半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2相关新基因Rcet3的克隆

目的 利用NCBI中的DDD(数字差异显示)数据库及RT-PCR技术克隆睾丸等组织中特异表达的新基因.方法 利用NCBI中的DDD数据库首先电子克隆了Rcet3基因,并从成年小鼠睾丸组织中利用RT-PCR克隆出Rcet3全长基因,然后测序及序列分析.结果 序列分析显示,Rcet3基因全长cDNA为610bp,含4个外显子,编码一个140个氨基酸残基的蛋白,该蛋白含一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域,但缺少半胱氨酸蛋白酶抑制剂关键的作用位点,而这些位点对半胱氨酸蛋白水解酶的抑制作用足重要的.Rcet3在成年老鼠睾丸、附睾和大脑等生殖域中特异表达,睾丸中的表达高于附睾和大脑,Rcet3与半胱氨酸蛋白酶抑制家族2的Cres亚家族具有相似的特征.结论 Rcet3可能是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2,Cres亚家族中的一个新成员.     

人Smac基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

目的分析线粒体促凋亡蛋白(Smac)基因启动子区结合蛋白,预测其转录调控因子。方法从基因参考序列数据库获取Smac基因启动子区序列,使用TFSEARCH程序对启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。结果成功获得了长度为2 kb的人Smac基因启动子区序列。该启动子区Threshold score≥90的共有71个转录因子结合位点,涉及STAT家族、bZIP家族、叉头蛋白家族、锌指蛋白Kruppel家族、POU家族、runt家族、MYB家族、GATA结合蛋白家族、SOX家族、同源异型框基因家族10个家族的转录因子和1个TATA box。结论 Smac表达的调控是在一定时间或空间上、一种或多种调节蛋白作用的复杂过程。调控Smac的转录因子绝大部分与胚胎发育、性别决定、个体生长密切相关。     

人睾丸细胞中一种新的辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶mRNA剪接变体

目的:研究辅酶II依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)在生殖细胞中的剪接亚型,并对表达蛋白进行预测分析。方法:用快速cDNA末端扩增法从人睾丸细胞株(Hs 181.Tes)中克隆NRDR全长cDNA序列;对获得的序列进行生物信息学分析,通过查找开放阅读框架(ORF),预测并分析剪接新亚型的蛋白质序列和功能:从Hs 181.Tes中克隆了一种新的全长1 164bp的cDNA片段,序列分析表明其属于NRDR缺失4、5外显子的截短剪接体,其ORF可编码237个氨基酸,拥有短链醇脱氢酶家族的保守模序和过氧化物体定位信号。结论:NRDR在不同细胞的基因转录表达调控具有选择性差异,进而表达不同蛋白,构成SDR家族,该新亚型可能参与生殖系统相关酶类的代谢,控制生殖细胞增殖分化。     

大鼠睾丸中SNPH基因表达分析的研究

目的 观察大鼠睾丸不同发育阶段SNPH基因的mRNA表达水平及蛋白分布情况,研究在精子发生中该基因所起的作用,同时也观察SNPH基因在不同组织的蛋白表达水平。方法 提取大鼠中脂肪、心脏、睾丸、脑组织中的蛋白,观察SNPH基因在各组织的表达水平。取出生后21个时间点的大鼠睾丸组织,每个时间点取三只,从中提取总RNA并逆转录成cDNA,借助RT-PCR技术检测SNPH基因的转录表达水平。免疫组化分析65日龄的睾丸组织,观察SNPH蛋白的表达分布情况。结果 SNPH蛋白在脑组织表达最高,其次是睾丸、脂肪,在心肌中表达最少;SNPH基因mRNA表达在第2-31天表达量少,基本不表达,从第35天开始逐渐增加,第45天表达急剧增加,到第65天转录表达最高;SNPH基因在65日龄睾丸生精小管中的精子细胞有阳性表达。结论 SNPH蛋白在脂肪、睾丸、脑、心肌中都有表达。在大鼠睾丸组织发育的后期,SNPH基因的转录表达逐渐升高,因此该基因可能参与精子成熟,且主要在精子细胞中表达。     

尤文肉瘤EWS—FLI1与特异序列结合并调节表达的研究

95％的尤文肉瘤家族（Ewing family of tumor，EFT）具有特异的EWS—FLI1融合基因。EWS—FLI1是一个比正常的FLI1强多许多倍的转录因子，并且可以与特异ACCGGAAGT基因序列结合。把该特异性结合序列插入到荧光素酶报告基因载体（pGL3-Promoter，promega公司）中，构建了新表达载体pS2。我们用脂质体法转染pS2到尤文肉瘤细胞系（RD—ES、SK—ES）及对照细胞系（NIH3T3、Hela），然后进行荧光定量检测，检测各组细胞系相对荧光强度。结果证实尤文肉瘤的EWS—FLI1确实能够与该特异序列结合并促进下游虫荧光素酶基因的高表达。     

一个含有25bp内含子的阴道毛滴虫Rabl-like新基因

目的 克隆和鉴定一个新的阴道毛滴虫Rabl-like基因（TvRabl-like）及其内含子。方法 我们从一阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离出一个cDNA克隆,它与各物种的Rab家族蛋白有较高的同源性,因此我们进一步用BLASTP、RPS-BLAST、ClustalW和MEGA3等分析软件对该cDNA克隆进行了序列分析和进化树分析;用PCR和RT-PCR等技术分别对该基因组和mRNA进行了扩增和测序分析。结果 序列分析结果表明该eDNA克隆长705bp,开放阅读框具603bp,推测肽链含有200个氨基酸。序列比较分析结果提示该cDNA克隆所推测的蛋白质是一个Rabl亚家族的亚型。进化树分析也表明它属于阴道毛滴虫Rabl亚家族。基因组PCR扩增和测序分析表明该基因包含一个25bp的内含子,该内含子具有阴道毛滴虫和其它真核生物较大内含子所具备的典型的5’GT-AG-3’和分支位点基序。RT-PCR产物及其测序分析表明在该基因的转录本中存在着未剪切和剪切后的mRNA,说明确实有内含子的存在。结论 TvRabl-like基因属于阴道毛滴虫Rabl亚家族,该基因含有一个25bp的内含子。该内含子是至今发现的最小的阴道毛滴虫基因内含子之一,很可能也是真核生物中最小的内含子。对诸类最低等真核生物内含子的研究将有助于我们理解真核生物内含子的起源和进化。     

ZBTB5基因及其表达特征的初步研究

目的了解ZBTB5基因的序列和表达特征。方法运用生物信息学方法分析该基因的序列特征和染色体定位,分子生物学方法分析其表达特征和亚细胞定位。结果ZBTB5基因的N末端含一个BTB结构域,C末端含2个C2H2锌指结构域;根据人类基因组序列数据库搜索,将ZBTB5基因定位在人类基因组第9染色体上。Northern杂交结果表明,ZBTB5基因在不同组织中表达差异明显。免疫胶体金技术显示该蛋白定位于细胞核。结论该基因可能是一个转录因子。     

ZB TB 32生物学功能的研究进展

锌指蛋白家族是真核生物中重要的转录因子家族之一,参与调控多种生物学功能,其包含多个亚家族。ZBTB（zinc finger and BTB domain‐containing protein）属于其中的 POK （POZ and Krüppel）蛋白家族。该亚家族成员在 N 末端有一个B T B／POZ （Broad‐complex ,Tramtrack ,Bric‐a‐brac／Pocvirus and zinc fingers ）结构域,在哺乳动物中高度保守,主要介导蛋白与蛋白之间的相互作用。C末端有数个C2H2锌指结构域,介导蛋白与DNA 序列间的识别以此来发挥转录调节作用,3％的人类基因通过C2H2结构介导转录调节［1‐3］。ZBTB亚家族成员通常作为转录抑制子调节基因表达,该家族成员的生物学功能一直受到广泛关注与研究。     

利用电子差异展示方法克隆人类睾丸特异性新基因

目的 克隆一个新的人睾丸特异性基因.方法 运用电子差异展示方法筛选人类睾丸特异表达新基因,获得有差异显示的代表新基因的克隆重叠群,挑选其中一个克隆重叠群Hs.180197进行多组织RT-PCR验证该重叠群在人睾丸中的表达.然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发,采用生物信息学方法克隆一个人类新基因的全长eDNA序列.结果 新基因全长1197 bp,开放阅读框为504～806 bp,定位于6p21.1-p21.2.编码由100个氨基酸组成,相对分子质量为10 000,等电点为6.81的一个蛋白,该蛋白与已知蛋白无同源性.克隆实验验证该基因阅读框完全正确,推测其可能与精子生成相关,暂命名为TDRGI(restis development related gene 1),GenBank登录号为DQ168992.结论 电子差异展示方法与实验验证相结合用于发现人类功能新基因足行之有效的.     

一个含有25 bp内含子的阴道毛滴虫Rab1-like新基因

目的 克隆和鉴定一个新的阴道毛滴虫Rab1-like基因(TvRab1-like)及其内含子.方法 我们从一阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离出一个cDNA克隆,它与各物种的Rab家族蛋白有较高的同源性,因此我们进一步用BLASTP、RPS-BLAST、ClustalW和MEGA3等分析软件对该cDNA克隆进行了序列分析和进化树分析;用PCR和RT-PCR等技术分别对该基因组和mRNA进行了扩增和测序分析.结果 序列分析结果表明该cDNA克隆长705 bp,开放阅读框具603 bp,推测肽链含有200个氨基酸.序列比较分析结果提示该cDNA克隆所推测的蛋白质是一个Rab1亚家族的亚型.进化树分析也表明它属于阴道毛滴虫Rab1亚家族.基因组PCR扩增和测序分析表明该基因包含一个25 bp的内含子,该内含子具有阴道毛滴虫和其它真核生物较大内含子所具备的典型的5'GT-AG-3'和分支位点基序.RT-PCR产物及其测序分析表明在该基因的转录本中存在着未剪切和剪切后的mRNA,说明确实有内含子的存在.结论 TvRab1-like基因属于阴道毛滴虫Rab1亚家族,该基因含有一个25 bp的内含子.该内含子是至今发现的最小的阴道毛滴虫基因内含子之一,很可能也是真核生物中最小的内含子.对诸类最低等真核生物内含子的研究将有助于我们理解真核生物内含子的起源和进化.     

一个新的基因转录本的克隆及序列分析

目的：筛选与精子发生和(或)睾丸发育相关的基因。方法：将不同发育阶段(胚胎和成人)的睾丸组织cDNA探针与人睾丸cDNA芯片进行杂交，通过杂交信号的比较，筛选出差异表达的基因。结果与结论：经测序发现该基因全长1316bp，包含1个1056bp的开放阅读框，编码351个氨基酸。生物信息学序列分析表明，它是p44S10基因家族的一条新的转录本基因，该基因的氨基酸序列编码一26S蛋白酶体调控亚基，在进化中高度保守，提示了该基因在生物体中的重要作用。     

人亲磷脂酸磷脂酶A1基因的克隆与序列分析及真核表达载体的构建

目的 克隆人亲磷脂酸磷脂酶A1(PA-PLA1)基因,分析该酶基因及其蛋白质的序列特征并构建PA-PLA1基因真核表达载体,为该酶生理功能的研究提供实验依据.方法 从人的肾脏组织中提取总RNA,逆转录制备cDNA.扩增人PA-PLA1基因并克隆测序.以Vector NTI 8.0、DNASTAR、ORF finder分析所克隆的人PA-PLA1基因及其蛋白质序列.构建真核表达载体pcDNA3.1-PA-PLA1,测序证实后转染小鼠分泌胰岛素细胞株MIN6,以Western blotting检测PA-PLA1蛋白的表达水平.结果 人PA-PLA1基因mRNA全长为2 923 bp,编码区长2 238 bp,编码1个由745个氨基酸残基组成的蛋白多肽.序列比对表明所克隆的人PA-PLA1基因与牛PA-PLA1基因同源,并与KIAA0725p和p125基因高度相似,三者在脂肪酶家族中形成亚家族,但KIAA0725p蛋白和p125蛋白具有常见的脂肪酶活性中心保守序列GX-S-XG,而PA-PLA1的该序列为SX-S-XG.真核表达载体pcDNA3.1-PA-PLA1构建正确并在所转染的MIN6细胞中过表达PA-PLA1蛋白.结论 PA-PLA1、KIAA0725p蛋白和p125蛋白在脂肪酶家族中形成亚家族,但PA-PLA1具有独特的脂肪酶活性中心保守序列SX-S-XG.所构建的PA-PLA1基因真核表达载体能在MIN6细胞中过表达小鼠PA-PLA1蛋白.该研究结果将为PA-PLA1生理功能的研究提供实验依据.     

StAR基因探针的制备及应激状态下小鼠睾丸间质细胞StAR基因的表达分析

目的 制备类固醇快速调节蛋白基因(StAR)探针,观察应激状态下StAR基因在小鼠睾丸间质细胞的表达变化.方法 提取C57BL/6小鼠睾丸总RNA, 并以此为模板,通过逆转录PCR获得StAR基因片断,运用T/A克隆策略, 将扩增的StAR基因片断重组于pCR2.1-POPO 载体,经过双酶切和DNA序列鉴定后,体外转录制备地高辛标记的StAR cRNA探针.采用限制活动制备应激状态小鼠模型(实验组),运用原位杂交的方法 分析实验组和正常对照组睾丸间质细胞的StAR mRNA表达水平. 结果 成功制备StAR基因探针,实验组睾丸间质细胞的StAR mRNA 的水平较对照组明显下降(P<0.05).结论 应激状态可下调睾丸间质细胞中StAR基因的表达,从而最终使雄激素水平降低.     

HIV-I编码病毒蛋白R基因在真核细胞中的表达及其表达蛋白对KSHV溶解性周期复制的影响

目的:构建含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)编码病毒蛋白R(Vpr)基因的重组真核表达质粒并初步探索Vpr基因编码蛋白对卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)溶解性周期复制的影响.方法:构建pVpr-Flag重组质粒并进行酶切鉴定和序列测定;将pVpr-Flag重组质粒临时转染BCBL-1和NIH3T3细胞,采用RT-PCR、IFA和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Vpr基因的表达情况:提取临时转染pVpr-Flag重组质粒的BCBL-1细胞总RNA,进行RT-PCR检测KSHV次要衣壳蛋白编码基因ORF26(仅在病毒裂解期表达)mRNA转录水平,初步探索HIV-1 Vpr基因编码蛋白对KSHV复制的影响.结果:克隆的Vpr基因序列与GenBank中已登记的Vpr序列100%同源.RT-PCR、IFA和Western blot结果显示Vpr基因mRNA及其编码蛋白在真核细胞中得到了转录和表达.RT-PCR结果进一步显示,Vpr基因编码蛋白能够降低KSHVORF26mRNA转录水平.结论:成功构建含Vpr基因序列的重组质粒并在真核细胞中获得正确表达:初步探索表明Vpr蛋白能够抑制KSHV溶解性周期复制.     

p53凋亡刺激蛋白抑制因子的研究进展

p53凋亡刺激蛋白抑制因子(inhibitory member of the ASPP family,iASPP),属于ASPP蛋白家族的一员,人类的iASPP由PPP1R13L基因编码合成。iASPP与同一家族的ASPP1、ASPP2功能相反,能够特异性抑制野生型p53的诱导目的基因转录活化和促细胞凋亡功能,导致肿瘤的发生,在乳腺癌和急性白血病中高表达,因此被认为是一种新的癌蛋白,本文就近年来iASPP基因的研究进展简要综述。     

版纳微型猪近交系TDRP1基因克隆、鉴定及mRNA的组织表达特性

目的 克隆版纳微型猪近交系(BMI)不育和可育公猪TDRP1基因,分析其序列及mRNA表达水平上的差异,预测其蛋白质功能,并检测该基因在可育公猪中的组织表达分布情况.方法 以猪NM_001198925序列为模板,设计特异引物,采用RT-PCR方法结合测序获得TDRP1的cDNA序列并进行生物信息学分析;采用半定量PCR方法检测TDRP1在不育和可育公猪睾丸中的表达规律,分析该基因在可育公猪17种组织中的表达特征.结果 获得了BMI TDRP1基因的编码区序列(GenBank登录号:KJ186786),生物信息学分析表明其编码186个氨基酸,蛋白质相对分子质量(Mw)为20.49 ×10³,等电点(pI)为5.86,无信号肽,有94.1%的概率位于细胞核,含有1个亮氨酸富集的核输出信号.不同物种的氨基酸序列比对表明猪TDRP1与人、恒河猴、小鼠和大鼠等哺乳动物的TDRP1相似性在73%～83.2%之间,其中与人、恒河猴的相似性较高.mRNA表达分析表明,TDRP1在BMI不育和可育公猪睾丸间表达水平差异无显著,在精囊腺和前列腺中高表达,在睾丸和小脑中中度表达,在大脑和肾脏中低表达,在其余组织中不表达.结论 成功克隆了BMI TDRP1基因的全长编码区序列并发现了BMI特有的2个SNP位点;TDRP1基因在BMI不育和可育公猪间序列完全一致,睾丸mRNA表达水平差异无显著性,多组织转录谱分析表明该基因存在明显的组织差异表达现象,在精囊腺和前列腺中有较高表达量,为深入研究TDRP1基因在精子发生方面的作用奠定了基础.     

血清反应因子在心血管疾病中的作用

血清反应因子（serum response factor,SRF）属于MADS转录因子家族的成员之一,是高度保守且广泛表达的转录因子。SRF在成年或发育期的心肌组织中均有表达,主要与下游靶基因启动子上特定DNA序列CArG盒[血清反应元件（SRE）的组成部分,CC（A/T）6GG box]结合,调控抗凋亡或促细胞增殖等基因（如IEGs：c-fos、mcl-1、Egr-1）的表达,对外界因素（如：缺血、缺氧等）刺激表现出快速的基因响应,影响心肌细胞的发育、分化、增殖及凋亡[1-2]。许多辅助转录调节因子蛋白（co-activator/co-repressor,如TCF家族成员Elk-1和MRTFs家族等）与SRF/SRE发生相互作用,激活与心肌分化、增殖及凋亡相关基因的转录。因此,对SRF-CArG box依赖基因转录的调控,是影响心肌凋亡/生存的关键因素之一[3]。另外,研究表明skeletal a-actin、b-MHC、car原diac a-actin、MLC-2v、dystrophin等收缩类蛋白[4-6]及非收缩类蛋白,诸如参与心脏功能的ANF、肌质网Ca-ATPase（SERCA2）、Na+/Ca2+交换离子通道 NCX1[7-8]均为SRF依赖的基因。由此可见,SRF在调控收缩蛋白基因和收缩功能器官的重要作用充分说明SRF在心脏功能中发挥着重要的调控作用。     

肝癌细胞株中肿瘤特异性抗原GAGE基因mRNA的表达

目的:研究肿瘤特异性抗原GAGE基因mRNA在BEL-7404肝癌细胞株中的表达情况,评价其作为分子肿瘤标记以及肿瘤免疫治疗特异性靶位的可能性。方法:运用RT-PCR技术检测国内建株的肝癌细胞株BEL-7404中GAGE基因mRNA的表达,并与正常肝组织比较。结果:肝癌细胞株BEL-7404中GAGE基因呈阳性表达,正常肝组织中GAGE基因表达阴性。结论:GAGE基因可作为肝癌诊断的分子标记,并具有作为肝癌免疫治疗特异性靶位的潜在价值。     

Prss37基因转录起始位点的确定及其转录调控的初步探讨

目的 确定Prss37基因的转录起始位点,并利用转基因技术在整体水平验证该启动子的组织特异性.方法 运用cDNA 5'末端快速扩增法(5' RACE)对C57BL/6J小鼠睾丸mRNA进行分析,确定Prss37的转录起始位点;构建Prss37内源启动子区域转录起始位点上游不同长度DNA片段(1 kb、2 kb、4 kb)驱动的荧光素酶基因表达的质粒;通过受精卵雄原核显微注射技术获得上述三种启动子驱动荧光素酶基因表达的转基因小鼠;利用活体成像技术观察荧光素酶基因的表达,明确启动子的组织特异性.结果 Prss37基因的转录起始位点位于NCBI GeneBankTM(NM_026317.2)报道序列上游的40 bp处;成功获得三种转基因小鼠,其中1kb启动子驱动的转基因小鼠检测到荧光素酶基因的表达,且在脑、睾丸和附睾组织中的表达较强.结论 明确Prss37的转录起始位点,成功获得了睾丸和附睾表达荧光素酶基因的转基因小鼠,为进一步的Prss37基因转录调控研究奠定了基础.     

肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析

目的: 获取肝癌相关基因(hepatoma associated gene,HTA)的mRNA分子全长序列并对其可变剪接进行分析,检测其转录本在各肝癌细胞系中的表达,为进一步研究该基因在肝癌发生、发展中的作用奠定基础。方法: 用3'RACE 和5'RACE方法扩增HTA基因的全长序列并对其序列信息和可变剪接进行扩增和测序分析,用Northern印迹检测该基因转录本在不同肝癌和正常肝细胞系中的表达。结果: HTA基因全长序列为1414 bp,经分析该序列包含3个外显子,2个内含子,其中2号内含子在可变剪接中被作为外显子表达。Northern印迹显示HTA基因1.7 kb转录本和1.4 kb转录本均表达于恶性肝癌细胞系,而不表达于正常细胞系。结论: 成功获得了HTA基因的全长序列并对其可变剪接进行了分析,2个大小不同的转录本均在肝癌细胞系中特异性表达,作为一个肝癌相关基因值得进一步深入研究。