聚乙二醇沉淀法提取关节液来源外泌体实验研究

目的:应用聚乙二醇(PEG)沉淀法提取关节液来源外泌体,并检测外泌体的形态及分子生物学特征,为关节液来源外泌体的进一步研究奠定基础。方法:用8%PEG从关节积液中分离、提取目标颗粒,然后经透射电子显微镜观察其形态,采用纳米颗粒示踪分析仪分析其大小及纯度,蛋白质印迹法检测其标记物蛋白的表达。结果:所获目标颗粒呈圆形或椭圆形囊泡,质膜完整,大小不一,直径约为35～155nm,且阳性表达CD9及CD63蛋白。结论:对目标颗粒的形态、大小及蛋白分析结果证实PEG沉淀法能够从关节积液中分离、提取外泌体,且操作方法简单,可为后续研究奠定基础。     

健脾化瘀方体外通过外泌体影响肝癌细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化

目的探讨健脾化瘀方（JHD）通过外泌体对肝癌细胞迁移、侵袭及上皮间质转化（EMT）的影响。方法 利用转化生长因子β1（TGF-β1）刺激MHCC97H 细胞,构建肝癌细胞EMT 模型。根据处理条件,将细胞分为 4 组,①对照组：不进行干预;②模型组：TGF-β1（10 ng·mL-1）;③JHD 低浓度组：TGF-β1（10 ng·mL-1）+健 脾化瘀方（2 mg·mL-1）;④JHD 高浓度组：TGF-β1（10 ng·mL-1）+健脾化瘀方（4 mg·mL-1）。干预48 h 后,采用 超速离心法提取各组细胞培养上清液的外泌体,通过透射电镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）、Western Blot 法检测外泌体标志蛋白（CD63、CD81、HsP70、CD9）,以及外泌体内吞实验对外泌体进行鉴定。将提取的 4 组外泌体分别与MHCC97H 细胞共培养24 h/48 h 后,分离MHCC97H 细胞,进行划细胞划痕实验、Transwell 细胞侵袭实验及Western Blot 法检测EMT 相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）。结果透射电镜下观 察到外泌体的形态呈囊泡状,分布不一,有单个分布,也有聚集成组,背景清晰,无明显污染物,各组外泌体 形态相近,无明显差异,直径在30~140 nm 之间;纳米颗粒追踪分析仪检测到4 组外泌体粒径的峰值在130~ 150 nm 之间,与电镜观察结果基本一致;各组均可检测到外泌体标志蛋白CD63、CD81、HsP70、CD9 表达。 被PKH26 标记的外泌体可被MHCC97H 细胞重新吸收内化。与对照组比较,模型组的MHCC97H 细胞迁移能 力（24、48 h）及侵袭能力均显著增强（P＜0.01）, E-cadherin 蛋白表达显著下调（P＜0.01）, Vimentin、 N-cadherin 蛋白表达显著上调（P＜0.01）。与模型组比较,JHD 高、低浓度组的MHCC97H 细胞迁移能力（24、 48 h）及侵袭能力显著减弱（P＜0.01）,E-cadherin 蛋白表达显著上调（P＜0.01）,Vimentin、N-cadherin 蛋白表 达显著下调（P＜0.01）。结论健脾化瘀方体外可通过外泌体抑制MHCC97H 细胞的迁移、侵袭及上皮间质 转化。     

人参根外泌体的提取、表征及其对多柔比星诱导的心肌损伤保护作用机制

目的研究人参Panax ginseng根外泌体提取、表征及其体外心肌保护活性。方法采用差速离心法与蔗糖梯度离心法提取人参根外泌体;通过透射电子显微镜(TEM)和纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)技术对外泌体进行鉴定;采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)法对人参根外泌体进行蛋白质组学分析;通过SmallRNA测序分析人参根外泌体中SmallRNA种类;建立H9C2心肌细胞损伤模型,利用CCK-8法检测细胞活力;以最刘质量浓度的人参根外泌体处理H9C2细胞,应用Hoechst染色和JC-1染色考察细胞凋亡率;蛋白质免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白。结果 TEM图中清晰可见人参根外泌体呈茶托状的双层膜结构;NTA粒径分析检测到112.7nm的人参根外泌体占总人参根外泌体的92.7%;蛋白组学分析鉴定到5585个蛋白;SmallRNA测序鉴定到miRNA、tRNA、snRNA、rRNA、snoRNA 5种SmallRNA;体外实验结果显示,与对照组相比,模型组细胞活力下降,人参根外泌体给药组呈剂量依赖性地使细胞活力升高,细胞凋亡率降低;Western blotting结果显示凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白水平下降;Bax、Cyt C的蛋白水平升高。结论首次报道了人参根外泌体的提取工艺及表征,并发现人参根外泌体对多柔比星诱导的心肌损伤具有一定的保护作用。     

艾灸对三阴性乳腺癌移植瘤小鼠生存期的影响及机制研究

目的:观察艾灸对三阴性乳腺癌(TNBC)移植瘤小鼠生存期的影响,并基于对血清外泌体的分析探讨艾灸的干预机制。方法:采用TNBC细胞系皮下移植构建小鼠移植瘤模型,随机分为对照组与实验组; 分析小鼠生存期,绘制生存曲线,并检测血清外泌体。结果:实验组小鼠最长生存期达到53 d,对照组小鼠最长生存期48 d,两组比较差异有统计学意义(P<0.05); 通过透射电镜观察提取物形态,纳米颗粒跟踪分析仪测定粒径分布及浓度,Western blot检测外泌体表面标记蛋白,最终确定该提取物为血清外泌体。两组小鼠血清提取物均有CD63、TSG101表达。两组小鼠外泌体浓度分别为(6.19×10⁹)个/ml、(2.34×10⁹)个/ml,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:艾灸延长三阴性乳腺癌荷瘤小鼠生存期的机制可能与促进相关细胞释放外泌体有关。     

HepG2肝癌细胞外泌体对人树突状细胞成熟与功能的影响

目的:观察HepG2肝癌细胞外泌体对人树突状细胞(Dendritic cells,DC)成熟和功能的影响。方法:采用透射电镜、Nano FCM和Western Blot鉴定和测定外泌体的形态、粒径分布及特征性蛋白的表达,用细胞因子GM-CSF(20 ng/ml)、IL-4(10 ng/ml)、IFN-β(105U/ml)和LPS(10 ng/ml)诱导刺激DC成熟,用流式细胞术检测DC成熟相关表面分子CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达,ELISA检测培养上清液中细胞因子IL-12的水平,CCK-8法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。结果:HepG2、MIHA来源外泌体表达CD63、Alix,同时不表达细胞色素C(Cytochrome C);在HepG2肝癌细胞外泌体刺激下,DC的CD80、CD83阳性表达率较仅加入LPS的对照组明显降低(P<0.05),而CD86、HLA-DR表达较对照组无明显差异;ELISA测定结果显示,200μg/ml HepG2 EXO干预后的DC较对照组分泌IL-12的量明显减少(P<0.05);CCK-8检测显示,200μg/ml HepG2EXO干预的DC较对照组刺激异体淋巴细胞增殖的能力明显降低(P<0.05)。结论:HepG2肝癌细胞外泌体对DC表面成熟相关分子表达、细胞因子的分泌、刺激异体T淋巴细胞增殖的能力均有一定的抑制作用。     

温心方含药血清对人脐静脉内皮细胞外泌体及人主动脉血管平滑肌细胞表型转化的影响

目的 从人脐静脉内皮细胞(HUVECs)外泌体及人主动脉血管平滑肌细胞(HAVSMCs)表型转化角度探讨温心方治疗冠心病的可能作用机制。方法 30只SD大鼠给予温心方水煎剂33.75 g/(kg·d)灌胃，连续7天，末次灌胃2 h后腹主动脉取血制备含药血清。取对数生长期的HUVECs，分别设立对照组、模型组及温心方高、中、低剂量组，对照组使用完全培养基培养，温心方高、中、低剂量组分别用5%、15%、25%温心方含药血清培养24 h后加入50 mg/L氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)培养24 h，模型组仅加入50 mg/L ox-LDL培养24 h造模。各组高速离心分离获取HUVECs外泌体，透射电镜观察外泌体形态，BCA法测定外泌体蛋白浓度，检测外泌体粒径，Western Blot法检测外泌体标志蛋白溶酶体相关膜蛋白3 (CD63)、肿瘤易感基因101 (TSG101)表达，qRT-PCR法检测外泌体miR-145表达。各组HUVECs外泌体50 ng与HAVSMCs共培养24 h，观察外泌体摄取，于6、12、24、48 h应用MTT法检测HAVSMCs细胞增殖率，Transwell法...     

超速离心法与聚乙二醇沉淀法提取人多发性骨髓瘤细胞来源外泌体的比较

目的:鉴定比较超速离心法和聚乙二醇(PEG)沉淀法提取人多发性骨髓瘤细胞来源外泌体。方法:人多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226经去除外泌体无血清培养24~48 h培养后,分别使用超速离心法和PEG沉淀法进行外泌体的提取,分别测定两种方法所得外泌体的蛋白含量,并进行电镜鉴定比较。结果:超速离心法所提取外泌体测得实际浓度为(1.095±0.031)μg·μL~(-1),沉淀法所提取外泌体实际浓度为(2.069±0.086)μg·μL~(-1),组间比较,差异具有统计学意义(P0.001);超速离心法测得外泌体蛋白总量(109.513±3.113)μg,沉淀法所提取外泌体测得蛋白总量(206.883±8.580)μg,组间比较,差异具有统计学意义(P0.001)。电镜下超速离心法分离外泌体清晰可见,沉淀法提取的外泌体含有较多杂质,影响电镜观察。结论:超速离心法方法简单,耗时少,外泌体纯度高,可用于外泌体的蛋白、DNA和免疫功能研究。沉淀法耗时较长,所得外泌体杂质蛋白含量多,不适用于外泌体蛋白分析,可用于RNA分析。     

补肾活血汤调节rabHK-2外泌体对椎间盘髓核细胞凋亡及Wnt信号通路的影响

目的:观察补肾活血汤对兔退变椎间盘组织细胞凋亡及Wnt信号通路的影响，以及调节兔肾小管上皮细胞(rabHK-2)来源外泌体的分泌，对退变椎间盘髓核细胞(NPCs)增殖、凋亡及Wnt信号通路蛋白表达的影响。方法:建立兔椎间盘退变模型，补肾活血汤干预8 w后，采用TUNEL法检测椎间盘组织凋亡阳性细胞率，Western-blot法检测椎间盘组织中Wnt信号通路相关蛋白的表达；5.41 g/kg补肾活血汤灌胃新西兰白兔制备含药血清，以10%补肾活血汤含药血清作用于rabHK-2细胞，采用超高速离心法提取rabHK-2细胞外泌体，透射电镜观察外泌体形态，Western-blot法检测外泌体标志蛋白集群分化因子9(CD9)和集群分化因子63(CD63)的表达；用PKH67荧光试剂盒标记后的外泌体与退变NPCs共孵育，荧光显微镜观察不同浓度外泌体作用于退变NPCs后，退变NPCs对rabHK-2细胞外泌体的摄取情况，CCK-8法检测退变NPCs活力。rabHK-2外泌体与补肾活血汤含药血清单独或联合干预后，应用流式细胞术检测退变NPCs凋亡情况，RT-PCR检测退变NPCs中II型胶原和蛋白多糖的...     

半夏泻心汤含药血清对胃癌细胞外泌体诱导的腹膜间皮细胞FN1、LAMC1表达及胃癌细胞与腹膜间皮细胞黏附、侵袭的影响

目的 观察半夏泻心汤含药血清对胃癌细胞来源外泌体诱导的腹膜间皮细胞纤维连接蛋白1(FN1)和层粘连蛋白γ1(LAMC1)表达及胃癌细胞与腹膜间皮细胞黏附、侵袭的影响，探讨其抑制胃癌腹膜转移的作用机制。方法 制备半夏泻心汤含药血清，提取人胃癌细胞NCI-N87外泌体，采用透射电镜观察及Western blot进行鉴定。将人腹膜间皮细胞HMrSV5分为正常对照组、模型组、5-氟尿嘧啶（5-FU）组和半夏泻心汤低、中、高剂量组，每组3个复孔，以NCI-N87细胞外泌体诱导HMrSV5细胞，并分别用10%含药血清培养，ELISA检测HMrSV5细胞上清液FN1和LAMC1含量，PCR检测HMrSV5细胞FN1和LAMC1mRNA表达，荧光酶标仪检测NCI-N87细胞与HMrSV5细胞黏附情况，Transwell小室检测NCI-N87细胞向HMrSV5细胞侵袭情况。结果 透射电镜观察NCI-N87细胞外泌体呈椭圆或碟状囊泡结构，粒径介于40～80 nm，外泌体标志蛋白CD9、CD63高表达，钙网蛋白低表达。与正常对照组比较，模型组HMrSV5细胞上清液FN1和LAMC1含量明显增加，HMrSV5...     

二仙汤含药血清外泌体经FN1促进成骨细胞骨形成

目的:探讨二仙汤含药血清外泌体蛋白的变化及其对成骨细胞骨形成的作用。方法:对二仙汤含药血清外泌体进行提取、鉴定。体外培养MC3T3-E1成骨细胞，分为正常对照组、空白血清外泌体2.5、5μg/mL组、二仙汤含药血清外泌体2.5、5、10μg/mL组。CCK8法检测成骨细胞增殖情况；碱性磷酸酶(ALP)染色法观察成骨细胞ALP;茜素红染色观察成骨细胞矿化结节；Western blot法检测细胞中骨形态发生蛋白2(BMP-2)蛋白表达。运用蛋白质组学技术对血清外泌体进行差异性蛋白分析。采用纤连蛋白(FN1)联合空白血清外泌体(3 nmol/L纤连蛋白+5μg/mL、12 nmol/L纤连蛋白+5μg/mL)处理成骨细胞，通过试剂盒检测成骨细胞ALP活力；Western blot法检测FN1对成骨细胞中BMP-2蛋白表达的影响。结果:与空白血清外泌体2.5μg/mL组相比，二仙汤含药血清外泌体组成骨细胞的增殖、ALP染色程度和茜素红染色程度明显升高(P<0.05或P<0.01),BMP-2的蛋白表达明显上调(P<0.05)。从血清外泌体中共鉴定到256个蛋白，其中96个蛋白...     

补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血清外泌体及Nestin、GFAP蛋白表达的影响

目的：观察补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血清外泌体及巢蛋白（Nestin）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）表达的影响。方法：将40只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、补气活血合剂组及补气活血合剂+外泌体抑制剂GW4869组（后简称合剂+GW4869组）各10只，模型组、补气活血合剂组及合剂+GW4869组均采用大脑中动脉线栓法复制大鼠大脑中动脉梗塞模型，假手术组仅给予颈内动脉、颈外动脉及颈总动脉的解剖分离而不进行线栓插入，缺血2h后拔除线栓进行再灌注；补气活血合剂及合剂+GW4869组分别在再灌注2h后开始灌胃补气活血合剂（10mL/kg，3次/日），合剂+GW4869组在每次灌胃前给予外泌体抑制剂GW4869腹腔注射（2.5mg/kg·d），假手术组及模型组给予灌胃等量生理盐水，四组均连续干预7天。7天后，分别记录各组大鼠干预前后的神经功能缺损评分，TTC染色法计算干预后各组大鼠脑梗死体积，HE染色法评估各组大鼠神经组织形态学变化，Western Blot法检测大鼠梗死区组织Nestin、GFAP蛋白及血清外泌体CD63蛋白的表达水平。结果：干预7天后，假手术组未表现出神经功能缺损症状，模型组神经功能缺损评分显著升高（P<0.01），补气活血合剂组神经功能缺损评分较模型组显著降低（P<0.05），应用GW4869后，神经功能缺损评分较补气活血合剂组显著升高（P<0.01）。TTC染色结果显示：假手术组大鼠脑组织成正常红色，未见肉眼苍白梗死灶，模型组、补气活血合剂组、合剂+GW4869组均可见右侧大脑苍白梗死灶；与假手术组相比，模型组、补气活血合剂组、合剂+GW4869组大鼠的脑梗死体积比均显著增加（P<0.01）；与模型组相比，补气活血合剂组的大鼠脑梗死体积比显著降低（P<0.05）；与补气活血合剂组相比，合剂+GW4869组大鼠的脑梗死体积比均显著增加（P<0.01）。HE结果显示：假手术组染色均匀，组织完整，神经细胞形状为圆锥状，排列整齐，核大居中，有明显的核仁；模型组脑皮层神经细胞排列不规则，神经元明显肿胀，核仁不明显，出现核固缩、细胞间隙存在不同大小的空泡样改变，出现间质水肿；与模型组相比，补气活血合剂组、合剂+GW4869组神经元坏死减少、组织水肿的形态表现较轻；与合剂+GW4869组相比，补气活血合剂组坏死神经元和脑组织水肿等病理损伤较轻。Western Blot结果显示：与假手术组相比，模型组GFAP、CD63表达显著降低（P<0.05）；与模型组相比，补气活血合剂组GFAP、CD63表达显著升高（P<0.05）；加用GW4869后，补气活血合剂组GFAP、CD63表达显著下降（P<0.05），Nestin表达仅有与GFAP、CD63相似的趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。结论：补气活血合剂可缩小脑梗死体积，提高脑梗死组织中GFAP蛋白的表达，改善大鼠缺血再灌注后神经功能缺损程度，该作用可能与促进外泌体分泌有关。     

颗粒剂中丹皮酚掩味技术探索

目的:掩盖丹皮酚不良味道,制备丹皮酚共融物颗粒,并考察其体外溶出度。方法:以山嵛酸甘油酯为掩味材料,采用熔融骤冷法制备共融物颗粒。选择丹皮酚与山嵛酸甘油酯的用量比、聚乙二醇6000加入量和颗粒大小为考察因素,以掩味效果和60 min溶出度为综合评价指标,通过正交试验优化丹皮酚共融物颗粒的处方工艺。利用紫外分光光度法测定丹皮酚溶出量,检测波长274 nm。结果:丹皮酚共融物颗粒的最佳处方工艺为丹皮酚-山嵛酸甘油酯(1∶3.5),聚乙二醇6000用量占丹皮酚与山嵛酸甘油酯总量的13%,颗粒大小80~100目。丹皮酚共融物颗粒的大小对掩味效果及溶出度具有显著性影响,60 min时丹皮酚溶出度70%。结论:优选的处方工艺简单、方法可行,丹皮酚共融物颗粒具有良好的口感。     

膝痹宁对膝骨关节炎模型大鼠滑膜纤维化的影响

目的观察膝痹宁对膝骨关节炎(KOA)模型大鼠滑膜纤维化的影响。方法大鼠分为空白组、KOA组、膝痹宁组;KOA组、膝痹宁组造模。分别在膝痹宁灌胃治疗的第1、14、28、42、56天测量各组大鼠的膝关节横径;第56天处死大鼠提取滑膜组织,解剖学观察滑膜组织形态;天狼星红染色评估滑膜组织胶原沉积情况;WB和PCR检测纤维化标记物生长转化因子-β(TGF-β)、Ⅰ型胶原α1链(COL1α1)、金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)的蛋白和基因表达。结果膝痹宁用药14天,28天时,膝关节横径变化并不显著,但膝痹宁用药42天,56天时,膝关节横径则较KOA模型明显减小,差异具有统计学意义(P<0.05);用药56天后对大鼠进行膝关节解剖学观察,KOA大鼠滑膜组织较正常大鼠有一定程度的增厚、充血、欠规则;而上述表现在膝痹宁大鼠有所减轻;天狼星红染色显示膝痹宁用药大鼠滑膜组织胶原沉积较少;纤维化标记指标物TGF-β、COL1α1、TIMP1的基因和蛋白表达在膝痹宁组均较KOA组降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论膝痹宁对能有效减轻KOA滑膜纤维化,以“温经活血”立法的中药复方对组织纤维化具有良性干预效应。     

负载microRNA-27b-骨髓间充质干细胞来源外泌体的软骨细胞-聚乳酸羟基乙酸共聚物骨软骨复合体移植治疗软骨缺损的实验研究

目的:探讨负载microRNA-27b(miR-27b)-骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)来源外泌体(exosomes,exo)的软骨细胞(chondrocytes,chon)-聚乳酸羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]骨软骨复合体移植治疗软骨缺损的效果及作用机制。方法:(1)培养BMSC并制备BMSC来源exo(BMSC-exo),观察BMSC-exo的形态,测定BMSC-exo的粒径和Zeta电位,并采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测BMSC-exo表面标记蛋白CD9和CD63。(2)将培养至第2或第3代的BMSC分为2组,BMSC组于RPMI-1640培养基中培养,不进行干预,miR-27b-BMSC组采用miR-27b过表达的重组腺病毒感染;培养24 h后,制备BMSC-exo和miRNA-27b-BMSC-exo,并分别提取BMSC、BMSC-exo、miRNA-27b-BMSC、miRNA-27b-BMSC-exo的RNA,采用实时定量PCR检测miR-27b的表达。(3)分别采用Dil细胞膜红色荧光探针和Hoechst33258染色试剂给miR-27b-BMSC-exo和大鼠软骨细胞染色,于荧光显微镜下观察大鼠软骨细胞对miR-27b-BMSC-exo的摄取情况。(4)将大鼠软骨细胞分为2组,BMSC-exo组接种于BMSC-exo终浓度为80μg·mL^-1的RPMI-1640培养基中,miR-27b-BMSC-exo组接种于miR-27b-BMSC-exo终浓度为80μg·mL^-1的RPMI-1640培养基中;培养4 h后,采用实时定量PCR检测miR-27b的表达。(5)将大鼠软骨细胞分为4组,对照组于RPMI-1640培养基中培养,不进行干预,白细胞介素(interleukin,IL)-1β组在IL-1β终浓度为10 ng·mL^-1的RPMI-1640培养基中培养,miR-27b-BMSC-exo组在IL-1β终浓度为10 ng·mL^-1、miR-27b-BMSC-exo终浓度为80μg·mL^-1的RPMI-1640培养基中培养,BMSC-exo组在IL-1β终浓度为10 ng·mL^-1、BMSC-exo终浓度为80μg·mL^-1的RPMI-1640培养基中培养;分别于培养0 h、1 h、2 h、3 h、4 h和8 h,采用MTT法测定各组大鼠软骨细胞活力;培养24 h后,提取各组大鼠软骨细胞总蛋白,采用Western Blot检测软骨损伤相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease,caspase)-3、caspase-9、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-13的表达。(6)取18只8周龄SD雌性大鼠,于SD大鼠的左后肢股骨远端滑车沟槽制造直径4.5 mm、深度1 mm的软骨缺损,建立软骨缺损SD大鼠模型;将18只软骨缺损SD大鼠模型随机分为3组,对照组植入chon-PLGA骨软骨复合体,miR-27b-BMSC-exo组植入miR-27b-BMSC-exo-chon-PLGA骨软骨复合体,BMSC-exo组植入BMSC-exo-chon-PLGA骨软骨复合体;饲养12周后处死SD大鼠,观察软骨修复效果,免疫组织化学染色检测软骨损伤修复标志蛋白Ⅱ型胶原蛋白、MMP-13的表达;提取SD大鼠软骨组织总蛋白,采用Western Blot检测软骨损伤相关蛋白caspase-3、caspase-9、MMP-13的表达。结果:(1)BMSC-exo的鉴定结果。BMSC-exo为圆盘形囊泡状膜结构,粒径92~115 nm,数量占比最高的BMSC-exo的粒径为106 nm;BMSC-exo的Zeta电位为(-22.13±2.1)mV。BMSC-exo表面标记物CD9和CD63在BMSC-exo组的表达量显著高于BMSC组(相对灰度值:6.513±0.714,1.001±0.021,t=18.902,P=0.000;7.564±0.636,1.026±0.027,t=25.158,P=0.000)。(2)miR-27b表达的检测结果。miR-27b在miR-27b-BMSC组BMSC中的表达量高于BMSC组(相对表达量:46.785±8.153,1.000±0.280,t=13.748,P=0.000);miR-27b在miR-27b-BMSC组exo中的表达量高于BMSC组(相对表达量:34.825±8.612,1.000±0.325,t=9.621,P=0.000)。(3)miR-27b-BMSC-exo的摄取情况。大鼠软骨细胞和miR-27b-BMSC-exo共培养4 h,miR-27b-BMSC-exo被大鼠软骨细胞摄取。(4)共培养后大鼠软骨细胞中miR-27b表达的检测结果。miR-27b在miR-27b-BMSC-exo组大鼠软骨细胞中的表达量高于BMSC-exo组(相对表达量:3.315±0.523,1.000±0.244,t=9.826,P=0.000)。(5)大鼠软骨细胞活力测定结果。时间因素与分组因素存在交互效应(F=2.836,P=0.049)。4组大鼠软骨细胞活力总体比较,差异有统计学意义,即存在分组效应(F=11.345,P=0.049)。培养前及培养1 h、2 h,大鼠软骨细胞活力的组间差异无统计学意义(F=0.047,P=0.406;F=0.765,P=0.189;F=2.095,P=0.063);培养3 h、4 h、8 h,大鼠软骨细胞活力的组间差异有统计学意义(F=4.720,P=0.039;F=7.421,P=0.021;F=95.348,P=0.000),IL-1β组的大鼠软骨细胞活力小于对照组、miR-27b-BMSC-exo组、BMSC-exo组(3 h:P=0.002,P=0.011,P=0.026;4 h:P=0.002,P=0.002,P=0.006;8 h:P=0.004,P=0.004,P=0.011),miR-27b-BMSC-exo组的大鼠软骨细胞活力大于对照组和BMSC-exo组(3 h:P=0.019,P=0.023;4 h:P=0.015,P=0.002;8 h:P=0.003,P=0.029)。不同时间点大鼠软骨细胞活力总体比较,差异无统计学意义,即不存在时间效应(F=0.258,P=0.083)。(6)大鼠软骨细胞中软骨损伤相关蛋白表达的检测结果。切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13的表达量组间比较,差异有统计学意义(F=15.691,P=0.024;F=98.021,P=0.002;F=76.312,P=0.004),IL-1β组大鼠软骨细胞中切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13的表达量均高于对照组、miR-27b-BMSC-exo组、BMSC-exo组(切割-caspase-3:P=0.025,P=0.020,P=0.006;切割-caspase-9:P=0.011,P=0.008,P=0.036;MMP-13:P=0.034,P=0.003,P=0.009);miR-27b-BMSC-exo组大鼠软骨细胞中切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13的表达量均低于BMSC-exo组(P=0.023,P=0.010,P=0.007)。(7)SD大鼠软骨缺损修复效果。直视下观察,miR-27b-BMSC-exo组SD大鼠软骨缺损修复效果优于对照组和BMSC-exo组。病理染色结果显示,对照组软骨层较薄,边缘不规则,软骨下骨和软骨无界限;miR-27b-BMSC-exo组和BMSC-exo组软骨层较厚,边缘光滑,软骨下骨和软骨界限清晰,且miR-27b-BMSC-exo组透明软骨修复效果优于BMSC-exo组。(8)软骨损伤修复标志蛋白表达的检测结果。免疫组织化学染色显示,对照组和BMSC-exo组SD大鼠软骨组织中MMP-13高表达,miR-27b-BMSC-exo组SD大鼠软骨组织中MMP-13低表达;对照组SD大鼠软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白低表达,BMSC-exo组和miR-27b-BMSC-exo组SD大鼠软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白高表达。MMP-13、Ⅱ型胶原蛋白表达阳性率的组间比较,差异有统计学意义(F=126.178,P=0.002;F=209.24,P=0.001)。miR-27b-BMSC-exo组SD大鼠软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白表达量高于对照组和BMSC-exo组(P=0.005,P=0.012),MMP-13的表达量低于对照组和BMSC-exo组(P=0.029,P=0.014)。(9)SD大鼠软骨组织中软骨损伤相关蛋白表达的检测结果。切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13表达量的组间比较,差异有统计学意义(F=15.126,P=0.026;F=33.151,P=0.019;F=53.522,P=0.016),miR-27b-BMSC-exo组切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13的表达量均低于对照组和BMSC-exo组(切割-caspase-3:P=0.003,P=0.006;切割-caspase-9:P=0.001,P=0.019;MMP-13:P=0.007,P=0.008)。结论:miR-27b-BMSC-exo-chon-PLGA骨软骨复合体移植治疗软骨缺损,治疗效果显著,其作用机制可能与抑制caspase-3、caspase-9以及MMP-13的表达、促进Ⅱ型胶原蛋白的表达有关。     

基于机械粉碎法的穿心莲内酯复合粒子制备及其溶出度研究

目的：制备穿心莲内酯复合粒子,并对其粒子结构与溶出度进行评价。方法：采用机械粉碎法制备穿心莲内酯与聚乙二醇（PEG）6000复合粒子;通过扫描电镜（SEM）与差示扫描量热仪（DSC）表征复合粒子的结构;采用接触角测定仪测定其接触角;考察其体外溶出曲线。结果：穿心莲内酯与PEG 6000形成相互包覆的复合粒子结构,且穿心莲内酯结晶度下降。以水为测定液,穿心莲内酯与PEG 6000复合粒子粉体的接触角明显小于其原粉与物理混合物,且复合粒子的体外溶出速率明显优于其原料、超微粉及其物理混合物。结论：基于机械粉碎的穿心莲内酯复合粒子能显著提高穿心莲内酯的体外溶出度。     

pCMV-tag2B-CD258质粒的构建和初步表达鉴定

目的构建肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员CD258的真核表达质粒,诱导并鉴定其表达。方法将克隆获得的CD258全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV-tag2B中,构建CD258的重组表达载体pCMV-tag2B-CD258,经DNA测序证明CD258的cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基顺序,用脂质体Lifefectamine2000将重组质粒转染人前列腺癌IA8细胞系,诱导其表达,G418筛选阳性克隆,用Western Blot进行鉴定。结果pCMV-tag2B-CD258经双酶切表明有相应大小的DNA片断,序列分析证实为正确的有完整读码框的CD258基因,用脂质体转染法可将pCMV-tag2B-CD258导入IA8细胞并成功表达,目的蛋白经Western Blot鉴定具有生物学活性。结论重组质粒pCMV-tag2B-CD258能表达具有生物学活性的CD258蛋白,为研究CD258在前列腺癌中的功能打下了基础。     

外泌体作为中药新活性成分的研究进展＊

外泌体是内膜衍生的，具有磷脂双分子层结构，并由大多数细胞分泌而来的纳米级小囊泡，内含DNA、小RNA、蛋白质等物质，具有沟通细胞间通讯的作用。近年来，随着动物外泌体的研究成果不断涌现，外泌体研究已成为生物学、医药学等研究的热点。最近，植物外泌体也逐渐引起大家的关注，尤其是药用植物外泌体的研究也在不断增加。为此，本文整理了近些年药用植物外泌体研究的相关文献，对药用植物外泌体的提取、分离、鉴定及应用进行了总结与分析，以期为将来中药外泌体的研究提供新的思路与方法。     

Exosome Is an Important Novel Way of Acupuncture Information Transmission

As a physical stimulation of the body surface, the process of transmitting acupuncture information from acupoints to target organs through meridians and collaterals is complex, and network regulation is the most basic mode of acupuncture. Exosomes are membrane vesicles formed by various types of cells and secreted to the extracellular matrix through a series of regulation. We speculate that exosomes and their carriers, as important carriers of communication among neurons, endocrine cells, and immune cells, may play an important role in the process of acupuncture information transmission. Exosome in the acupoint area is an important interactive form of transformation from physical information to chemical information. Circulating exosome is an important means of delivery for acupuncture to play an important role in the network regulation. The structure and information molecules of exosomes are the important material bases for acupuncture effect. Through experimental research, it was found that acupuncture can regulate the release of exosome and may have a certain relationship with acupuncture effect. Therefore, exosome may play an important role in the process of acupuncture information transmission, which is an important new way of acupuncture information transmission.