欧洲花楸细胞悬浮培养生长动力学研究△

目的:探讨欧洲花楸悬浮细胞生长规律和动力学参数.方法:测定欧洲花楸悬浮细胞生物量及细胞悬浮液pH值变化;利用细胞鲜重和干重值对欧洲花楸悬浮细胞生长曲线进行拟合,用数学建模模拟欧洲花楸悬浮细胞增殖情况,并对拟合函数求一阶、二阶导数,求算欧洲花楸悬浮细胞生长速率及生长加速度.结果:欧洲花楸悬浮细胞液的pH值随培养时间增加而越来越大,培养时间到16 d,pH ＞6,不再适宜细胞生长;Logistic模型能够描述欧洲花楸悬浮细胞生长曲线变化.培养第5d时细胞增长加速度达到最大,在8d时生长速率达到最大,结论:欧洲花楸悬浮细胞生长函数符合logistic曲线,函数为f(x)=0.369 9/(1+10.77e-0.329 2x),细胞在14 d时进入增长平台期,在细胞生长至第5d时可进行诱导子处理.     

罗汉果细胞悬浮培养体系的建立与优化

目的:研究6-BA,萘乙酸(NAA),碳源,pH对罗汉果悬浮培养细胞生长的影响,探讨罗汉果细胞悬浮培养的最适条件.方法:考察1个培养周期内罗汉果悬浮细胞的鲜重和干重,绘制生长曲线和生长速率曲线;采用正交试验设计对6-BA,NAA,碳源,pH 4因素3水平的组合进行优化.结果:罗汉果悬浮细胞培养的生长周期约为21 d,0～6 d为细胞的延滞期,7～21 d为对数期,稳定期较短,第22天进入到衰亡期,在第21天时细胞鲜、干质量达到最大,分别为693.0,416.0 g、L-1,最大生长速率为0.040 g·L-1·d-1.NAA是影响罗汉果悬浮细胞生长的关键因素,其影响效应依次为NAA＞6-BA＞pH＞碳源.悬浮细胞生长的适宜培养基为MS+1.0 mg·L-1 6-BA +0.02 mg·L-1 NAA,4.0％蔗糖为碳源,初始培养基pH5.5～6.0.结论:通过组织培养方式可以成功建立罗汉果细胞悬浮培养体系.     

新疆紫草2种悬浮细胞生长及紫草素类化合物积累的动力学研究

通过对新疆紫草Arnebia euchroma红白2种色系悬浮细胞的表型、生长曲线、次生代谢产物积累研究,用数学建模模拟新疆悬浮细胞的增殖和紫草素类化合物积累情况,研究新疆紫草悬浮细胞生长和次生代谢生产的动力学参数,发现红色高产系为针对紫草素类次生代谢产物生产的优良细胞株系,白色低产系可能为突变株系.用Logistic模型对生长函数进行拟合并求导数,得到新疆紫草悬浮细胞的生长速率及生长加速度变化曲线,确定了新疆紫草悬浮细胞继代培养最佳时期为继代到新鲜培养基中的第15天,给诱导处理的最佳时期为继代到新鲜培养基中后第13 ～14天.并且通过比较新疆紫草红色系细胞增长速率的变化趋势与紫草素类化合物积累曲线发现,新疆紫草悬浮7细胞红色系生物量快速增长时不利于紫草素的合成与积累.     

罗汉果悬浮培养细胞的生长和罗汉果甜苷积累的动力学研究

目的:研究罗汉果悬浮细胞生长、罗汉果甜苷积累的动力学特征,为培养过程的优化控制提供理论依据。方法:考察1个培养周期内罗汉果悬浮细胞的鲜量重、干质量和罗汉果甜苷的含量,绘制生长曲线和生长速率曲线。结果:罗汉果悬浮细胞培养的生长周期约为21 d,0～6 d为细胞的延滞期,7～21 d为对数期,稳定期较短,第22天进入到衰亡期,在第21天时细胞鲜、干质量达到最大,分别为693.0,416.0 g.L-1,最大生长速率为0.040 g.L-1.d-1。罗汉果总苷和甜苷V从第7天开始快速积累,第21天达到最大值,生长速率分别为0.032 8,0.054 7 g.L-1.d-1。结论:联合研究细胞生长和产物积累,可以明确产物积累的动态变化规律,为培养过程的优化、代谢产物的调控和大规模的工业化生产提供实验依据。     

欧洲花楸悬浮细胞对生物胁迫的记忆功能初探

植物对其所遭受的环境胁迫存在记忆功能,当再次受到重复的环境胁迫时能更快更好地启动对环境胁迫的应答和适应机制,从而实现长期稳定的繁衍生存。但是这类研究大都体现在农作物以及模式植物拟南芥中,在药用植物中少有研究这种记忆功能对植物生长状态的作用以及对植保素生物合成的影响。该研究采用酵母提取物(YE)作为模拟生物胁迫的诱导子,通过对欧洲花楸悬浮细胞给予重复生物胁迫,测定了重复胁迫及单次胁迫下生物量以及部分次生代谢产物含量的变化。结果表明,与第一次受到环境胁迫的欧洲花楸悬浮细胞相比,受到重复胁迫的欧洲花楸悬浮细胞在再次受到环境胁迫后生物量积累水平在部分时间点下显著提高,次生代谢产物在部分时间点下积累水平也显著升高。上述工作确定了欧洲花楸悬浮细胞存在记忆环境胁迫的现象,以及这种记忆环境胁迫的现象对欧洲花楸悬浮细胞部分次生代谢产物合成与积累的影响,为进一步研究药用植物的胁迫记忆功能及其代际遗传机制奠定了基础。     

喜树胚轴细胞悬浮培养的优化和喜树碱的积累

目的优化喜树胚轴细胞悬浮培养体系生产喜树碱。方法将由喜树种子下胚轴诱导的愈伤组织进行悬浮培养,研究了基本培养基、激素和培养条件对培养物生长的影响,测定了培养细胞生长和喜树碱积累的动态变化。结果悬浮培养细胞在M S培养基中细胞生长良好,细胞分散性和喜树碱积累优于在其他培养基中。最佳激素组合为2,4-D 0.2 m g/L NAA 0.5 m g/L 6-BA 0.5 m g/L,细胞继代周期以12 d左右为宜,悬浮细胞适合在22~26℃,120 r/m in下生长。悬浮培养细胞在第4~20天为对数生长期,细胞倍增时间为t(d)=3.92-d 1,细胞干重至第20天达到最大,为27.44 g/L。在细胞对数生长期内,喜树碱积累与细胞生长呈线形正相关性,第20天喜树碱质量分数达到最大值9.319×10-5,喜树碱产量为2.56 m g/L。结论M S基本培养基适合喜树胚轴细胞悬浮培养,细胞生长前20天内,培养体系中喜树碱积累与细胞生长呈正线形相关性。     

酵母提取物诱导欧洲花楸悬浮细胞合成次生代谢产物的机制探究

以欧洲花楸悬浮培养细胞（SASC）为材料,检测酵母提取物（YE）处理后SASC生理生化指标的变化,初步探究YE诱导SASC合成次生代谢产物的机制。结果表明： YE诱导SASC合成了5种联苯类化合物,且5种化合物含量随诱导时间的延长呈现不同的变化规律;YE处理抑制细胞的生长;细胞培养液中的pH随着处理时间的延长逐渐降低;细胞中的可溶性蛋白质含量表现为缓慢下降的变化趋势,YE处理组（YE组）可溶性蛋白质含量与对照组（CK组）相比显著增加,最高时相对增量达到了147.76%;CK组和YE组细胞外Ca²⁺都表现为内流,但YE组的内流明显小于CK组。说明YE诱导使细胞处于一种胁迫状态,不利于细胞的生长,迫使细胞合成了联苯类化合物抵御外界胁迫;细胞内可溶性蛋白可能作为酶类参与调控化合物的合成;Ca²⁺信号分子可能介导细胞应对YE胁迫的信号转导。     

人肾小管上皮细胞HK-2的培养及生长曲线测定

目的 :通过细胞计数法绘制人肾小管上皮细胞株HK-2细胞的生长曲线,了解HK-2细胞的生长特性,为相关实验研究提供参考。 方法 :将HK-2 细胞用含 10 % 胎牛血清的 DMEM / F12(1 ∶1)培养基培养,每隔24 h在倒置显微镜下观察细胞生长范围,并进行计数,连续观察7 d后,以存活细胞数(万／mL)对培养时间(h或d)作图,即得生长曲线。 结果 :细胞呈立方形铺路石样贴壁生长,细胞间连接紧密。细胞数目在培养第2 d开始增加,但在第1~3 d增加缓慢,第3~6 d 细胞数目急剧增加,并进入指数生长期,在第6 d时细胞达到饱和密度(100%),在第7 d时细胞数目显著下降。 结论 :在1~3 d细胞生长处在潜伏期,3~6 d细胞进入大量分裂的指数生长期,第6 d达到饱和后,细胞生长则进入衰退期。     

欧洲花楸及其悬浮细胞在植物抗逆性研究中的应用

欧洲花楸原产欧洲,为蔷薇科苹果亚科花楸属落叶乔木,是集药用、食用、园林和生态等价值于一身的珍贵树种,目前在我国部分地区已成功引种。欧洲花楸能够抵抗早霜、晚霜、低温、干旱、酸沉降等多种灾害。当其受到病原菌侵害时产生联苯类化合物作为植保素,其抗逆性特点被越来越多的学者所关注。目前已成功构建了欧洲花楸悬浮细胞培养-诱导子处理的系统研究模式,挖掘欧洲花楸的抗逆性特点及应用优势,使欧洲花楸及其悬浮细胞在植物抗逆性研究中能够得到广泛有效利用。     

三叶青松散型和致密型愈伤组织悬浮培养及黄酮积累的比较研究

目的比较三叶青松散型和致密型愈伤组织悬浮培养细胞生长及其次生代谢产物黄酮的积累情况。方法将三叶青叶诱导的愈伤组织在不同外源植物激素种类和配比的培养基上多次继代培养,筛选获得松散型和致密型愈伤组织,分别建立相应悬浮细胞体系,研究了两种悬浮培养细胞生长和总黄酮积累的动态。结果三叶青松散型愈伤组织悬浮培养的继代周期为8 d,增加质量倍数最高达到3.68倍,黄酮积累的最大值11.7 mg/g,较最初接种时的浓度增加34.5%,该悬浮系继代4～5次后生命力衰退且褐化加重;而致密型愈伤组织悬浮培养的继代周期为20 d,增加质量倍数最高达到2.65倍,黄酮积累的最大值40.9 mg/g,较最初接种时的浓度增加212.2%,该悬浮系继代多次细胞无明显变化。结论与松散型愈伤组织悬浮培养相比,致密型愈伤组织悬浮培养更有利于继代培养和次生代谢产物的积累。     

大鼠毛囊干细胞体外培养及基因转染方法

目的：探讨大鼠毛囊干细胞体外培养和基因转染的方法.方法：采用组织块法分离、培养大鼠触须隆突部毛囊干细胞,经Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化后,采用碱性磷酸酶染色和细胞免疫荧光染色进行细胞鉴定,测定细胞生长曲线,并分别采用脂质体和慢病毒质粒进行毛囊干细胞基因转染.结果：经两次Ⅳ型胶原贴壁筛选后,毛囊干细胞呈克隆性生长,具有典型的干细胞生物学特征,碱性磷酸酶染色阳性,角蛋白-15、整合素-α6和整合素-β1表达均为阳性.细胞生长曲线显示毛囊干细胞在接种后第3天时出现干细胞克隆;第5天和第6天时细胞处于对数生长期.脂质体介导的毛囊干细胞基因转染率为1.55％～17.21％,中位数9.63％;慢病毒介导的毛囊干细胞基因转染率为62.14％ ～79.42％,中位数71.52％.结论：采用组织块法分离、培养大鼠触须隆突部毛囊干细胞,经Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化后,毛囊干细胞可保持较好的生长状态和较强的克隆形成能力,且慢病毒介导毛囊干细胞基因转染比脂质体转染更高效、稳定.     

从模型大鼠肺肠功能与组织形态的变化探讨肺与大肠在病理上相互传变的特点

目的:通过观察"肺病"和"肠病"模型大鼠的肺功能、胃肠功能和肺肠组织形态的同步动态变化,探讨肺与大肠在病理上相互传变的特点。方法:建立"肺病"(慢性支气管炎)和"肠病"(溃疡性结肠炎)两种慢性非特异性炎症动物模型,分别选取三个不同的时间点,同步观察各组模型大鼠的肺功能、胃肠功能、肺组织和结肠组织形态的动态变化情况。结果:"肺病"模型和"肠病"模型的肺功能和胃肠功能(胃内残留率、小肠推进率)在各时间点均出现不同程度的减弱(P0.01或P0.05)。"肺病"模型和"肠病"模型各时间点的肺组织均不同程度的出现支气管上皮细胞变性、坏死,炎细胞浸润,结肠组织出现灶性上皮细胞变性、坏死,炎细胞浸润。"肺病"模型在肺部病变加重的同时,肠腑病变同步加重,在模型第50天肠腑组织出现显著病变。"肠病"模型在肠部病变加重的同时,肺脏病变同步加重,在第8天肺脏组织出现显著病变。结论:"肺"与"大肠"之间是否发生传变,主要取决于原病脏腑的病理损伤程度。同时,原病脏腑出现病变的时间越长,则传变越明显。     

以腺嘌呤对慢性肾功能衰竭尿毒症期大鼠造模的方法研究

目的：优选腺嘌呤致大鼠慢性肾功能衰竭（CRF）尿毒症期的实验方法。方法：采用以下两种不同方法造模，造模A组给予2．5％腺嘌呤混悬液，按250mg／kg／d灌胃，连续给药14d，之后改为125mg／kg／d。造模B组给予2．5％腺嘌呤混液，按250mg／kg／d灌胃，第1-14天，每日给药1次，第14天后隔日给药，观察腺嘌呤对各种肾功能指标的影响及肾组织形态学的变化。结果：模型A组、模型B组大鼠血清BUN、SCr、uA浓度等指标均明显上升，模型B组较模型A组高；光镜下观察病理切片显示肾皮质、髓质有不同程度损伤，模型B组损伤程度较重。生化指标及形态组织学观察提示腺嘌呤CRF大鼠模型造模成功，模型B组模型肾皮质、髓质功能中重度损害、酸中毒，符合慢性肾功能衰竭中晚期尿毒症常见生化指标改变。结论：采用2．5％腺嘌呤混悬液，按250mg／kg／d连续灌胃14d后，再隔日给药14d的造模方法较佳。     

血脂康胶囊对db/db小鼠胰岛第一时相分泌及β细胞含量的影响

目的:探讨血脂康胶囊对于db/db小鼠胰岛第一时相分泌及β细胞含量的影响。方法:选择40只12周龄清洁级雄性db/db小鼠,20只同周龄同窝出生的db/m小鼠,为非糖尿病对照组,将db/db小鼠随机分为血脂康组、安慰剂组,分别给予1次/d的血脂康胶囊0.3g/(kg·d)和安慰剂(5%阿拉伯胶)混悬液灌胃;db/m小鼠1次/d灌服同等体积的生理盐水。6周后采用离体胰岛灌流系统评估胰岛第一时相分泌,运用免疫组织化学及胰岛测量学分析胰岛β细胞含量。结果:治疗6周后血脂康组胰岛第一时相分泌得到显著改善,并可显著地减少了胰岛β细胞的丢失。结论:血脂康胶囊具有改善胰岛素第一时相分泌,保护β细胞功能等作用。     

创愈膏对大鼠体表溃疡创面转化生长因子β1的作用

目的：探讨创愈膏在对大鼠溃疡创面愈合不同时间点肉芽组织细胞中转化生长因子（TGF-β1）的含量表达,为进一步验证临床疗效提供实验依据。方法：60只SD大鼠复制成背部感染溃疡创面模型,并随机平均分为创愈膏组、湿润烧伤膏组和生理盐水组,分别外敷创愈膏、湿润烧伤膏和生理盐水纱条换药,并于第3天、第7天、第14天、第21天取创面肉芽组织,用免疫组织化学（SABC）法测量TGF-β1,以阳性细胞数反应其含量变化。结果：第3天、第7天、第14天、第21天,创愈膏组、湿润烧伤膏组肉芽组织TGF-β1均高于生理盐水组（P0.05）;而生理盐水组在同一时间点TGF-β1也达到高峰,但明显低于前两组。各时间点创愈膏组高于湿润烧伤膏组,但两组比较,无显著性差异（P＆gt;0.05）。结论：创愈膏能增加大鼠溃疡创面肉芽组织细胞中TGF-β1的含量,从而促进创面愈合。     

补肾活血方对噪声性听损伤防治作用的实验研究

目的：观察补肾活血中药对豚鼠噪声性听损伤的防治作用。方法：将豚鼠随机分为正常对照组、模型对照组、预防组和治疗组。后3组豚鼠暴露在频率为4kHz强度为110dB SPL的稳态白噪声中6h×6天。预防组和治疗组分别于噪声暴露前7天和噪声暴露结束后给予中药灌胃,预防组同期灌胃相同剂量的生理盐水,正常组不予给药,均连续13天。以听性脑干诱发电位（ABR）评价各组豚鼠听功能的变化;耳蜗基底膜铺片计数比较外毛细胞损伤率;扫描电镜观察耳蜗毛细胞形态学变化;耳蜗螺旋韧带铺片观察血管纹充盈情况。结果：与模型组和治疗组比较,预防组豚鼠的ABR阈值、毛细胞损伤率均明显降低（P〈0.05）,波潜伏期显著缩短（P〈0.01）,电镜下毛细胞受损程度较轻,光镜下血管纹呈轻度缺血;与模型组比较,治疗组豚鼠的ABR阈值明显降低（P〈0.05）,波潜伏期显著缩短（P〈0.01）,但毛细胞损伤率无明显差异（P〉0.05）;电镜下两组毛细胞损伤程度均较重,但光镜下血管纹缺血程度相对较轻。结论：补肾活血方对噪声性听力损伤具有显著的预防作用,在改善听功能方面具有一定的治疗作用,预防效果明显优于治疗效果。     

傣痛消对急性高尿酸血症小鼠血尿酸、血尿素氮的影响

目的:观察傣痛消对高尿酸血症小鼠血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)的影响。方法:通过酵母膏灌胃复制高尿酸血症动物模型,以"傣痛消"、别嘌呤醇干预,检测血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)的水平。结果:傣痛消高、中、低剂量组、别嘌醇组能显著降低小鼠血UA水平均显著低;"傣痛消"中、低剂量组、别嘌醇能明显降低小鼠血BUN浓度。结论:傣痛消对高尿酸血症小鼠具有良好的保护作用。     

脑健胶囊对局灶性脑缺血大鼠脑组织病理形态及血液流变学指标的影响

目的观察脑健胶囊对局灶性脑缺血大鼠脑组织细胞形态及血液流变学指标的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组、脑健胶囊组,每组25只,采用大脑中动脉栓塞法(MCAO)建立永久性局灶性脑缺血模型,于手术后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d处死,给予不同处理,采用HE染色法观察脑组织细胞形态、取动脉血进行血液流变学检测。结果 (1)模型组大鼠脑组织海马神经元细胞与假手术组比较出现典型缺血损伤表现,脑健胶囊组脑缺血组织与模型组比较自术后3 d开始恢复,且其起效时间优于补阳还五汤组。(2)模型组大鼠自术后1 d开始血液流变学中血浆黏度、全血高切相对指数、全血低切相对指数、卡松黏度即较假手术组明显升高(P0.05或P0.01),脑健胶囊组大鼠上述血液流变学指标在各时间点均较模型组降低(P0.05或P0.01),且其3 d的血浆黏度和28 d的全血高切相对指数水平改善均优于补阳还五汤组(P0.05)。结论促进脑缺血组织细胞形态恢复,改善血液流变学特性,可能是脑健胶囊发挥脑保护作用的重要途径之一。     

软坚消瘤片药物血清对乳腺癌MCF-7细胞生长的机制研究

目的：通过观察软坚消瘤片药物血清对乳腺癌MCF-7细胞的芳香化酶和雌激素受体基因的表达、细胞增殖周期及细胞凋亡的影响,探讨软坚消瘤片治疗乳腺肿块性疾病的可能机制。方法：制备软坚消瘤片含药动物血清,以体外培养的MCF-7细胞为研究对象,以qRT-PCR法检测乳腺癌细胞芳香化酶（CYP19）及雌激素受体（ER）mRNA表达水平;流式细胞术（FCM）测定细胞增殖周期和凋亡水平;MTS实验测定细胞生长曲线。结果：与空白对照组比较,含药血清组作用细胞24h后能明显抑制乳腺癌细胞株MCF-7的CYP19mRNA、ERmRNA表达水平,表达水平分别降低0.32和0.09倍;药物血清作用48h后S期和G2/M期细胞所占比例降低,尤以G2/M期最为显著,相应的G0/G1期细胞增加,药物血清抑制了细胞增殖的正常进行;凋亡实验示细胞早期凋亡率增加,药物血清组总体凋亡率高于对照组;药物血清作用细胞48h以后细胞生长曲线幅度开始明显低于对照组,在96h时抑制效果最明显。结论：软坚消瘤片药物血清影响乳腺癌MCF-7细胞的雌激素合成及其作用发挥,同时抑制一定时段的细胞生长。