登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核载体的构建及蛋白表达

目的体外扩增登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列,构建pET28a(+)-ME、pET28a(+)-NE,分析其在E-coli BL21中的表达。方法 PCR方法扩增(DENV-2)M株、NGC株E基因部分序列并构建原核重组载体pET28a(+)-ME、pET28a(+)-NE,将重组载体转化E-coli BL21,IPTG诱导表达,采用镍离子亲和层析的方法纯化目的蛋白并用SDS-PAGE电泳和Western-Blot进行鉴定。结果经双酶切、PCR和测序证实成功构建原核重组载体pET28a+-ME、pET28a(+)-NE,Western-Blot证实成功诱导出目的蛋白,SDS-PAGE电泳证实亲和层析法纯化后得到较高纯度的目的蛋白。结论检测到目的蛋白的表达,经纯化后得到纯度约为90%的目的蛋白,为研究登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E蛋白在致病机制方面奠定了一定的基础。     

重组人胰岛素样生长因子-1分离纯化工艺的建立

目的：建立重组人胰岛素生长因子－1（rhIGF-1)大肠杆菌表达后的高效分离纯化工艺，以便获得高纯度的重组蛋白。方法：已构建好的表达载体转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导进行表达，将离心收集到的菌体用超声破壁，破壁菌液离心分离，收集上清液，进行阴离子交换层析，疏水层析和分子筛纯化，得到最终纯品，蛋白纯度用SDS－PAGE鉴定，ELISA法检测rhIGF-1含量，检测纯化后重组蛋白的生物学活性。结果：用大肠杆菌BL21表达rhIGF-1以可溶性形式存在胞浆中，经3步rhIGF-1分离纯化工艺，其工艺流程可获得具有生物学活性的高纯度rhIGF-1，为产业化及临床应用奠定基础。     

丹参转录因子SmWRKY1蛋白的表达和纯化条件优化研究

WRKY转录因子是一类含有高度保守的WRKY结构域的锌指蛋白,是植物所特有的转录因子家族。该研究将已克隆的 SmWRKY1 cDNA构建到原核表达载体pET28a上,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约36 kDa,与预测的蛋白相对分子质量一样,说明该基因在大肠杆菌中成功表达。对影响蛋白表达的4个因素：诱导时间、诱导温度、IPTG浓度及诱导前菌液的浓度进行优化,结果表明在大肠杆菌BL21（DE3）中,当A₆₀₀达到约1.0~1.5时,加入0.2 mol·L^-1的IPTG,在20 ℃诱导培养12 h后SmWRKY1蛋白的表达量较高。原核表达产物SmWRKY1蛋白以包涵体的形式存在,采用尿素提取包涵体蛋白,用Ni²⁺亲和色谱法纯化表达蛋白,纯化后蛋白的质量浓度为2.454 g·L^-1。经蛋白质印迹检测,His-Tag单克隆抗体可以特异性的识别SmWRKY1蛋白,进一步证实丹参SmWRKY1蛋白在大肠杆菌中成功表达。本研究为进一步开展 SmWRKY1 基因的表达与丹参酮类等化合物的生物合成相关研究奠定了工作基础。     

基于中西医特异临床指标的系统性红斑狼疮的抗Sm抗体蛋白的研发

目的:为抗Sm抗体的特异性检出,提高中西医对疾病特异诊断,构建SmD1蛋白原核表达载体,并诱导表达。方法:提取Hela细胞总RNA后逆转录为cDNA,将带酶切位点BamH I和Xho I的人SmD1蛋白基因序列进行PCR扩增,经酶切后插入pET41a质粒中,构建pET41a-GST-SmD1-6*His重组表达质粒,转化进入感受态大肠埃希菌OverExpress C41(DE3)中,经过异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用C端的His标签(His-tag)进行Ni-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达形式,Western blotting(WB)鉴定重组蛋白的免疫原性,ELISA法鉴定其免疫反应性和特异性,并使用构建好的蛋白进行检测。结果:经PCR扩增得到目的基因,菌落PCR提示重组表达质粒构建成功,经IPTG诱导后pET41a-GST-SmD1-6*His重组蛋白在感受态大肠埃希菌OverExpressC41(DE3)中高效表达,SDS-PAGE显示GST-SmD1-6*His重组蛋白以包涵体形式表达,WB示重组蛋白有足够的免疫原性,能与人血清中的抗Sm抗体发生特异性反应,与常见的自身抗体无交叉反应。且使用复方黄芪颗粒治疗后抗Sm抗体含量有所降低。结论:成功构建中西医特异临床指标的系统性红斑狼疮的抗Sm抗体蛋白,该蛋白具有免疫原性和免疫反应性。可为后续该指标在中西医结合诊断运用中提供高质量的蛋白。     

重组人参脂质转运蛋白表达载体构建及抗疫病活性研究

目的研究人参脂质转运蛋白(Lipid transfer protein,LTP)对人参疫病菌的抑制作用。方法采用RT-PCR技术克隆人参LTP基因,构建表达载体,并转化到大肠杆菌中,IPTG诱导表达。采用Ni–NTA亲和层析纯化目的蛋白,纸片扩散法验证目的蛋白的抗菌活性。结果人参LTP基因全长为363个碱基,编码120个氨基酸;目的蛋白经纯化后,SDS-PAGE电泳检测为单一条带;抑菌试验表明,重组LTP可明显抑制人参疫病菌丝的生长。结论人参LTP对人参疫病菌具有显著抑制作用。     

天花粉蛋白突变体的构建及其与重组天花粉在原核系统中的表达和纯化

目的:对天花粉蛋白(TCS)的第120-123位氨基酸进行缺失突变,并在原核系统中对其进行表达和纯化。方法:利用重叠延伸PCR的方法得到TCS突变体cDNA,并克隆入原核表达载体pET-28(a+)。酶切和测序鉴定后,将突变体质粒pET-28(a+)-mTCS转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导表达后,对表达产物用Ni2+-NTA亲和层析柱进行纯化和Western-blot鉴定。结果:利用重叠延伸PCR成功获得突变天花粉蛋白的编码序列,并构建pET-28(a+)-mTCS原核表达质粒。在BL21(DE3)菌中,突变体蛋白(mTCS)可被IPTG诱导性表达,并被Ni2+-NTA树脂有效纯化。结论:本实验成功获得一种突变体TCS,并建立该突变TCS的原核表达和纯化的实验方法。     

肠致病性大肠埃希菌EspB基因的体外诱导表达研究

目的:研究肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)EspB基因的体外诱导表达情况,获得纯化的EspB蛋白。方法:体外构建重组质粒pET-28a-EspB,转化BL21感受态细菌培养,提取重组质粒并行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。重组质粒pET-28a-EspB经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹试验(Western blot)分析。pET-28a-EspB表达产物再次经纯化,获得的纯化蛋白进一步经SDS-PAGE和蛋白质Western blotting分析验证。结果:经双酶切和测序验证pET-28a-EspB重组质粒构建成功。pET-28a-EspB重组质粒经IPTG诱导后,在诱导表达不同时间点,培养菌液、沉淀和上清中均有良好的蛋白表达。经SDS-PAGE和蛋白质Western blotting分析验证我们获得了纯化的EspB蛋白。结论:体外可成功诱导EPECEspB蛋白稳定高效表达并获得纯化EspB蛋白产物。     

TAT-NDPK-A蛋白的构建表达及穿膜初步研究

 目的构建pET-TAT-nm23-H1质粒,表达TAT-核苷二磷酸激酶A(TAT-nucleoside diphosphate kinase A,TAT-NDPK-A)融合蛋白,并研究融合蛋白穿膜进入A549细胞。方法人工合成编码TAT蛋白转导区域的11个氨基酸序列于NDPK-A引物的上游,PCR扩增后将融合基因克隆到pET28(a)原核表达载体上,经IPTG诱导表达、镍离子树脂色谱纯化TAT-NDPK-A蛋白,Westen-blot鉴定分析重组蛋白的抗原性,将TAT-NDPK-A蛋白加入到A549细胞中,荧光免疫组化检测蛋白穿膜进入细胞内。结果TAT序列与NDPK-A正确融合并插入pET28(a)载体上,经诱导表达纯化成功获得纯度为97%的TAT-NDPK-A蛋白,在培养的A549细胞中加入重组蛋白4 h后在细胞内检测到穿膜的蛋白。结论构建表达TAT-NDPK-A蛋白,TAT序列能够引导重组蛋白穿过细胞膜进入细胞内,为进一步研究基因的功能奠定了基础。     

地黄RgGGPPS2基因克隆、生物信息学分析及表达分析

目的为了研究地黄萜类化合物生物合成途径的功能基因,从地黄中克隆了一条新的地黄GGPPS基因(RgGGPPS2),进行生物信息学分析,原核表达、纯化以及基因表达模式分析。方法根据地黄转录组数据中RgGGPPS2基因的序列信息,设计特异性引物,克隆了RgGGPPS2基因的开放阅读框(ORF)序列,构建pET32a-RgGGPPS2原核表达载体,用IPTG在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达RgGGPPS2重组蛋白,荧光定量PCR检测RgGGPPS2基因的组织特异性表达。结果 RgGGPPS2基因的ORF为867 bp,编码289个氨基酸。生物信息学分析结果发现RgGGPPS2蛋白含有2个富含天冬氨酸的基序FARM(first aspartate-rich motif)和SARM(second aspartate-rich motif),RgGGPPS2与芝麻、长春花等双子叶植物中GGPPS蛋白的同源性较高。通过构建pET-32a-RgGGPPS2原核表达载体在大肠杆菌中成功表达RgGGPPS2重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱得到了纯化的RgGGPPS2重组蛋白。荧光定量PCR结果显示RgGGPPS2基因在根中表达量最高,其次是叶,茎中最低。结论克隆了RgGGPPS2基因,获得了纯化的RgGGPPS2重组蛋白,为研究RgGGPPS2基因在地黄萜类化合物生物合成途径中的功能奠定了基础。     

苦豆子SaLDC密码子偏好性分析、优化及原核表达

目的研究苦豆子SaLDC密码子偏好性、优化及原核表达。方法运用EMBOSS在线程序中的CHIPS、CUSP和CodonW软件分析SaLDC密码子的偏好性,根据大肠杆菌密码子的偏好性对SaLDC密码子进行优化,并将优化后的基因命名为optSaLDC;构建重组表达载体pET?28a(+)?optSaLDC,转化大肠杆菌BL21(DE3);IPTG诱导SaLDC蛋白表达,并对表达蛋白进行质谱分析。结果SaLDC有28个密码子的RSCU值>1.00,偏好使用以A/T结尾的密码子;SaLDC的密码子使用偏好性与拟南芥最接近,与大肠杆菌差别最大。优化后的optSaLDC在大肠杆菌中最佳表达条件为IPTG浓度1.0 mmol/L,诱导温度15℃,诱导时间16 h。LC?MS/MS鉴定诱导得到的SaLDC蛋白分子质量为48990.51 Da。结论诱导获得的optSaLDC纯化蛋白可用于后续体外SaLDC酶活性分析,为深入研究该基因的功能提供依据。     

抗表皮生长因子受体的单链抗体ER(Fv)的构建及其抗肿瘤活性研究

 目的 利用大肠杆菌表达抗表皮生长因子受体（EGFR）的单链抗体并对其抗肿瘤活性进行研究。方法 构建含有抗EGFR单链抗体基因片段的重组质粒,IPTG诱导大肠杆菌表达单链抗体ER(Fv),用Ni离子亲和柱纯化单链抗体。ELISA测定ER(Fv)与纯EGFR抗原的结合能力;流式细胞术分析ER(Fv)与肿瘤细胞的结合;MTT法检测ER(Fv)对肿瘤细胞体外增殖的影响;动物试验测定ER(Fv)的体内抑瘤效果。结果 应用基因工程菌表达带有组氨酸标签肽 （His-tag） 的单链抗体ER(Fv),相对分子质量约为27×103,主要以包涵体形式存在,收获量约为10 mg·L-1。ELISA测定ER(Fv)与纯EGFR抗原的亲和常数为4.0×107 L·mol-1。单链抗体能与肿瘤细胞表面的EGFR发生特异性结合,其与3种EGFR高表达肿瘤细胞的解离常数皆为10-7 mol·L-1。细胞增殖实验显示,单链抗体可抑制EGFR高表达肿瘤细胞的增殖。体内抑瘤实验表明,单链抗体对人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤具有中度的生长抑制作用,5,10和20 mg·kg-1 3个剂量组35 d的抑瘤率分别为43.9%、46.7%和54.8%,与对照组相比存在显著差异。结论 成功地表达了抗EGFR单链抗体ER(Fv),其对肿瘤细胞具有良好的亲和力和一定的生长抑制作用,为研制靶向EGFR的抗体药物提供基础。     

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??OBJECTIVE To investigate apoptosis induction ability of hPP10-Apoptin fusion protein to mouse B16 melanoma cell. METHODS pET15b-hPP10-Apoptin expression plasmid was constructed, and E. coli BL21 (DE3) was transformed with the plasmid, then the yielded hPP10-Apoptin fusion protein was purified by Ni-NTA His-Bind Resin and confirmed by Western blotting assay. Melanoma cell apoptosis induced by hPP10-Apoptin fusion protein was analyzed by TUNEL assay, and the antitumor effect was examined in melanoma cell-bear mouse model. RESULTS hPP10-Apoptin fusion protein was highly expressed in BL21 cells, Western blotting analysis result showed that fusion protein was expressed correctly. The fusion protein can induce melanoma cell apoptosis in vivo and in vitro. CONCLUSION The results confirm that hPP10-Apoptin fusion protein could penetrate into melanoma cell and also has antitumor effect.     

细胞穿膜肽融合蛋白PEP1-vMIP-Ⅱ促进血管增生研究

 目的 构建细胞穿膜肽PEP-1与vMIP-Ⅱ融合基因的表达质粒,原核表达、纯化并鉴定PEP1-vMIP-Ⅱ融合蛋白,鉴定该蛋白的穿膜功能,研究其对血管增生相关基因表达的影响。方法 将化学合成的细胞穿膜肽PEP1和vMIP-Ⅱ基因克隆到原核表达载体pET15b,构建pET15b-pep-1-vMIP-Ⅱ质粒。表达纯化后,Western-blot 鉴定蛋白,荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白的穿膜功能。Real time PCR检测该蛋白作用对HMEC-1细胞内血管增生相关基因表达的改变。结果 DNA测序和酶切结果鉴定了pET15b-PEP1-vMIP-Ⅱ载体构建正确,Western blot鉴定纯化的融合蛋白PEP1-vMIP-Ⅱ与所预测相对分子质量相符。激光共聚焦显微镜检测到该蛋白能够进入细胞,在HMEC-1细胞内上调了促血管增生基因VEGFA和VEGFC的表达。结论 成功构建了pET15b-PEP1-vMIP-Ⅱ载体,表达纯化的PEP1-vMIP-Ⅱ融合蛋白具有穿透细胞膜的功能,且能显著上调促进血管增生基因VEGFA和VEGFC的表达。     

鲨肝活性肽S-8300的克隆、分泌表达及重组产物活性研究

 目的 研究鲨肝活性肽S-8300的克隆、分泌表达及重组产物活性。方法 根据从鲨鱼肝脏中分离纯化到的S-8300的N端氨基酸序列，设计了一套简并引物，利用RT-PCR方法从再生鲨肝组织的总RNA中扩增到一条cDNA片段，大小为342 bp。结果 根据序列分析及氨基酸序列推测的结果，表明这个cDNA片段的N端与S-8300 N端15个氨基酸序列完全一致，gene bank 和NCBI的搜索结果表明这个cDNA片段是一个新的序列。将这个cDNA片段插入到信号肽pelB基因下游，成功构建了原核分泌表达质粒pET22b-S，将该质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)中成功构建了工程菌pET22b-S/BL21(DE3)。通过对重组菌诱导条件（诱导温度、诱导剂IPTG的浓度）的筛选，SDS-PAGE分析，结果表明，在25 ℃，0.4 mmol·L-1 IPTG诱导条件下，rS-8300在信号肽pelB引导下能够高效的分泌至周质腔中。结论 活性研究表明，该分泌表达产物具有与天然S-8300相似的减轻链脲霉素对NIT-1细胞损伤的作用。     

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??OBJECTIVE To prepare green fluorescent protein-hemagglutinin A-cervical cancer(GFP-HA-PTP) fusion protein trageting HPV transformed cervical cancer cells with endosome escape capability, and further investigate its penetrating ability for cervical cancer cell lines. METHODS pET15b-GFP-HA-PTP expression plasmid was constructed, and E. coli BL21 (DE3) was transformed with the plasmid, then the yielded GFP-HA-PTP fusion protein was purified by Ni-NTA His-Bind resin and conformed by Western blotting assay. Specific penetrating analysis of GFP-HA-PTP was performed under fluorescence microscopy. RESULTS GFP-HA-PTP fusion protein was highly expressed in BL21 cells. Western blotting analysis result showed that the fusion protein was expressed correctly. The fusion protein can selectively penetrate into cervical cancer cell lines Siha and Caski with endosome escape efficiently. CONCLUSION GFP-HA-PTP can specificly penetrate into cervical cancer cell lines after endosome escaping with high efficiency.
     

BAP-SRC-1融合蛋白的表达及其在药物代谢酶调控研究中的应用

 目的获得活性表达的细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase,BAP)基因和人甾体受体辅活化因子-1(steroid recep- tor coactivator-1,SRC-1)的融合蛋白,应用于辅活化因子与核受体的结合研究。方法从Escherichia coli JM83基因组和人肝总RNA中分别扩增获得BAP基因和SRC-1的186个氨基酸对应的基因序列(简称SRC186)。用重组技术,构建BAP-SRC186- pET28a融合基因表达载体,在Escherichia coli Rosetta(DE3)中,以IPTG低温诱导表达。以对硝基苯磷酸盐(p-nitrophenyl-phos- phate,PNPP)为底物进行活性测定。活性表达的BAP-SRC186融合蛋白被应用于辅活化因子与核受体的结合研究。结果获得可溶性融合蛋白BAP-SRC186。该融合蛋白的BAP比活为(0.176±0.013 4)μmol·min^-1·mg(pro)^-1 在利福平存在的情况下,BAP-SRC186能与孕烷X受体配体结合域(pregnane X receptor ligand binding domain,PXRLBD)发生利福平剂量依赖性的相互作用,作用强度通过BAP的显色反应可方便地检测结论BAP融合蛋白与核受体的结合研究为药物代谢酶调控的体外研究开辟了新的思路。     

Rho激酶抑制剂的高通量筛选模型建立与应用

 目的 建立重组人Rho激酶（Rho-associated coiled-coil forming protein kinase， ROCK）的表达、纯化方法，并建立基于荧光素酶发光法的ROCK抑制剂的高通量筛选（high throughput screening， HTS）模型，通过大规模筛选发现其选择性抑制剂，为心脑血管、神经系统等疾病的预防和治疗提供新的治疗策略。方法 用分子生物学的技术，构建ROCK-Ⅰ/pET32a表达质粒，转化入大肠杆菌BL21中，筛选阳性克隆，诱导目的蛋白表达。纯化可溶性蛋白后，用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay进行活性鉴定，用Z’因子评价HTS方法的稳定性，并对3万个化合物和中药提取物进行了HTS。结果 重组人ROCK-Ⅰ蛋白显示较好的激酶活性，建立的HTS模型Z’因子为0.75，基于此模型筛选出4个活性化合物和5个活性提取物。结论 本实验建立了一个简单而快速的人重组ROCK-Ⅰ表达系统，该系统具有低成本、稳定、表达量大等特点。ROCK-Ⅰ的化学发光检测方法适用于HTS技术，具有较高的稳定性、灵敏性和可重复性。