霍山石斛及相似种的位点特异性PCR鉴别

目的设计出霍山石斛的位点特异性鉴别引物,仅通过PCR就能对霍山石斛的真伪进行准确鉴别。方法利用石斛属植物基因库中rDNA ITS序列数据库进行同源性比较,在与霍山石斛差异较大的区段设计1对特异性引物,然后对19份石斛属植物DNA模板进行PCR扩增,阳性者即为霍山石斛正品。结果发现在退火温度为60℃时,该引物能把霍山石斛的模板从19份石斛属植物中扩增出来,而其他的石斛属植物均为阴性。结论运用位点特异性鉴别引物成功地对霍山石斛进行PCR鉴别,该鉴别反应重现性好,能在霍山石斛鉴别时发挥重要的作用,与形态学、DNA测序等鉴别方法相比,该方法具有高效、准确、简便、省时等优点。     

鼓槌石斛特异性PCR分子鉴定

目的 研究能够特异性鉴别鼓槌石斛的PCR引物,并优化PCR检测体系,确立一种快速、准确鉴别鼓槌石斛的方法.方法 从GenBank数据库中下载石斛属rDNA ITS序列170余条,运用MEGA 5.0对所有序列进行同源性比较,找出各变异位点,在非保守区设计1对特异性引物.对35份石斛属植物DNA模板进行特异性引物PCR扩增,显示阳性者为鼓槌石斛.结果 将退火温度升至58℃时,鼓槌石斛能被该引物特异性地扩增出来,而其他石斛属植物均为阴性,且该引物的灵敏度可达到0.69 ng/μL.结论 建立一种特异性鉴别鼓槌石斛的方法,运用该特异性引物可实现从同源物种中快速、准确地鉴定出鼓槌石斛,具有特异性好,操作简便、高效、准确等优点.     

金钗石斛相关序列扩增多态性反应体系的正交优化研究

目的建立金钗石斛Dendrobiumnobile相关序列扩增多态性(SRAP)反应体系,为金钗石斛分子生物学研究提供技术支持。方法运用L25(56)正交设计对影响金钗石斛SRAP反应的5个因素:模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物在5个水平上进行优化试验,对PCR结果进行极差分析。结果金钗石斛SRAP反应最佳体系为:25μL PCR体系中含有20 ng模板DNA,2.0 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTPs,1 UTaq酶,0.6μmol/L引物。各因素对SRAP反应的影响依次为:Taq酶Mg2+dNTPs模板DNA引物。结论所建立的金钗石斛SRAP反应体系具有标记位点清晰、多态性丰富、稳定性好等特点,可用于金钗石斛分子生物学的研究。     

双阻滞位点特异性PCR鉴别铁皮石斛及其近缘物种

建立一种快速、准确鉴别铁皮石斛加工制品的方法。该研究通过对Gen Bank数据库收录的铁皮石斛及其同属近缘物种的ITS序列进行对比分析,根据变异位点设计双阻滞位点特异性鉴别引物,并优化PCR条件,对铁皮石斛及其69种近缘种共362个样品进行扩增和检测。结果显示,在退火温度为60℃的同一PCR反应中,铁皮石斛均扩增出397 bp条带,而其他69种近缘物种均无条带,且该方法灵敏度高,检出限可达0.03 mg·L~(-1)。该文所建立的位点特异性PCR方法可实现铁皮石斛的准确鉴别,具有操作简便、稳定可靠、应用范围广的优点。     

基于ITS序列位点特异性PCR的酸枣仁及其混伪品的鉴别

目的:基于ITS序列建立酸枣仁及其市场混伪品的分子鉴定方法。方法:收集酸枣仁及其常见混伪品理枣仁、枳椇子、紫荆子、兵豆,提取总DNA,基于ITS序列设计引物并进行PCR扩增,对扩增产物进行测序,用Bio Edit分析软件进行序列比对,针对变异位点用Primer Premier 5.0设计特异性鉴别引物,进行PCR反应并考察反应条件。结果:ITS序列可以用于酸枣仁及其易混淆品种的鉴别研究,在位点特异性PCR反应条件考察中,DNA模板用量范围应为0.7~2.1 ng·μL-1,退火温度在59℃时特异性最佳,实验建立的方法对不同Taq酶和PCR仪具有普遍适应性。结论:研究设计的位点特异性引物在一定条件下的PCR反应中,酸枣仁能扩增出66 bp的条带,而其他混伪品不能扩增出条带,从而实现了酸枣仁与其混伪品的快速、准确鉴别。     

基于ITS序列位点特异性PCR鉴别桃仁与苦杏仁

目的:对桃仁和苦杏仁进行分子鉴定研究,建立基于ITS序列位点特异性的PCR鉴定方法。方法:收集桃仁、苦杏仁样品,提取基因组总DNA,用ITS通用引物进行测序,通过Bio Edit软件进行序列比对,根据特异位点设计鉴别引物进行特异性PCR反应,并对PCR反应条件进行了优化。结果:基于ITS序列设计的特异性鉴别引物G4-7可以用于桃仁和苦杏仁的鉴别研究,在位点特异性PCR反应条件考察中,25μL反应体系DNA模板用量适宜范围为0.05~1 ng,退火温度在59℃时特异性最佳,实验建立的方法对不同DNA聚合酶和PCR仪均具有普适性。结论:该研究设计的位点特异性引物在一定条件下的PCR反应中,桃仁能够扩增出333 bp清晰条带,而苦杏仁没有该条带,从而实现了桃仁与苦杏仁的快速、准确鉴别。     

中药穿山甲的DNA分子鉴定研究

对中药穿山甲及其混伪品进行分子鉴定研究,建立一个稳定、准确的位点特异性PCR鉴别体系。收集整理穿山甲属动物组织样本及NCBI序列,提取基因组总DNA,PCR扩增Cytb和COⅠ序列并测序,通过Bio Edit软件进行序列比对,应用MEGA 6.0构建序列系统聚类树,并根据序列特异位点设计和筛选中华穿山甲特异性鉴别引物,并对PCR反应条件进行退火温度、DNA模板上样量和PCR循环数等条件的适应性考查。结果表明:Cytb和COⅠ序列均能有效对穿山甲正、伪品进行聚类分析;在位点特异性PCR反应体系中,当退火温度为55~60℃,DNA模板量3~100 ng,PCR扩增35个循环时,基于COⅠ序列的引物COⅠ-S10/A5能使中华穿山甲扩增出约400 bp的特异性条带,而其他穿山甲品种扩增结果为阴性。该文基于COⅠ序列的引物COⅠ-S10/A5能实现中华穿山甲与伪品印度穿山甲、马来穿山甲、树穿山甲等的准确、稳定鉴别。     

位点特异性PCR方法的建立及对近源种鹿茸药材的鉴别研究

目的:针对正品鹿茸与近源种鹿茸药材饮片鉴别的难点,建立一种简便、快速、准确的近源种鹿茸药材分子鉴别方法.方法:根据鹿科鹿属种动物cytb全序列比对分析,设计1对能准确鉴别正品鹿茸(包括梅花鹿和马鹿)和其他近源种鹿茸的引物,在此基础上建立鹿茸药材位点特异性PCR鉴别方法,并对影响PCR结果的主要因素退火温度、Taq用量、循环次数以及模板用量和重复性等进行方法学考察和优化.结果:在方法学考察的基础上,在μL PCR反应体系,退火温度为65℃的条件下,能准确扩增出约323 bp大小的阳性DNA条带,经测序验证结果表明,系正品鹿茸原动物的Cytb基因序列片段,而伪品鹿茸未扩增出条带.结论:所建立的位点特异性PCR方法,能将正品鹿茸与其他近源种鹿茸药材鉴别开来,具有较高的特异性、重复性,可广泛应用于鹿类药材的鉴别.     

应用位点特异性引物鉴定白花蛇舌草

目的:建立一种简便实用的白花蛇舌草药材的DNA分子鉴定方法.方法:收集目前市场上出现的白花蛇舌草及伪品共9种,分别提取总DNA,扩增rDNA ITS-2区序列,对比所有样品的该段核苷酸序列,并设计能专一性鉴别白花蛇舌草的位点特异性引物.结果:白花蛇舌草及其混淆品在ITS-2区的序列有显著差异.用位点特异性引物对所有样品DNA进行PCR扩增,只有白花蛇舌草有明显的约392 bp扩增产物,而其它8种植物在同等条件下无阳性产物.结论:所设计的鉴别引物对白花蛇舌草有高度的特异性.     

金钗石斛遗传多样性研究的随机扩增多态DNA-PCR反应体系的建立与优化

目的 对影响金钗石斛随机扩增多态DNA(RAPD)-PCR扩增效果的一些因素进行优化,为进一步研究其遗传多样性奠定基础.方法 对金钗石斛RAPD分析中一些重要影响因素进行比较系统的构建和优化,建立金钗石斛RAPD稳定可靠的反应体系.结果 金钗石斛较适宜的RAPD-PCR反应条件为:10μl PCR反应体系中,5～20 ng模板DNA,3.0mmol·L-1Mg2+,0.34 mmol·L-1dNTPs,0.6 U Taq DNA聚合酶,1.5 μmol·L-1引物,较适宜的退火温度为36℃.结论 所建立的金钗石斛RAPD反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强等特点,可用于金钗石斛的遗传多样性研究.以该优化的RAPD条件进行重复性实验,其实验结果重复性良好.     

石斛属4种植物的AFLP分析

目的 研究石斛属植物DNA指纹图谱,初步探讨AFLP分子标记技术在石斛地道性鉴别上的应用。方法采用扩增片段长度多态性(AFLP)技术对石斛属内石斛组4个种和一个外类群种进行基因组DNA多态性分析。结果从64对引物组合中选出5对引物组合构建了5个种的DNA指纹图谱。通过聚类分析,石斛属4种植物聚成一个大类,彼此关系得到了很好的分辨,并获得bootstrap校验的有力支持。结论AFLP技术可用于药用石斛DNA指纹图谱研究。     

ISSR-PCR在石斛种间鉴别中的应用

目的 采用ISSR-PCR方法对石斛属9种植物进行鉴别,探讨不同种石斛在DNA分子水平上的差异。方法 选取10条由SSR组成的引物,对9种石斛进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析。结果 10条引物中有7条扩增出多态性条带。每条引物可检测的多态性位点最少7个,最多14个,扩增片段大小为220-1260 bp。其中,引物UBC-807和UBC-864具有较高的多态性条带比率,均可以独立将所有被测种区分开来。结论ISSR-PCR作为一种简便、可靠的分子标记鉴定技术,可以作为石斛属种间鉴别的方法之一。     

以石斛为例研究多基原及非药用目标选育品种的质量差异

目的:以石斛为例研究多基原及非药用目标选育品种的质量差异。方法:分析铁皮石斛和石斛药材的6个原生种、12个观赏选育石斛品种及1种石斛类药材中常见近缘易混品的5种化学成分和体外抗氧化活性,对比铁皮石斛与其中1种观赏秋石斛的免疫调节和抑菌活性差异。结果:铁皮石斛与石斛药材的多个基原物种、易混伪品金石斛之间的化学成分和体外抗氧化活性均存在差异;金钗石斛与其他4种同样可作为石斛药材使用的原生石斛相比,测定的5种成分中至少有2种成分差异有统计学意义(P<0.05);全部12种观赏石斛的5种成分中,至少有2种成分分别与铁皮石斛或金钗石斛差异有统计学意义(P<0.05),但在抗氧化活性指标中有个别品种与两者差异无统计学意义;铁皮石斛与观赏石斛的药理活性差异有统计学意义,表现在两者的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力和血清溶血素半数溶血值(HC 50)差异有统计学意义(P<0.05);两者不同提取部位的体外抑菌活性差异有统计学意义(P<0.05)。结论:来源不同物种或非药用目标选育品种的石斛药材质量存在差异,临床上应慎重选择使用。     

线粒体nad 1内含子2序列在石斛属植物分子鉴定中的应用

目的在兰科石斛属药用植物鉴定中应用新的分子标记。方法扩增并测定9种石斛属植物线粒体中NADH脱氢酶亚基1编码基因(nad 1)内含子2(in tron 2)的全长序列。结果比对后的nad 1 in tron 2序列长872bp,其中有17个变异位点,可以鉴别除粉花石斛D end robium lodd ig esii以外的8种植物。结论线粒体nad 1 in tron2序列可以作为一种新的分子标记用于石斛属植物的鉴定。     

野生铁皮石斛rDNA ITS序列分析

目的:测定和分析不同产地野生铁皮石斛样品的rDNA ITS序列,探讨利用ITS序列推测铁皮石斛样品产地来源的可行性。方法:提取总基因组DNA,使用通用引物ITS5F/ITS4R进行PCR扩增,产物经电泳检测、纯化和测序后用Sequin 11.0提交GenBank。用Bioedit 7.0中的Clustal W对GenBank中包括本研究提交的11条在内的所有33条铁皮石斛的ITS序列进行多重序列比对,随后以金钗石斛和密花石豆兰为外群,用邻接法构建NJ系统发育树。结果:从所有测定的ITS序列中选择11条提交GenBank,获得登录号JF803235-JF803245。所有铁皮石斛经比对后共发现645个同源位点,9个信息位点(ITS1区3个,5.8 S区4个,ITS2区2个)。系统发育分析发现,金钗石斛和密花石豆兰位于树的基部,另外32条铁皮石斛共同形成单个大的分支,未发现产地来源与系统树的拓扑结构之间存在对应关系。结论:由于缺乏完善的铁皮石斛标准品及其DNA参考序列的提交标准,同时单个ITS序列仅能提供有限的系统发育信息位点,因此通过ITS序列分析的方法推测铁皮石斛样品的产地来源目前尚不具有可行性。     

利用RAPD分析13种石斛属植物的遗传多样性和亲缘关系

目的通过对13种石斛属植物进行遗传多样性和亲缘关系分析,为更好地开发利用石斛资源奠定基础。方法随机扩增多态性DNA(RAPD)技术分析遗传多样性,U PGM A类平均法进行聚类分析。结果利用筛选出的10个随机引物对供试材料DNA进行随机扩增,共得到188条带,其中多态性带有180条,多态性百分率为95.74%。采用U PGM A类平均法对扩增出的谱带进行遗传聚类分析,得出反映各种间亲缘关系的树状图。在遗传距离(D)=0.63处,可将供试材料分为3类,RAPD对基因组的分析结果与传统分类学的结果差异不大。结论该标记技术对石斛属植物的遗传多样性和分类研究是可行的。     

美花石斛种质资源的RAPD分子鉴定

目的采用RAPD分子标记技术对不同产地美花石斛进行分析,为美花石斛种质资源的准确鉴别提供依据。方法用RAPD分子标记技术对不同产地美花石斛基因组总DNA进行PCR扩增,根据其扩增产物分子量大小进行编码计算。结果从117种随机引物筛选出8种有效引物,S2108的PCR扩增产物中的特异性位点能够鉴别出广西玉林居群和贵州安居群。结论利用RAPD分子标记技术鉴别美花石斛种质资源是可行的,在严格控制各项条件下能够保证鉴别美花石斛种质资源的稳定性和重复性。     

高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品

 目的建立一种简便、准确的乌梢蛇药材DNA分子标记鉴别方法。方法根据乌梢蛇及10种常见混淆品线粒体12SrRNA基因序列,设计一对专用于乌梢蛇的鉴别引物HWL-1和HWH-1,用不同的复性温度PCR扩增,确立特异性反应条件,并利用此方法鉴别从市场上购买的各种乌梢蛇药材。结果PCR结果是在65℃复性温度下,正品乌梢蛇得到约320 bp的扩增带,而混淆品在同样的条件下无扩增带。为检验该方法的准确性,对市售乌梢蛇炮制品随机选取13块进行PCR鉴别验证,其中正品9块,混淆品4块,检出率达100%。结论所设计的鉴别引物对正品乌梢蛇有高度的特异性。PCR方法稳定性高,同种不同个体间的种内差异对鉴定结果无影响。本方法简单、准确、快速、灵敏度高、重现性好。     

金钱白花蛇及其混淆品高特异性PCR的鉴别

目的：建立一种实用、简便的金钱白花蛇药材DNA分子标记鉴别方法。方法：根据金钱白花蛇及常见混淆品线粒体Cyt b基因序列,设计一对专门用于中药材金钱白花蛇的鉴别引物HJL-1和HJH-1。用不同的复性温度PCR扩增,确立特异性反应条件,并利用此方法鉴别从市场中购买的金钱白花蛇药材。结果：在67 ℃复性温度下进行PCR,正品金钱白花蛇均得到230 bp的扩增带,而混淆品在同样的条件下无扩增带。对市售金钱白花蛇药材随机选取18块进行PCR鉴别验证,其中正品14块,混淆品4块,检出率达100％。结论：设计的鉴别引物对正品金钱白花蛇有高度特异性。可用于市售金钱白花蛇药材的鉴定。PCR稳定性高,同种不同个体间的种内差异对鉴定结果不会有影响。     

基于DNA条形码技术对喉红石斛的植物学分类研究

目的 利用DNA条形码技术探索喉红石斛Dendrobium christyanum的分类归属问题,并建立一种新的ITS2二级结构的信息挖掘方法。方法 提取分属5个组14种石斛的DNA,对ITS序列（ITS1-5.8 S-ITS2）进行PCR扩增,测序,获得ITS序列;基于序列信息,计算遗传距离、构建系统发育树,对ITS2的二级结构进行预测,并对其进行量化、聚类分析。结果 喉红石斛与黑毛组的矮石斛D.bellatulum、长距石斛D.longicornu的遗传距离最小,NJ系统发育树与ITS2二级结构的系统聚类图均显示喉红石斛与黑毛组石斛聚为一支,且喉红石斛与黑毛组石斛的二级结构图基本一致。结论 喉红石斛与黑毛组石斛的亲缘关系最近,应归属于黑毛组;新建立的ITS2二级结构量化分析方法可提供更多的分类信息,具有更高水平的分类潜能。这是首次运用DNA条形码进行石斛组间的分类研究,为石斛属植物系统提供了重要依据。