用RT-PCR方法检测登革病毒E基因核酸

目的：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术建立检测登革2型病毒E基因的方法。方法：分别抽提登革2型病毒NGC株和从登革出血热病人血清中分离得到的2型登革热病毒(DV)核酸(RNA)，合成CD-NA第一链，经过RT-PCR得到cDNA产物，用HinfI限制性内切酶酶切鉴定。结果：通过RT-PCR检测登革2型病毒核酸。结论：登革2型病毒E基因核酸的RT-PCR检测方法的建立为快速诊断登革病毒感染提供了可靠的方法。     

聚合酶链反应和原位杂交检测畸胎组织巨细胞病毒DNA

聚合酶链反应和原位杂交检测畸胎组织巨细胞病毒ＤＮＡ左丽郭辉玉为进一步探讨巨细胞病毒（ＣＭＶ）与胎儿畸形相关性及其致畸机制，我们采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和原位杂交检测了畸胎组织巨细胞病毒（ＣＭＶ）ＤＮＡ。一、对象和方法１．标本来源：１０例畸胎由贵州省...     

Polymorphic distribution of Y-chromosome haplotype and mitochondrial DNA in the Bouyei people in China

In the evolution of humans, many kinds of mutations in the human genome have been accumulated, providing credible genetic evidence for the study of human origins and migrations. The "out-of-Africa" hypothesis of modern human evolution and the genetic origin of the Japanese has come about by studying mitochondrial DNA.l,2 Recently, researchers have recognized the power of Y-chromosome markers in resolving migratory patterns of modern humans as more and more Y-chromosome single nucleotide polymorphism markers have been found. The markers on the nonrecombinant part of the Y-chromosome allows for the reconstruction of intact haplotypes which are probably the best genetic tools to study human migrations. We can analyze the paternal history of some people in different areas by Y-chromosome haplotypes.     

贵州白纹伊蚊对登革病毒易感性的研究

目的 用细胞、分子生物学技术进行贵州省白纹伊蚊不同地理株对登革病毒(DEN)易感性的研究。方法 采集贵州省9个地(州)市共计15个县(区)白纹伊蚊幼虫标本，饲养为成蚊；取羽化后3～5日龄期的贵州不同地理株白纹伊蚊，用不同型别的DEN分别经口连续感染3d，于首次感染后的4、7、10、14d收集感染成蚊标本；制备蚊悬液，碘化钠法提取RNA，用DENNS1基因区通用引物经逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)检测DEN核酸；蚊悬液接种C6／36细胞进行病毒分离，制作细胞抗原片，经间接免疫荧光法检测DEN抗原；同时感染白纹伊蚊海南株作为对照。结果 DEN1-4型国际参考株感染白纹伊蚊贵州省不同地方株，其感染比率分别为12／15、12／15、8／15和13／15。结论 白纹伊蚊贵州省不同地方株对DEN1-4型国际参考株普遍易感，表明贵州省具备引起登革热流行的条件。     

定量PCR检测黄芪A6组分与无环鸟苷联合抗1型单纯疱疹病毒的协同作用

目的 :探讨抗疱疹病毒药物黄芪A6 组分(A6)和无环鸟苷(ACV)联合抗 1型单纯疱疹病毒(HSV1 )的作用机制。方法 :利用竞争PCR检测A6 和ACV联合抗HSV1 的协同作用 ,并与细胞病变(CPE)抑制法进行比较。结果 :竞争PCR测定A6、ACV和A6 ACV对HSV1 的最小抑制浓度(MIC)分别为 1 88mg/ml、3 3 7μg/ml和 0 47mg/ml 0 84μg/ml;CPE抑制法测定A6、ACV和A6 ACV对HSV1 的MIC分别为 6 2 5mg/ml、5 0 μg/ml和 0 94mg/ml 1 2 5 μg/ml;联合抑制指数的分数(FICI)均小于 0 5 ;显示明显的联合协同抑制作用。结论 :定量PCR是筛选抗病毒药物的有效方法 ;结果还表明A6 和ACV对HSV1 的抑制作用主要表现在病毒增殖周期的复制阶段。     

髓母细胞瘤组织MEF2C表达与预后相关性分析

目的：探讨肌细胞增强因子2C（myoeyte enhancer factor2C，MEF2C）表达情况与髓母细胞瘤患者预后的关系。方法：选取3家三级甲等医院2001-01—01—2007—12-31病理确诊的髓母细胞瘤患者56例，其中泰安市中心医院12例．齐鲁医院26例，山东省立医院18例；对照组脑组织取自泰安市中心医院2010-01-01-2010—12—3112例非肿瘤脑外伤患者。免疫组织化学法检测56例髓母细胞瘤患者肿瘤组织和12例非肿瘤患者脑组织中MEF2C的表达；收集髓母细胞瘤患者临床资料，应用统计学方法对髓母细胞瘤患者进行生存分析。结果：髓母细胞瘤患者肿瘤组织MEF2C相对高表达率为53．6％（30／56），非肿瘤患者脑组织MEF2C相对高表达率为0（0／12），两组比较差异有统计学意义，χ2=11．50，P=0．001；肿瘤患者肿瘤组织MEF2C相对高表达组与相对低表达组间生存时间的差异有统计学意义，χ2=4．34，P=0．037。MEF2C相对高表达（p=0．023）、肿瘤转移（P=0．042）与患者3年生存率降低显著有关，而患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位与患者3年生存率无关，P值均〉0．05。结论：MEF2C在患者肿瘤组织中的高表达可降低患者3年生存率，是患者预后不良的危险因素之一。     

DEN2对鼠源性DC TLR7、MyD88、NF-κB的表达与细胞因子分泌的影响

目的:观察登革2型病毒(DEN2)感染鼠源性DC后TLR7、MyD88、NF-κB的表达及IFN-α、IP-10的分泌变化,探讨MyD88依赖型信号通路在DEN2感染中的作用.方法:rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导C57BL/6小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC),常规方法增殖鉴定DEN2,利用DEN2(MOI =0.4)感染BMDC,直接免疫荧光检测DEN2吸附鼠源性BMDC:Western blot检测感染后不同时间TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表达.双抗体夹心ELISA法检测感染后不同时间细胞培养上清IP-10、IFN-α的水平,RT-PCR检测相应时间点被感染DC内DEN2 NS5核酸水平.结果:rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导C57BL/6小鼠BMDC,5天后获得纯度为70％的相对未成熟DC;与对照组相比DEN2感染BMDC后24小时TLR7、MyD88、NF-κB的表达升高;48小时TLR7表达低于正常对照组,但MyD88、NF-κB的表达高于正常对照组;72小时DEN2感染组TLR7、MyD88、NF-κB的表达均较前降低,且TLR7、MyD88的表达低于正常对照组.DEN2感染组细胞培养上清IFN-α、IP-10的水平明显高于正常对照组,IFN-α逐渐升高,72小时分泌量达最高,可分泌(933.94 ±29.02) pg/ml; IP-10在48小时分泌达高峰,分泌量为(834.44 ±43.60) pg/ml,结果具有统计学意义(P＜0.05),且被感染DC内DEN2 NS5病毒核酸水平48小时达最高,72小时有所降低.结论:DEN2可影响小鼠BMDC TLR7、MyD88、NF-κB的表达,促进其分泌IFN-α、IP-10进而影响病毒复制.     

改良人原代脐静脉内皮细胞的分离及鉴定

目的:优化人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的分离及培养方法。方法:在传统HUVECs分离的基础上进行改进,通过Ⅰ型胶原酶消化分离HUVECs,利用倒置显微镜观察其生长状况、免疫组织化学方法及流式细胞术检测所培养细胞的纯度。结果:改良实验步骤和精简操作后,HUVECs分离不受影响,分离的HUVECs在体外2~4 d可长成单层,倒置显微镜下可见细胞呈"鹅卵石"状排列,Ⅷ因子免疫组化实验阳性,流式细胞术检测细胞纯度达99.37%。结论:用胶原酶消化法分离HUVECs具有培养周期短,所获得的HUVECs纯度较高的优点,有利于体外血管内皮细胞模型的建立。     

伴慢性HCV感染海洛因依赖者血清中不同亚类T淋巴细胞产生主要细胞因子水平的观察

研究海洛因依赖者伴慢性HCV感染机体的免疫功能有现实意义.细胞因子作为细胞间信号传递分子,主要参与调节免疫应答、免疫细胞分化发育、介导炎症反应等,细胞因子含量测定可作为了解机体免疫功能的一项重要指标.对伴慢性HCV感染海洛因依赖者这一特殊人群的免疫功能从不同亚类T淋巴细、Th1、Th2、Th3、Th9、Th17)产生主要细胞因子(IFN-γ、IL-4、TGF-β1、IL-9、IL-17)水平进行研究,国内罕见报道.     

登革2型病毒NGC株E基因部分序列原核蛋白表达

目的:构建登革2型病毒NGC株E基因区1～476 bp的原核表达载体并进行原核表达.方法:将登革2型病毒NGC株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+),命名为pET28a(+)-En;经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western印迹鉴定表达蛋白;对表达蛋白进行纯化,并滴定对C6/36细胞的TCID50.结果:(1)成功构建了pET28a(+)-En原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,相对分子量约为23 kD,表达量约占菌体总蛋白的29%;Western印迹表明该目的蛋白可与登革2型病毒鼠单克隆抗体结合;(2)用Ni柱亲和层析法纯化原核表达蛋白,纯度达90%;(3)DEN-2 NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-4.88/0.1 ml.结论:pET28a(+)-En可在BL21(DE3)菌株中高效表达,DEN-2 NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞有一定的细胞毒作用.