丹参酮ⅡA诱导白血病细胞凋亡过程中端粒酶活性的改变

目的:观察丹参酮ⅡA(TanⅡA)对HL-60,K562细胞端粒酶活性的抑制作用和对凋亡相关基因的影响,探讨丹参酮ⅡA对造血细胞的作用机理.方法:以HL-60,K562为靶细胞,应用细胞培养技术,流式细胞术,透射电镜观察TanⅡA 对HL-60,K562细胞的作用,利用PCR-TRAP方法检测TanⅡA处理前后HL-60,K562细胞端粒酶活性的改变.结果:经0.5 μg·mL-1 TanⅡA 作用6 d后,HL-60,K562细胞生长明显受到抑制,生长抑制率分别为75.6%和56.3%.经丹参酮诱导后,HL-60 ,K562细胞发生凋亡,出现亚二倍体峰;同时显著下调HL-60及K562细胞的c-myc ,bcl-2基因表达,上调c-fos基因表达.HL-60,K562细胞在TanⅡA作用后,端粒酶活性受到抑制,端粒酶活性抑制率分别为30.8%,50.8%.结论:TanⅡA可明显抑制HL-60和K562细胞的增殖和细胞端粒酶活性,并诱导细胞凋亡.     

基于网络药理学及体外实验验证探究丹参治疗膀胱癌的分子机制

目的 基于网络药理学预测丹参治疗膀胱癌（BC）的潜在作用靶点及可能相关的信号通路，并通过体外细胞实验验证其潜在的分子机制。方法 应用中药系统药理数据库（TCMSP）筛选中药丹参活性成分；运用GeneCards和在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）获取BC疾病靶点；通过Venny 2.1工具整合丹参治疗BC的潜在靶点并绘制韦恩图；STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络；DAVID数据库进行基因本体（GO）富集分析及京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析；细胞增殖与活性检测-8（CCK-8）法检测丹参酮Ⅱ_A（Tan Ⅱ_A），隐丹参酮（CPT），木犀草素（LUT）分别以不同浓度（0、1、2、4、8、16、32 μmol·L^-1）对膀胱癌T24、5637细胞的增殖抑制活性；碘化吡啶（PI）染色法分析Tan Ⅱ_A、CPT及LUT（0、4、8 μmol·L^-1）诱导5637细胞凋亡；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Tan Ⅱ_A（0、4、8、16 μmol·L^-1）对关键靶点蛋白表达的调控。结果 筛选结果显示丹参65个活性成分，39个丹参-BC共同作用靶点，KEGG通路富集分析主要包含神经元-配体-受体的相互作用、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号传导途径、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抗性、缺氧诱导因子（HIF）-1信号通路等。CCK-8结果表明，与空白组比较，Tan Ⅱ_A、CPT及LUT均能明显抑制BC细胞T24和5637细胞的增殖（P<0.05），且3个药物均对5637细胞的增殖抑制作用更为显著；同时在5637细胞系中，Tan Ⅱ_A组的半抑制浓度（IC₅₀）明显低于CPT及LUT组（P<0.05）。PI染色结果显示，与空白组比较，Tan Ⅱ_A、CPT及LUT均能诱导5637细胞凋亡，诱导凋亡程度由高到低依次为Tan Ⅱ_A、CPT、LUT（P<0.05）。Western blot实验表明Tan Ⅱ_A作用于5637细胞后能降低表皮生长因子受体（EGFR）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K），磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）蛋白表达水平，且呈浓度依赖性。结论 丹参治疗BC具有多成分、多靶点、多通路的特点，其作用机制可能与下调EGFR、p-PI3K，p-Akt蛋白的表达，进而抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡有关。     

前体化合物和诱导子对丹参酮ⅡA和原儿茶醛合成的优化研究

 目的研究3种前体化合物和几种非生物诱导子对丹参(Salvia miltiorrhizaBge)不定根生长及其有效成分含量丹参酮Ⅱ_A和原儿茶醛的影响。方法通过添加前体化合物和诱导子两阶段培养丹参不定根,探讨其对丹参不定根生长和丹参酮Ⅱ_A、原儿茶醛含量的影响。结果培养第0天饲喂前体化合物,发现添加1.0 mmol·L^-1乙酸钠、0.5 mmol·L^-1酪氨酸和0.5 mmol·L^-1乙酸钠分别得到了最高的丹参不定根增殖倍数、丹参酮Ⅱ_A含量和原儿茶醛含量。培养第16天各种非生物诱导子处理,发现超声处理丹参不定根产量和原儿茶醛含量明显增加;1.0 mg·L^-1水杨酸促进丹参酮Ⅱ_A合成;高盐和高糖促进丹参不定根生长和次生代谢物合成;硝酸银和硝酸镧促进丹参酮Ⅱ_A合成,但抑制了原儿茶醛合成。结论前体物和诱导子两阶段培养对于丹参酮Ⅱ_A和原儿茶醛合成有显著影响。     

三七皂苷R1对Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

目的: 探讨三七皂苷R₁对Aβ_1-42诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护机制. 方法: MTT法检测细胞存活率;PI/Annexin V双染流式细胞术分析细胞凋亡率;Western blot法检测细胞中Bax,Bcl-2的表达;ELISA法检测caspase-3,caspase-8及caspase-9的酶活性. 结果: 6.25,12.5,25,50,100 nmol·L^-1的三七皂苷R₁对Aβ_1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡均有一定保护作用,并呈剂量依赖关系;PI/Annexin V双染流式细胞术检测结果表明Aβ_1-42可诱导SH-SY5Y细胞发生凋亡,6.25~100 nmol·L^-1的三七皂苷R₁可显著降低细胞凋亡率.Western blot结果显示,6.25~100 nmol·L^-1的三七皂苷R₁可下调Bax表达,上调Bcl-2表达;ELISA分析显示不同剂量的三七皂苷R₁可抑制Aβ_1-42诱导的SH-SY5Y细胞caspase-3和caspase-9的激活,但对caspase-8的激活没有影响. 结论: 三七皂苷R₁通过抑制线粒体相关的凋亡通路激活,减少Aβ_1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡.     

反相高效液相色谱法测定藿贞胶囊中丹参酮ⅡA的含量

 目的 测定藿贞胶囊中丹参酮Ⅱ_A的含量。方法 用反相高效液相色谱法,流动相为甲醇-水（70∶30）,紫外检测波长270 nm,流速1.4 ml·min^-1。结果 丹参酮Ⅱ_A对照品在0.7～41.6 mg·L^-1浓度内线性关系良好,r=0.9994。平均加样回收率96.1%,RSD为2.2%。结论 该法简便,分离完全,结果可靠,适用于丹参酮Ⅱ_A的测定。     

芹菜素与丹参酮ⅡA的协同抗肿瘤作用及机制

目的 研究芹菜素（Api）和丹参酮Ⅱ_A（Tan Ⅱ_A）联用对多种肿瘤细胞的协同抗肿瘤作用，并揭示其发生协同作用的机制。方法 以人胃癌BGC823细胞、人乳腺癌MCF7细胞、人肝癌SMMC7721细胞为研究对象，采用MTT法检测Api和Tan Ⅱ_A联用对细胞的增殖抑制作用；采用AV-PI双染法、PI染色法检测药物对BGC823细胞凋亡、细胞周期的影响；免疫印迹法检测BGC823细胞凋亡相关蛋白p53、BAX/BCL-2和周期蛋白B1、D1的表达；圆二色和DNA熔点法检测药物与DNA结合情况；S180荷瘤鼠模型检测药物的抑瘤效果。结果 Api与Tan Ⅱ_A联用对BGC823等肿瘤细胞的增殖有协同抑制作用，联用指数CI在0.28左右。两药联用显著增加了细胞凋亡（P<0.01），上调了胞内BAX/BCL-2比值（P<0.01）；周期蛋白水平发生变化，细胞周期阻滞在S期得到强化。两药与DNA以两种不同方式结合，DNA热变性曲线显著改变。体内抑瘤实验证明与单药相比，两药联用荷瘤鼠肿瘤体积和肿瘤质量均显著降低（P<0.01），抑瘤效果与环磷酰胺相当，但不良反应较小。结论 Api与Tan Ⅱ_A联用具有协同抗肿瘤作用；药物与DNA以不同的方式结合，加剧了细胞周期的阻滞，是二者产生协同作用的核心机制。     

丹参酮ⅡA和丹酚酸B不同配比对HL-60细胞生长抑制及诱导凋亡的研究

目的:观察不同配比的丹参酮ⅡA(TanⅡA)和丹酚酸B(SalB)对HL-60细胞的生长抑制及诱导凋亡作用。方法:通过MTT法及流式细胞技术,以生长抑制率和细胞调亡率为指标,研究不同配比的TanⅡA和SalB对HL-60细胞的生长抑制及诱导凋亡作用。结果:TanⅡA与SalB合用组对HL-60细胞的生长抑制率及细胞凋亡率均较单用组高,且以TanⅡA-SalB(10-5μg/ml)组为最高(P<0.05)。结论:TanⅡA和SalB对HL-60细胞均有明显的抑制及诱导凋亡作用,两者配比使用均比单用其一效果显著,且不同配比的效果不同。     

高效液相色谱法测定丹参酮滴耳液中4种丹参酮成分含量

 目的 利用梯度洗脱，建立高效液相色谱测定丹参酮滴耳液中二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅱ_A含量的方法。方法 采用高效液相色谱法。Intersil C₁₈分析色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm），流动相为乙腈-10%乙腈梯度洗脱，流速1.6 mL·min^-1,检测波长254 nm。结果 二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅱ_A保留时间分别为11.9，19.2，21.3和28.5 min,与各自相邻峰的分离度均大于1.5，理论板数分别为3?310，4 278，3 624和20 677。二氢丹参酮Ⅰ平均回收率为101.3%，RSD=2.2%，隐丹参酮平均回收率为97.2%，RSD=2.2%，丹参酮Ⅰ平均回收率为102.1%，RSD=3.0%，丹参酮ⅡA平均回收率为99.5%，RSD=1.9%。二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅱ_A最低检出浓度分别约为0.6，0.9，0.6和0.3 μg·mL^-1。结论 本法操作简便,测定结果准确可靠，可用于丹参酮滴耳液中二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅱ_A的含量测定。     

乐脉分散片中3种活性成分的溶出度比较

目的: 建立同时测定乐脉分散片中丹酚酸B、丹参酮Ⅱ_A与阿魏酸含量的方法并考察三者的溶出特点。方法: 采用HPLC同时测定丹酚酸B、丹参酮Ⅱ_A与阿魏酸含量,色谱条件为Alltima^TM ODS C₁₈色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相乙腈-0.5%冰乙酸梯度洗脱,流速1.0 mL·min^-1,检测波长分别为320(0~10 min),286(10~20 min),270(20~30 min) nm,柱温30℃,进样量20 μL。采用小杯法测定体外溶出度,以0.1 mol·L^-1 HCl为溶出介质,转速50 r·min^-1,取样时间60 min,考察不同时间内丹酚酸B、丹参酮Ⅱ_A与阿魏酸的累计释放度,通过相似因子(f2)法对各成分的溶出度曲线进行相似性比较。结果: 丹酚酸B、丹参酮Ⅱ_A、阿魏酸的线性范围分别为30.15~301.48,0.15~1.52,0.66~6.55 mg·L^-1。以丹酚酸B为参比,乐脉分散片中丹参酮Ⅱ_A与阿魏酸的f2分别为70.35,82.49。结论: 乐脉分散片中丹酚酸B、丹参酮Ⅱ_A与阿魏酸具有相似的溶出特点。     

丹参酮IIA对阿霉素耐药人乳腺癌细胞的多药耐药逆转作用及机制研究

目的 研究丹参酮II_A对阿霉素耐药人乳腺癌细胞MCF-7/ADR的多药耐药逆转作用及相关机制。方法 分别用丹参酮II_A、阿霉素、阿霉素联合丹参酮II_A处理人乳腺癌MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞,采用MTT法检测细胞增殖率;流式细胞术检测丹参酮II_A干预后MCF-7/ADR细胞内阿霉素蓄积量的变化;检测丹参酮II_A干预后MCF-7/ADR细胞三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）消耗量的变化;采用qRT-PCR、Western blotting法检测丹参酮II_A干预后MCF-7/ADR细胞ATP结合转运蛋白B1（ATP-binding cassette transporter B1,ABCB1）、ABCG2和ABCC1基因和蛋白表达的变化。结果 丹参酮II_A显著抑制MCF-7及MCF-7/ADR细胞增殖（P<0.05）,呈剂量相关性;丹参酮II_A能够逆转MCF-7/ADR细胞的多药耐药性（P<0.05）,增加MCF-7/ADR细胞内阿霉素的蓄积（P<0.05）,减少MCF-7/ADR细胞的ATP消耗（P<0.05）,显著下调ABCC1和ABCG2基因和蛋白表达（P<0.05）。结论 丹参酮II_A能够通过调控ABCG2、ABCC1介导的转运,逆转MCF-7/ADR细胞的多药耐药性。     

补骨脂素加长波紫外线光化学疗法诱导HL-60、K562细胞凋亡及对Fas、FasL表达的影响

目的探讨补骨脂素(PSO)加长波紫外线(PUVA)光化学疗法(UVA)诱导人白血病细胞HL-60、K562凋亡及对Fas、FasL表达的影响。方法以HL-60、K562细胞为研究对象,以细胞凋亡率、电镜下细胞超微结构改变以及细胞Fas、FasL在基因、蛋白水平的表达为检测指标,观察PSO加波长为360 nm的UVA对人白血病细胞诱导凋亡的作用以及部分作用途径,并采用多因素方差分析法进行统计学处理。结果PSO、UVA照射及PUVA均可诱导HL-60、K562细胞发生凋亡,PUVA的作用显著强于前两者。电镜下观察经PUVA处理后的HL-60、K562细胞超微结构,可见明显的凋亡形态学改变。PSO、UVA照射及PUVA均可上调HL-60、K562细胞Fas在基因、蛋白水平的表达,下调FasL在基因、蛋白水平的表达,PUVA的作用显著强于前两者。结论PUVA可诱导白血病细胞HL-60、K562发生凋亡,作用强于PSO及UVA照射。PUVA诱导HL-60、K562细胞凋亡的途径之一为上调细胞Fas基因表达水平,下调FasL基因表达水平。     

芒果甙对白血病K562细胞端粒酶活性和凋亡的影响

目的:探讨芒果甙对K562细胞端粒酶活性及凋亡的影响,以进一步研究芒果甙抗白血病作用的分子机制。方法:用光学显微镜及透射电镜观察经芒果甙作用后K562细胞具有的凋亡形态学改变;采用流式细胞仪检测Fas蛋白的表达;采用多聚酶链式反应-酶联免疫测定法(PCR-ELISA)检测白血病细胞端粒酶活性。结果:芒果甙能抑制K562细胞端粒酶活性,随药物浓度增加和利用时间的延长,其抑制作用增强;并能诱导K562细胞凋亡,使Fas蛋白水平上调。结论:芒果甙能显著抑制K562细胞端粒酶活性,其作用可能与诱导细胞凋亡有关。在此过程中,Fas也可能参与了细胞凋亡的调节。     

小檗胺对多药耐药K562/Adr细胞作用的研究

目的研究小檗胺诱导人白血病K562／Adr细胞凋亡及逆转多药耐药的作用及机理。方法采用MTT法测IC50值,流式细胞仪Annexin V FITC-PI法检测细胞凋亡发生率,PI染色法检测凋亡峰及细胞周期,同时以FCM检测Caspase-3、P-GP蛋白表达及细胞内药物积聚能力,RT-PCR法检测mdr-1基因表达。结果小檗胺能抑制人白血病K562／Adr细胞生长且呈剂量依赖关系,并能诱导细胞凋亡,使Caspase-3蛋白表达及细胞药物外排能力增加,同时降低mdr-1基因mRNA和蛋白表达水平。结论小檗胺能激活Caspase-3以诱导人白血病K562／Adr细胞凋亡,同时能通过降低mdr-1表达逆转多药耐药。     

Homoharringtonine-induced apoptosis of human leukemia HL-60 cells is associated with down-regulation of telomerase

Homoharringtonine (HHT), first isolated from the Chinese evergreen Cephalotaxus Harringtonia, has been shown inhibiting activity in leukemia in initial studies in China and in later studies in the US, but the detailed mechanism of action is still unclear. The goal of the experiments shown here is to explore the effect of HHT on the telomerase activity and apoptosis of human leukemia HL-60 cells. The telomerase activity of HL-60 cells was examined by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP)--an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Apoptosis was analyzed by morphological observation, DNA agarose gel electrophoresis, flow cytometry (FCM), and TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL). After treatment with HHT at 5-500 microg/l for 48 hours, the level of telomerase activity in HL-60 cells decreased in a dose-and time-dependent manner. Simultaneously, HL-60 cells underwent apoptosis. In conclusion, our data suggest that HHT can inhibit the telomerase content of HL-60 cells effectively and induce apoptosis.     

Tanshinone IIA Induces Autophagic Cell Death via Activation of AMPK and ERK and Inhibition of mTOR and p70 S6K in KBM‐5 Leukemia Cells

Although tanshinone IIA (Tan IIA) from Salviae miltiorrhizae was known to induce apoptosis in various cancers, its underlying mechanism of autophagic cell death was not reported yet. Thus, in the present study, the molecular mechanism of autophagic cell death by Tan IIA was investigated in KBM‐5 leukemia cells. Tan IIA significantly increased the expression of microtubule‐associated protein light chain 3 (LC3) II as a hallmark of autophagy in western blotting and immunofluorescence staining. Tan IIA augmented the phosphorylation of adenosine monophosphate‐activated protein kinase (AMPK) and attenuated the phosphorylation of mammalian target of rapamycin (mTOR) and p70 S6K in a dose‐dependent manner. Conversely, autophagy inhibitor 3‐methyladenine partly reversed the cytotoxicity and the phosphorylation of AMPK, mTOR and p70 S6K induced by Tan IIA in KBM‐5 leukemia cells. In addition, Tan IIA dramatically activated the extracellular signal regulated kinase (ERK) signaling pathway including Raf, ERK and p90 RSK in a dose‐dependent and time‐dependent manner. Consistently, ERK inhibitor PD184352 suppressed LC3‐II activation induced by Tan IIA, whereas PD184352 and PD98059 did not affect poly (ADP‐ribose) polymerase cleavage and sub‐G1 accumulation induced by Tan IIA in KBM‐5 leukemia cells. Furthermore, Tan IIA could induce autophagy via LC3‐II activation in various cancer cells such as prostate (PC‐3), multiple myeloma (U266), lung (NCI‐H460), and breast (MDA‐MB‐231) cells. Overall, these findings suggest that Tan IIA induces autophagic cell death via activation of AMPK and ERK and inhibition of mTOR and p70 S6K in KBM‐5 cells as a potent natural compound for leukemia treatment. Copyright © 2013 John Wiley & Sons, Ltd.     

莪芪抗瘤方剂对白血病HL-60细胞凋亡的作用及机理研究

目的：研究中药复方莪芪抗瘤方剂在体外对白血病HL-60细胞凋亡影响，并探讨凋亡发生的可能机制。方法：通过血清药理学方法，选择10％浓度的含药血清与白血病HL-60细胞共同培育24、48、72、96h后，应用荧光显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测凋亡峰（亚二倍体峰），用Fura-2荧光负载方法测定细胞内Ca^2＋浓度的变化；比色法检测凋亡相关基因Caspase-3活性变化。结果：10％浓度的含药血清处理组细胞体积缩小，细胞核固缩，膜起泡，核断裂及形成凋亡小体等，以72h最为明显；可见DNA含量低于G1期的凋亡细胞群，这群细胞的凋亡百分率随时间的递增而增加。10％浓度的含药血清处理组的细胞内Ca^2＋浓度也明显高于对照组（P〈0．01），Caspase-3基因活性明显高于对照组相（P〈0．01．P〈0．05）。结论：莪芪抗瘤方剂含药血清诱导白血病HL-60细胞发生凋亡，这种变化可能与细胞内Ca^2＋水平上调，Caspase-3活性增强有关。     

紫草素对白血病细胞HL-60增殖及凋亡作用的影响

目的研究紫草素诱导人早幼粒白血病HL-60细胞凋亡的作用机制。方法 MTT比色法检测紫草素对HL-60细胞增殖的影响;Annexin V/PI分析凋亡率;半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测bcl-2基因水平,分析白血病HL-60细胞凋亡作用与bcl-2表达水平关系。结果紫草素在1～8μg/mL浓度范围内能抑制HL-60细胞的增殖,具有时间和浓度的依赖性。2μg/mL紫草素能够诱导HL-60细胞凋亡,凋亡呈时间依赖性。在2μg/mL紫草素作用下,HL-60细胞bcl-2表达明显下调。结论紫草素能够诱导HL-60细胞凋亡,其作用机制与下调bcl-2表达有关。     

鬼臼酰肼对白血病K562细胞株作用的实验研究

目的:研究鬼臼毒素衍生物鬼臼酰肼对K562白血病细胞的抑制增殖、诱导细胞凋亡作用.方法:采用集落形成实验、MTT比色法观察鬼臼酰肼对K562白血病细胞增殖的影响;流式细胞仪等技术手段研究鬼臼酰肼对K562细胞凋亡的影响.结果:鬼臼酰肼能抑制K562白血病细胞增殖,与对照组相比有显著性差异(P＜0.01),抑制作用与剂量呈显著性正相关.鬼臼酰肼可诱导K562细胞的凋亡,在5.0 μg/ml处理48 h,鬼臼酰肼组凋亡百分率33.5%.结论:鬼臼酰肼具有抗肿瘤活性,鬼臼毒素衍生物的不同结构对抗肿瘤活性有一定影响.     

中华眼镜蛇蛇毒组分C诱导白血病细胞凋亡作用的研究

目的：研究眼镜蛇蛇毒组分Ｃ诱导白血病细胞凋亡的作用及机制。方法：应用光学显微镜透射电镜，脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）电泳，流式细胞仪，逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）等方法，观察白血病细胞经过眼镜蛇蛇毒组分Ｃ处理后，形态学，生物化学及Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ基因表达水平的变化。结果：眼镜蛇蛇毒组分Ｃ能诱导人粒细胞白血病细胞系（ＨＬ６０）发生凋亡形态学和生物化学变化；     

线粒体膜电位在PUVA诱导HL-60、K562细胞凋亡时的变化

目的:研究补骨脂素(PSO)加长波紫外线(UVA)光化学疗法(PUVA)诱导人白血病细胞HL-60、K562凋亡时对线粒体膜电位(ΔΨm)的影响。方法:细胞以不同浓度PSO,接受或不接受UVA照射后共同培养,电镜下观察细胞超微结构改变,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率和线粒体膜电位变化,采用多因素方差分析法进行统计学处理。结果:PUVA处理后的HL-60、K562细胞超微结构出现明显的凋亡形态学改变;PSO、UVA照射及PUVA均可使细胞凋亡率增加,ΔΨm下降,PUVA的作用显著强于前两者(P<0.01)。结论:PUVA可诱导人白血病细胞发生凋亡,诱导凋亡的途径之一为下调线粒体膜电位水平。