生存素反义寡核苷酸诱导膀胱癌细胞凋亡及增强其化疗敏感性

目的探讨生存素反义寡核苷酸（生存素-ASODN）对化疗药多西紫杉醇（泰索帝）诱导膀胱癌细胞系BIU87细胞凋亡的影响。方法将已构建成功的生存素-ASODN真核表达载体pcDNA3-SWas通过脂质体介导转染膀胱癌细胞系BIU87,并筛选转染成功的阳性克隆;采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测其生存素mRNA表达;锥虫蓝拒染法观察生存素-ASODN与泰索帝联合应用对BIU87细胞生存的影响;细胞计数和四甲基偶氮唑盐（MTT）试验测定转染细胞对泰索帝敏感性;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡DNA断裂情况;核染色检测凋亡细胞的细胞核的变化;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果转染生存素-ASODN真核表达载体pcDNA3-SWas的BIU87-SVVas细胞生存素mRNA表达水平下降、细胞增殖明显受抑,与转染pcDNA3空载体BIU87-neo细胞、未转染载体的BIU87细胞进行比较,差异均有统计学意义（均P〈0．05）;经琼脂糖凝胶电泳,BIU87-SVVa8细胞可见到DNA梯形条带,而其他对照组未见到;与BIU87-neo、BIU87细胞相比,BIU87-SVVas细胞的细胞核呈致密浓染;加入泰索帝的BIU87-SVVas细胞组的凋亡率大幅度增加。结论生存素-ASODN可促进泰索帝诱导BIUg7细胞凋亡及增加其对泰索帝的敏感性,为膀胱癌的生物学治疗研究奠定了实验基础。     

Survivin基因RNAi真核表达载体对HL-60细胞增殖及凋亡的影响

目的 构建Survivin的shRNA表达质粒并将其导入白血病细胞株HL-60细胞以探讨PNA干扰对HL-60细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计、合成两对针对survivin的shRNA序列,连接到带有人U6启动子的裁体质粒pSINsi-Hu6中,将构建重组质粒命名为pSIN/shRNA1和pSIN/shRNA2.pSIN/shRNA1转染HL60细胞,应用四唑盐(MTT)比色法观察细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 酶切分析和测序证实pSIN/shRNA1和pSIN/shRNA2构建成功.MTT测定显示转染重组质粒pSIN/shRNA1入HL-60细胞48、72和96 h后细胞增殖明显受到抑制,分别与阴性对照组、空白对照组组比较,差异有显著性(P＜0.05).流式细胞仪分析pSIN/shRNA1组胞凋亡率达(20.21±0.75)%,明显高于阴性对照组的(2.58±0.48)%和空白对照组的(1.26±0.30)%.结论 成功地构建了survivin基因RNAi真核表达栽体,且pSIN/shRNA1可序列特异性地抑制HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡,为白血病的基因治疗奠定基础.     

An Antisense Plasmid Targeting Survivin Expression Induces Apoptosis and Sensitizes Hepatocarcinoma Cells to Chemotherapy

Regulationofapoptosis (programmedcelldeath)iscriticalfornormalembryonicdevelopmentandforhomeostasisinadulttissues[1] .Dysregulationofthisprocesswithincreasedresistancetocelldeathisacommonfeatureofmalignantcells[2 ] andrepresentsasignificantobstacletotherapyofhumancancer[3] .Theinhibitorofapoptosis (IAP) protein survivinisabsentfrommostadulttissuesbutnotableforitsex pressioninmosthumancancers.Survivinisastruc turallyuniquememberoftheinhibitorofapoptosisfamilyofproteinsthatispotentiallyinvolved…     

Generation of bcl-2 antisense RNA promotes apoptosis of human promyelocytic leukemia cell line HL-60

SupportedbytheNationaINaturalScienceFoundationofChina,No.3957o79ONotonlydoesapoptosisplayakeyroleinhomeostasis,butalsohascloserelationshipwithtumorigenesisandtumorregression,aswellaswiththechemotherapeuticandradiotherapeuticef-fectsontumors[lJ.Justasthecellproliferation,thecellapoptosisisalsomodulatedbymanygenes,includingsomeoncogenesandtumorsup-pressorgenes(p53,bcl-2,c-my,etc.)[2].Forex-ample,thehighexpressionofbcl-2inleukemiacellscanobviouslyinhibittheapoptosisinducedbytheremovalofgrowth…     

Survivin反义核酸对SKOV3细胞生长及Survivin基因表达的影响

目的 :观察Survivin反义核酸对人卵巢癌细胞系SKOV3的生长及Survivin基因表达的影响。方法 :应用基因重组技术 ,将在真核细胞中能稳定表达反义Survivin的pcDNA3 SVVas经脂质体LipofectamineTM2 0 0 0 介导转染人卵巢癌细胞株SKOV3,经G4 1 8筛选得到抗性克隆 (SKOV3/SVVas) ,同时以空载体pcDNA3转染SKOV3作为对照(SKOV3/neo) ;绘制细胞生长曲线 ;采用免疫组化、RT PCR和流式细胞仪检测SKOV3、SKOV3/neo及SKOV3/SVVas细胞的内源性SurvivinmRNA及蛋白的表达和凋亡细胞。结果 :与SKOV3及SKOV3/neo细胞比较 ,SKOV3/SVVas细胞增殖和代谢能力均明显降低 ,Survivin蛋白阳性表达率及mRNA相对表达量明显降低 (P <0 .0 1 ) ,细胞凋亡率显著增加 (P <0 .0 1 )。结论 :稳定表达的反义Survivin能够有效抑制SKOV3细胞内源性Survivin蛋白的表达 ,诱导SKOV3细胞凋亡。     

阿米福汀对HL-60细胞中survivin表达的影响

目的 探讨阿米福汀（WR-2721，amifostine，AMI）对人髓系白血病细胞HL-60中survivin表达的影响。方法 不同浓度AMI（1，10，1000μmol/L）干预HL-60细胞24，48，72h，用MTT比色法检测细胞的生长抑制作用;用半定量RT-PCR方法检测抑凋亡基因survivin mRNA的表达水平。结果 阿米福汀可显著抑制HL-60细胞的增殖和下调抑凋亡基因survivin的表达水平，且均有明显浓度和时间依赖性。结论 AMI可能通过下调抑凋亡基因survivin的表达，解除其抑制凋亡效应，从而抑制HL-60细胞的增殖。     

靶向PTTG和survivin双干扰siRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建同时干扰人垂体瘤转化基因(PTTG)和生存素(survivin)基因表达的RNA共干扰载体,并检测其对人脑胶质瘤U251细胞中PTTG基因和survivin基因的干扰作用.方法:根据GenBank数据库中PTTG和survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰PTTG和生存素基因的重组干扰质粒pGene...     

SHP1基因诱导慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡及红系分化

目的探讨SHP1基因在诱导K562细胞凋亡及红系分化中的作用。方法应用RT-PCR法克隆SHP1基因全长cDNA序列并克隆于真核表达载体pcDNA3.0,脂质体转染使其基因在K562细胞中过表达。Hoechst33258染色和FACS(AnnexinⅤ-PI双标)分析检测转基因后K562细胞凋亡;联苯胺蓝染色和血型糖蛋白A(GPA)表达检测分析细胞分化情况。结果 pcDNA3-SHP1转染K562细胞,RT-PCR、蛋白免疫印迹分析证实SHP1在K562细胞中表达。转染48h后,K562细胞出现凋亡,AnnexinⅤ-PI双标FACS分析细胞凋亡率为16.84%,与转染空载体pcDNA3.0(6.23%)相比差异有统计学意义(P=0.000)。联苯胺蓝染色细胞阳性率14.67%,GPA表达率19.38%,与转染空载体组比较差异也有统计学意义(P=0.005)。结论 SHP1能有效地诱导K562细胞凋亡与红系分化。     

Bcl-2shRNA表达载体的构建及其对HL-60细胞生长的抑制作用

目的构建Bcl-2短发夹样RNA（short hairpin RNA，shRNA）序列的表达载体并研究其对HL-60细胞生长的抑制作用。方法化学合成2段编码短发夹RNA序列针对Bcl-2基因66个碱基的寡核苷酸，克隆到Pgenesil-1载体的u6启动子的下游，重组构建RNAi质粒，同时设立阴性对照；然后经酶切电泳和DNA测序鉴定。采用脂质体介导的转染方法将重组的RNAi质粒转入HL-60细胞后，采用RT-PCR检测Bcl-2mRNA表达水平；采用MTT法测定细胞增殖情况。结果重组构建的两个Bcl-2 shRNA1、shRNA2载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析，结果表明66个碱基成功插入到预期位点，并且序列完全一致。转染Bcl-2 shRNA1、shRNA2载体分别入HL-60细胞24h，其Bcl-2 mRNA表达水平均降低，但转染Bcl-2 shRNA1引起的Bcl-2 mRNA表达下降更为明显，分别与转染阴性shKNA及未转染组比较，有显著性差异（P〈0.05）。MTT测定显示转染Bcl-2 shRNA1、shRNA2载体入HL-60细胞在72、96h细胞生长明显受到抑制，分别与转染阴性shRNA、单纯脂质体组及未转染组比较，差异有显著性（P〈0.05）。结论成功地构建了两个Bcl-2 shRNA1、shRNA2表达载体，且Bcl-2 shRNA可序列特异性地抑制HL-60细胞的生长。     

紫杉醇诱导食管癌细胞凋亡

目的：研究紫杉醇对食管细胞生长抑制及诱导凋亡的作用。方法：应用ＭＴＴ分析法，形态学观察，琼脂糖凝胶电泳，流式细胞术等方法对紫杉醇诱导的食管癌细胞系Ｅｃａ１０９进行了检测和观察。     

Effect of WT1 gene expression on cell growth and proliferation in myeloid leukemia cell lines

Ｗｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒ（ＷＴ１）ｇｅｎｅｉｓａｔｕｍｏｒｓｕｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎＷｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒｐａｔｉｅｎｔｓＩｔｉｓｌｏｃａｔｅｄｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１１ｐ１３１　ＴｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆＷＴ１ｇｅｎｅｉｓａｂｏｕｔ５０ＫｂＴｈｅｒｅａｒｅ２ｓｐｌｉｃｉｎｇｅｘｏｎｓｏｕｔｏｆｉｔｓ１０ｅｘｏｎｓ：ｅｘｏｎ５（ｓｐｌｉｃｅⅠ）ａｎｄｅｘｏｎ９（ｓｐｌｉｃｅⅡ）Ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｔｗｏａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｅｓｒｅｓｕｌｔｓｉｎｆｏ…     

大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体的构建与鉴定

目的以真核表达载体单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)质粒型载体(pHSV)作为表达载体,构建大鼠MeCP2基因反义表达载体.方法用PCR方法扩增出大鼠MeCP2 cDNA部分片段,将其反向插入表达载体pHSV,并以PCR、酶切电泳以及DNA测序等方法对重组质粒进行鉴定.结果经过PCR、酶切电泳以及DNA测序,鉴定出连接方向和插入序列正确的反义表达载体.结论成功构建了大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体,为进一步研究该基因的功能打下了基础.     

人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定

目的：研究反义封闭ppGalNAc-T2基因表达对胃癌细胞GC7901细胞增殖以及肿瘤细胞生物学行为的影响,构建反义表达载体并转染胃癌细胞GC7901。方法：在对几种肿瘤细胞的ppGalNAc-T2基因的表达水平分析后,以高表达ppGalNAc-T2的人胃癌细胞GC7901的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增两段不同长度ppGalNAc-T2基因片段,构建反义表达载体并转染胃癌细胞GC7901,通过G418筛选,建立一系列旨在封闭胃癌细胞GC7901细胞pp-GaINAc-T2基因表达的亚细胞克隆。通过荧光显微镜、RT-PCR技术手段检测封闭反义ppGalNAc-T2基因RNA表达。结果：ppGalNAc-T2反义表达质粒载体pEGFP-FDT2和pEGFP-FXT2经限制性酶切及部分序列分析证明基因已正确插入载体中,荧光显微镜及RT-PCR显示转染成功。结论：成功构建了ppGalNAc-T2反义表达质粒载体,反义封闭pp-GaINAc-T2基因表达后,胃癌细胞GC7901ppGalNAc-T2的含量明显降低,为进一步研究ppGalNAc-T2奠定了基础。     

人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的:构建人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体。方法:以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT-PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a(+)中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果:PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5.9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA(Genbank序列号)序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a(+)中。结论:成功构建了pET28a-TAT-survivin重组原核表达载体。     

狼疮鼠淋巴细胞IgG2aVH区反义RNA重组体的构建及鉴定

目的 :构建系统性红斑狼疮 (SLE)鼠模型 (NZW×NZB)F1淋巴细胞IgG2aVH 区反义RNA表达重组体 ,为SLE基因治疗提供基础。方法 :采用逆转录—PCR技术克隆狼疮鼠淋巴细胞IgG2aVH 区cDNA ,经T/A克隆再定向插入表达载体pcDNA3.1,并经酶切电泳 ,PCR ,DNA测序鉴定分析。结果 :经鉴定 ,证明成功构建了表达狼疮鼠淋巴细胞IgG2aVH 区的重组体。结论 :BWF1和鼠淋巴细胞中存在IgG2aVH 区 ,其表达型重组体可用于IgG2aVH 的大量复制。     

人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的：构建人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体。方法：以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT--PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a（＋）中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果：PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a—TAT—survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5．9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA（Genbank序列号）序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a（＋）中。结论：成功构建了pET28a—TAT—survivin重组原核表达载体。     

Induction of apoptosis and inhibition of proliferation in Hep-2 by antisense survivin RNA in vitro

Objective.. To study induction of apoptosis and inhibition of proliferation in Hep-2 by antisense survivin RNA. Methods： Antisense survivin RNA expression vector was constructed and then was transfected to human laryngeal carcinoma cell line Hep-2 by lipofectamine. HpEGFP/survivin cells （transfected with the combinant of antisense survivin RNA） were obstained by using G418. The levels of survivin protein before and after transfection were determined by Western-blot. Proliferation activity was measured by MTT assay. The experiment of colony formation in soft agar was carried out for assessing ability of proliferation of Hep-2 cell. Apoptosis was assessed by flow cytometry and acrdine orange（AO）. Results： After antisense survivin RNA plasmids were transfected, the level of survivin protein was inhibited in Hep-2. Compared with control, proliferation of HpEGFP/survivin cells were suppressed significantly. The experiment of colony formation in soft agar showed the ability of colony formation decreased in HpEGFP/survivin cells compared to control （P〈0.05）. Apoptosis rate increased about 1.81-folds compared with control. Conclusion.. The antisense survivin RNA can partly inhibit the level of surviivin protein expression in Hep-2 and can induce apoptosis and inhibit the proliferation of Hep-2 by down-regulating the expression of endogenous survivin in vitro.     

Potentiation of arsenic trioxide-induced apoptosis by retinoic acid in retinoic acid sensitive and resistant HL-60 myeloid leukemia cells

Objective To study the effect of arsenic trioxide (As(2)O(3)) on non-APL acute myeloid leukemia (AML) cells and the interreactive effect between retinoic acid (RA) and As(2)O(3).Methods RA-sensitive (S) and RA-resistant (R) HL-60 non-APL AML cells were used as an in vitro model. Cell number and trypan blue were used to observe cell growth and survival. Apoptosis was determined by morphological changes, using a DNA laddering assay, terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) fragment end labeling assay and a flow cytometry assay. Results As(2)O(3) induced apoptosis in both HL-60S and HL-60R cells, As(2)O(3)-induced apoptosis was both time- and concentration-dependent in a therapeutically-achievable As(2)O(3) range (0.25-4.0 μmol/L). Both all-trans retinoic acid (ATRA) and 9-cis retinoic acid (9cRA) potentiated As(2)O(3)-induced apoptosis, as measured by quantitative TdT fragment end labeling and flow cytometry assays in both HL-60S and HL-60R cells (P&lt;0 .05, for all RA+As(2)O(3) combinations vs As(2)O(3) alone in both sublines). Conclusions As(2)O(3) may inhibit the growth of non-APL AML cells by promoting programmed cell death. RA can potentiate As(2)O(3)-induced apoptosis even in RA-resistant HL-60 cells in which the classical ATRA response pathway is repressed owing to a homozygous inactivating mutation in the retinoic acid receptor α. As[2]O[3] can have clinical activity in non-APL cases of AML and the enhanced activity might result from the combined As(2)O(3)-RA therapy.