢性低氧高二氧化碳环境下小鼠海马区IBA-1表达上调,提示有一定程度的小胶质细胞激活;米诺环素可抑制慢性低氧高二氧化碳对小鼠小胶质细胞活化,这可能与减少MMP-9的分泌有关。     

川芎嗪通过抑制脊髓小胶质细胞活化缓解吗啡耐受

探讨川芎嗪对脊髓小胶质细胞活化和慢性吗啡耐受的影响并考察其作用机制。运用水浴甩尾法检测慢性吗啡耐受小鼠甩尾痛阈;免疫荧光法检测小鼠脊髓水平小胶质细胞标记分子(ionized calcium binding adapter molecule 1,IBA1)的变化情况;Western blot法检测p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase,MAPK)磷酸化水平的改变,以及RT-PCR法检测川芎嗪对慢性吗啡耐受过程中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达水平的影响。实验结果发现,川芎嗪(15,30,60 mg/kg)能够剂量依赖性地抑制吗啡引起的脊髓IBA-1、p-p38 MAPK、p38、TNF-α和IL-1β水平的升高,改善慢性吗啡耐受。研究结果表明,川芎嗪能显著改善慢性吗啡耐受,其机制可能与抑制小胶质细胞p38 MAPK信号通路有关。     

利多卡因抑制基质金属蛋白酶活性改善脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的机制研究

考察利多卡因对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导急性肺损伤(ALI)小鼠模型血浆中基质金属蛋白酶MMP-9和MMP-2活性的影响,并探讨其改善LPS诱导的急性肺损伤的作用机制。小鼠尾静脉注射不同浓度的利多卡因(2,4,8 mg/kg,iv)预处理30 min,再腹腔注射LPS 10 mg/kg刺激12 h建立小鼠ALI模型,测定小鼠7 d存活率及肺组织湿/干重比;Western blot法检测肺组织中p38 MAPK的磷酸化水平;明胶酶谱法测定血浆中MMP-9和MMP-2活性。实验结果发现,利多卡因预处理可剂量依赖性提高ALI小鼠存活率,降低肺组织湿/干重比,抑制血浆中MMP-9和MMP-2活性,并下调肺组织中p38的磷酸化水平。研究结果表明,利多卡因改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤,其机制可能与抑制基质金属蛋白酶的活化有关。     

鞘内注射AG-490对骨癌痛小鼠脊髓水平星形胶质细胞活化和热痛觉的影响

目的：探讨脊髓水平IL-6-酪氨酸激酶-2( Janus kinase 2,JAK2)信号通路调控星形胶质细胞活化的机制及其 对骨癌痛的影响。方法：将NCTC 2472纤维肉瘤细胞注入C3H/HeNCrlVr雄性小鼠股骨骨髓腔制作骨癌痛模型,以 不含纤维肉瘤细胞的等体积α-MEM培养基行骨髓腔内注射制作假手术模型。采用热缩足反射潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)评估疼痛水平。取腰段脊髓组织(L3~L5水平),分别应用Real-time RT-PCR和Western印迹检测脊髓水平 星形胶质细胞中纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和JAK2 mRNA与蛋白表达变化。鞘内注射给予JAK2 拮抗剂AG-490,观察小鼠痛行为学及脊髓水平GFAP mRNA和蛋白表达的变化。结果：骨癌痛模型组小鼠术后10, 14,21 d的PWL均较假手术组显著缩短(P<0.05);骨癌痛模型组的脊髓组织GFAP和JAK2 mRNA和蛋白表达显著增加 (P<0.05);鞘内注射30或90 nmol AG-490可以显著缩短骨癌痛模型组小鼠PWL,同时可以抑制脊髓组织GFAP mRNA和 蛋白的表达(P<0.05)。结论：脊髓水平IL-6-JAK2信号通路可能在骨癌痛的维持中发挥重要作用;IL-6-JAK2信号转导通 路可能通过抑制星形胶质细胞的活化来发挥镇痛作用。     

移植自体嗅黏膜对脊髓损伤大鼠脊髓内MMP-2、9表达的影响

目的探讨自体嗅黏膜移植干预脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)大鼠脊髓组织内基质金属蛋白酶-2、9(MMP-2、9)的表达与动物神经功能恢复的关系。方法制作SD大鼠半横断脊髓损伤模型,按随机数字表法分为模型对照组和自体嗅黏膜组,每组20只(同时取5只大鼠设为正常对照组)。自体嗅黏膜组在损伤处植入自体嗅黏膜,移植后1、3、7、14d(每时间点5只大鼠)采用BBB评分评价神经功能、免疫组织化学法检测脊髓内MMP-2、9表达。结果 SCI后自体嗅黏膜组BBB评分高于模型对照组(P<0.05)。各时间点SCI大鼠脊髓内MMP-2、9的表达显著升高(正常对照组大鼠未见MMP-2、9的表达)。伤后同一时间点自体嗅黏膜组脊髓内的阳性细胞数少于模型对照组(P<0.05)。结论自体嗅黏膜移植可明显促进神经运动功能恢复情况;此种作用可能与其能够抑制MMP-2、9过度表达有关。     

p38MAPK在体外培养脊髓星形胶质细胞P物质刺激活化中的作用

目的 观察体外培养脊髓星形胶质细胞P物质刺激活化过程中p38MAPK活性、TNF-Ot、NO水平及NOS活性的变化,探讨p38MAPK活性变化与脊髓星形胶质细胞活化的关系.方法 分离培养的SPF大鼠脊髓星形胶质细胞设正常对照组(止常组)、SP刺激组(SP组,10-7mol/L)、SB203580阻断p38MAPK组(SB组,10 umol/L)和sP刺激+SB203580阻断p38MAPK组(SP+SB组).WB法、RT-PCR法、ELISA法检测1,3,12,24 h和36 h时p38MAPK、p-p38(磷酸化p38MAPK)含量及GFAP mRNA、TNF-0、NO水平和NOS活性的变化.结果 脊髓星形胶质细胞GFAP阳性表达率大于95%.SP组脊髓星形胶质细胞总p38MAPK水平无显著变化,1 h后p-p38开始升高,3 h后GFAP mRNA水平显著增高,同时NO、NOS和TNF-a水平显著增高.用SB203580阻断p38MAPK通路后,sP+sB组较sP组p-p38、GFAP mRNA、NO、NOS、TNF-a水平显著降低.SB组总p38MAPK、p-p38、GFAP mRNA、NO、NOS、TNF-a水平无显著变化.结论 p38MAPK信号通路参与r脊髓星形胶质细胞P物质刺激活化过程,阻断p38MAPK信号通路可有效降低炎性因子水平.     

穿心莲有效成分对巨噬细胞MMP-2、MMP-9表达和活性的影响

目的 探讨穿心莲有效成分(API0134)是否具有抑制小鼠腹腔巨噬细胞基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9(MMP-2,MMP-9)活性及其mRNA表达的作用.方法 用腹腔冲洗的方法收集小鼠腹腔巨噬细胞,使用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激巨噬细胞,同时分别以不同浓度的API0134对巨噬细胞进行干预.采用免疫荧光方法、明胶酶谱法和RT-PCR的方法检测ox-LDL和API0134对巨噬细胞MMP-2、MMP-9活性和表达的影响.结果 与对照组相比,ox-LDL组MMP-2及MMP-9活性和mRNA表达显著升高(均P＜0.01).与ox-LDL组相比,加入50 μg/mL API0134组MMP-2及MMP-9的活性和mRNA表达变化不明显(均P＞0.05),而加入100、200 μg/mL API0134组的MMP-2及MMP-9的活性和mRNA表达均有不同程度的下降(均P＜0.05).结论 穿心莲有效成分能够抑制ox-LDL对巨噬细胞MMP-2及MMP-9活性和mRNA表达的上调作用,因此可能具有维护粥样斑块稳定,减少斑块破裂危险的作用.     

S100A11对主动脉夹层的影响及其机制

目的 探讨S100A11在主动脉夹层(aortic dissection, AD)中的作用及其可能的机制。方法 在体内实验中,通过饮水摄入β-氨基丙腈建立AD模型。构建S100A11-shRNA慢病毒载体,尾静脉注射AD模型大鼠。HE染色观察主动脉的病理变化,TUNEL染色观察细胞凋亡,免疫组化法检测S100A11、RAGE、p-p38蛋白表达,Western blot检测MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2、PCNA和ki67蛋白表达水平。在体外实验中,利用pIRES2-GFP将S100A11过表达载体转染至人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)中。流式检测细胞凋亡,Western blot检测RAGE/p38MAPK通路及MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2、PCNA、ki67蛋白表达。最后用RAGE抑制剂FPS ZM1和p38抑制剂SB203580处理细胞,Western blot检测相关蛋白的表达。结果 sh-S100A11能够缓解主动脉病理变化,减少细胞凋亡。与正常组和假手术组相比,AD模型大鼠S100A11、RAGE、p-p38、MMP-2、MMP-9和Bax水平升高,Bcl-2、PCNA和ki67水平降低,而Lv-S100A11-shRNA组趋势相反。细胞实验结果显示S100A11可通过RAGE-p38MAPK通路靶向下游基因MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2、PCNA和ki67促进细胞凋亡。结论 S100A11基因在AD大鼠中有较高水平表达,干扰或过表达该基因表明S100A11可通过RAGE-p38MAPK通路促进细胞凋亡,提示S100A11可能是AD诊断和治疗的靶点之一。     

银屑病患者基质金属蛋白酶-2与基质金属蛋白酶-9的检测价值

目的:探讨银屑病患者血清和皮肤中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平的临床意义。方法:寻常型银屑病患者22例,健康对照组15例。采用ELISA法检测两组血清MMP-2、MMP-9,皮肤MMP-2、MMP-9表达,采用免疫组化ABC法。结果:银屑病患者血清、皮肤中MMP-2、TIMP-9表达水平显著高于健康对照组(P0.05)。结论:MMP-2、MMP-9增高可能是银屑病的发病机制之一。     

p-CREB在切割疼痛大鼠脊髓背角的变化

目的：探讨环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein， p-CREB）在切割痛敏形成中的作用。方法：异氟烷麻醉大鼠后切割后足。免疫组织化学染色，荧光双标对p-CREB进行定位。腹腔注射吗啡和加巴喷丁，进行行为学测定和免疫组织化学染色。结果：大鼠后足切割痛可以使同侧腰段脊髓背角内p-CREB增加，切割后0.5~3 h内比较明显(P＜0.05)。p-CREB增加主要定位于背角神经元。腹腔注射吗啡产生镇痛作用的同时，与未切割组相比，p-CREB没有出现增加(P＞0.05)。加巴喷丁产生部分镇痛作用时，与未切割组相比，p-CREB增加(P＜0.05)。结论：切割疼痛所致的同侧脊髓背角内p-CREB增加与切割疼痛和痛觉过敏密切相关。吗啡对切割疼痛的镇痛作用机制与抑制脊髓背角内CREB的磷酸化增加有关。加巴喷丁对切割疼痛的镇痛作用机制与抑制脊髓背角内CREB磷酸化关系不密切。     

2型大麻素受体通过抑制脊髓小胶质细胞活化减轻神经病理性疼痛小鼠痛觉过敏

目的 探讨脊髓大麻素受体2（CB2R）与小胶质细胞激活对小鼠神经病理性疼痛中痛觉过敏的影响。方法 采用脊神经结扎（SNL）创建神经病理性疼痛模型,C57/BL小鼠60只随机分为六组：假手术组（Sham）、模型组（SNL）、模型+ CB2R激动剂组（SNL+AM1241）、模型+小胶质细胞抑制剂组（SNL+Min）、模型+CB2R小干扰RNA组（SNL+siRNA）、模型+CB2R小干扰RNA+小胶质细胞抑制剂组（SNL+siRNA+Min）。Western blot测定小鼠脊髓CB2R蛋白表达,Von Frey测定各组小鼠机械性痛阈变化,免疫荧光观察脊髓背角小胶质细胞激活情况,PCR测定小鼠脊髓内炎症因子释放,电生理技术观察CB2R激动剂对脊髓背角抑制性突触后电流（sIPSC）的影响。结果 同Sham组相比,SNL小鼠脊髓CB2R表达明显减少,痛阈降低,小胶质细胞激活明显增强,且炎症因子释放增加;鞘内注射CB2R激动剂或小胶质细胞抑制剂后,同SNL相比SNL+AM1241、SNL+Min组痛阈增加,小胶质细胞激活减弱且炎症因子有所减少;而siRNA干扰CB2R表达后同SNL相比,SNL+siRNA小鼠痛阈降低,小胶质细胞激活明显增强,且炎症因子释放增加,同时鞘内注射Min逆转siRAN介导的变化。电生理结果显示AM1241显著增强脊髓背角sIPSC频率和振幅,而Min持续灌流抑制AM1241的效应。结论 CB2R通过抑制脊髓小胶质细胞活化减轻神经炎性反应并增强抑制性电活动,从而减轻神经病理性疼痛的痛觉过敏。     

阿司匹林诱生型脂氧素A4对小鼠脊髓撞击损伤后神经病理性疼痛的影响及机制探讨

目的  评估阿司匹林诱生型脂氧素A4（ATL）对小鼠脊髓损伤（SCI）模型中神经炎症和神经病理痛的影响。方法  成年FVB小鼠T10节段脊髓进行改良Allen''脊髓撞击损伤。小鼠随机分成ATL组和Vehicle组,分别在SCI手术后4和24 h鞘内注射ATL（300 pmol）或vehicle。采用von Frey方法评估两组小鼠后脚机械刺激的敏感性;采用PCR方法检测两组小鼠脊髓小胶质细胞标记物和细胞因子信使核糖核酸（mRNA）表达;此外,通过小鼠大脑皮层组织小胶质细胞培养来评估ATL对小胶质细胞的激活和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）释放的直接影响。结果  与Vehicle组小鼠比较,ATL处理导致SCI诱导的小鼠机械痛敏降低;脊髓小胶质细胞标记物和促炎性细胞因子mRNA水平也下降。而且,ATL处理对小胶质细胞标记物IBA-1和促炎性因子TNF-α表达影响。此外,原代皮层小胶质细胞表达ATL相应受体ALX,ATL通过ALX发挥抗炎作用。结论  ATL通过ALX受体调节小胶质细胞激活和TNF-α释放,最终降低小鼠SCI后神经病理性疼痛。

     

Electroacupuncture Attenuates Spinal Nerve Ligation-Induced Microglial Activation Mediated by p38 Mitogen-Activated Protein Kinase

Objective

To investigate whether analgesic effect of electroacupuncture (EA) is affected by p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) on microglia.

Methods

There were two experiments. The experiment 1: 40 male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into the normal, surgery, EA and sham EA groups, and the L5 spinal nerve ligation (SNL) on the right side was used to establish neuropathic pain model. EA was applied to bilateral Zusanli (ST36) and Kunlun (BL60) at 24, 48 and 72 h after SNL for 30 min, once per day. The paw withdrawal thresholds (PWTs) were measured before surgery (as base) and at 24, 25, 49 and 73 h after surgery. Phospho-p38 MAPK (p-p38 MAPK), oxycocin-42 (OX-42, marker of microglia), and glial fibrillary acidic protein (GFAP, marker of astrocyte) in bilateral spinal cord dorsal horn (SCDH) were detected by immunofluorescence, respectively. The experiment 2: 40 male SD rats were cannulated for SNL-induced neuropathic pain, and then were randomly divided into the dimethyl sulfoxide (DMSO), EA plus DMSO, 4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfonylpheny)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole (SB203580) and EA plus SB203580 groups. SB203580 (30 nmol/L) was administered 5 min prior to EA treatment. The PWTs and OX-42 in bilateral SCDH were measured as mentioned above.

Results

SNL-induced neuropathic pain reduced PWTs and increased the expression of p-p38 MAPK and OX-42 in bilateral lumbar SCDH of rats (P<0.01). Spinal p-p38 MAPK was only co-localized with OX-42 in our study. EA treatment significantly alleviated SNL-mediated mechanical hyperalgesia, and suppressed the expression of p-p38 MAPK and OX-42 in lumbar SCDH (P<0.05 or P<0.01). Intrathecal injection of low dose SB203580 had no influence on PWTs (P>0.05), but significantly inhibited the expression of OX-42 positive cells in bilateral SCDH (P<0.01 or P<0.05). EA plus SB203580 synergistically increased PWTs, and reduced the expression of bilateral spinal OX-42 (P<0.01 or P<0.05).

Conclusions

The central mechanism of EA-induced anti-hyperalgesia may be partially associated with the reduced expression of p-p38 MAPK, and subsequently reducing the activation of OX-42 in neuropathic pain. Therefore, EA may be a new complementary and alternative therapy for neuropathic pain.

     

诱导型一氧化氮合酶反义核酸在脊髓损伤后细胞凋亡和p-p38 MAPK信号转导通路中的作用

目的研究一氧化氮合酶(NOS)反义核酸(ASODN)对脊髓损伤后NOS表达、细胞凋亡、信号转导通路的影响。方法设计并合成诱导型NOS反义寡脱氧核苷酸(ASODN-iNOS)及诱导型NOS无义寡脱氧核苷酸(NSODN-iNOS),微量注入大鼠蛛网膜下腔并制备成脊髓压迫伤动物模型。伤后6 h分别用RT-PCR检测iNOS mRNA表达及用Western blotting检测组织中磷酸化丝裂原激活蛋白激酶(p-p38 MAPK)的变化,用双标染色流式细胞术检测伤后72 h细胞凋亡情况。损伤对照组鞘内注射不含核酸的溶液成分。结果脊髓损伤后组织中存在iNOS的表达和p-p38 MAPK变化;损伤后局部组织中存在明显的细胞凋亡;ASODN-iNOS可以抑制iNOS的表达,并可以显著抑制损伤后p-p38 MAPK的表达和细胞凋亡的发生,与损伤对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论ASODN-iNOS可以抑制脊髓损伤后iNOS的表达和细胞凋亡,ASODN的这种作用可能与p-p38 MAPK信号转导通路有关。     

骨癌痛模型大鼠患侧腰段脊髓p38α和p38β的细胞定位及其意义

目的 观察骨癌痛模型大鼠患侧腰段脊髓p38d和p38B的分布及细胞定位,探讨其在骨癌痛中的作用机制。方法 选择雌性SD大鼠20只,随机分为2组,每组10只：A组（对照组）：左侧胫骨上段骨髓腔注入3μl Hanks液;B组（模型组）：左侧胫骨上段骨髓腔注入3μl MADB-106大鼠乳腺癌细胞（4．8×10^3／μl）。术前及术后14d,各组大鼠隔日观察机械痛及辐射热痛阈值变化。第14d,取大鼠脊髓L4～6节段,采用免疫组织化学ABC法和荧光双标法观察骨癌痛模型大鼠患侧腰段脊髓p38α和p38β免疫反应阳性产物的分布变化和细胞定位。结果 A组大鼠对机械、辐射热痛刺激的缩爪阈值在术后各时间点组内相比,差异无统计学意义;B组大鼠对辐射热痛刺激缩爪阈值在术后的前6d与A组相比,差异有统计学意义（P〈0．05）;术后第14d,与A组大鼠对机械痛刺激缩爪阈值和辐射热痛阈值相比,B组差异有统计学意义（P〈0．05）。B组大鼠患侧腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅳp38ct和p38B免疫反应吸光值明显高于A组,两组相比差异有统计学意义（均P〈0．05）。荧光双标显示患侧腰段脊髓背角p38d与神经元特异性核蛋白标志物NeuN有共表达,p38B与小胶质细胞标志物OX-42有共表达。结论 脊髓p38d和p38B参与了骨癌痛的发生和发展,p38d主要在脊髓神经元表达,而p38B则在脊髓小胶质细胞中表达。     

脊髓水平环氧合酶和前列腺素E2在术后痛觉超敏中的作用

目的 探讨脊髓水平环氧合酶两种亚型（COX-1和COX-2）以及主要致痛物质前列腺素E2（PGE2）在术后痛觉超敏中的作用。方法 采用大鼠术后疼痛模型，分别通过Western blot和ELISA的方法，观察大鼠术后疼痛形成和发展的过程中COX-1和COX-2蛋白和PGE2表达的变化。同时，通过检测大鼠机械缩足发射阈值来测定痛觉超敏情况。结果 ①行为学观察 ： 与术前和非手术侧相比，大鼠术后2 h术侧后足机械缩足反射阈值（MWT）明显下降（P < 0.01），此后逐渐升高，5 d以后恢复正常。②Western blot分析： 与术前相比，术后2 h脊髓中COX-1和COX-2蛋白表达明显增加，4 h达到高峰（P < 0.01），COX-1蛋白表达增加一直持续到24 h，而COX-2仅持续到术后6 h。 ③ELISA检测 ： 术后大鼠腰段脊髓中PGE2含量迅速增高，4 h达高峰（P < 0.01），术后24 h虽有所降低,但和术前相比仍有统计学差异（P < 0.05）。结论 脊髓水平COX主要是COX-1和PGE2参与切口痛大鼠术后痛觉超敏的形成和早期维持过程。 【关键词】 术后疼痛 痛觉超敏 环氧合酶 前列腺素 脊髓