星点设计-效应面法优化丹参须根有效成分的酶法提取工艺

目的：研究丹参须状细根中有效成分的酶法提取工艺，同时优化酶解工艺的参数。方法：采用纤维素酶酶解再超声促提来提取丹参须状细根中的有效成分，通过星点设计-效应面法优化酶解参数，并利用多元线性回归和多项式回归建立预测模型。结果：利用优选出的酶解工艺所得到的丹参须状细根提取液中总丹参酮和总丹酚酸的收率较非酶法分别提高了113.92%和30.64%，并且薄层检测表明纤维素酶酶解对提取液中的有效成分无质的影响；同时，建立的数学模型的复相关系数较高，并且通过检验。结论：采用纤维素酶酶解再超声促提的方法可以充分地提取出丹参须状细根中的有效成分，同时，利用多项式回归所建立模型有较好的预测性。     

响应面法优化复合酶提取丹酚酸B的工艺

目的:利用响应面分析法优化纤维素酶和果胶酶复合水解丹参提取得到丹酚酸B的工艺。方法:在单因素试验基础上选取因素与水平,利用SAS分析软件以丹酚酸B得率为相应值,采用四因素三水平的响应面分析法,以获得多元二次线性回归方程选取较优工艺,并进行预测。结果:确定最优工艺条件为纤维素酶与果胶酶的配比为2∶1,复合酶量为68 U,酶解温度38.8℃,酶解pH 3.8,酶解时间0.9 h,提取预测值与理论值的相对误差为1.1%。结论:响应面法优化纤维素酶和果胶酶复合水解丹参提取得到丹酚酸B的工艺,方法简便,可预测性较优。     

单味及复方中药的双频复合超声提取效果对比研究

目的:探讨单味药及复方中药的双频复合超声提取效果差异性.方法:通过利用统计学中的方差及平均值检验的方法对双频复合超声提取单味药丹参、单味药三七和复方丹参三七的效果显著性差异进行检验.结果:双频复合超声提取复方丹参三七和提取单味药丹参及单味药三七的效果具有显著性差异.说明了双频复合超声提取的复方丹参三七的效果优于单独对单味药丹参和单味药三七的提取效果.结论:双频复合超声适合复方丹参三七有效成分的提取.     

须根腐解对丹参根际土壤化感物质的影响北大核心CSCD

目的:研究须根腐解对丹参根际土壤化感物质的影响。方法:采用XAD-4树脂提取并分离纯化丹参根际土壤化感物质,应用GC-MS对化感物质组成进行分析,利用面积归一化法计算各物质相对含量。结果:须根腐解能够使丹参根际土壤提取液中的化感物质的种类和含量明显增加。其中辛酸、乙醛、十六烷为丹参产生的主要化感物质,其相对含量与须根添加量呈正相关。须根腐解促使丹参产生有机酸类(乙酸、辛酸等)、小分子醛(乙醛等)、脂肪酸(十六烷酸等)、烃类(十六烷)、酚酸及衍生物类(邻苯二甲酸等)等一系列化感物质。结论:大田丹参残留须根在腐解后会促使植物产生一系列的化感物质,对丹参连作障碍的形成具有一定的促进作用。     

须根腐解对丹参根际土壤化感物质的影响

目的:研究须根腐解对丹参根际土壤化感物质的影响。方法:采用XAD-4树脂提取并分离纯化丹参根际土壤化感物质,应用GC-MS对化感物质组成进行分析,利用面积归一化法计算各物质相对含量。结果:须根腐解能够使丹参根际土壤提取液中的化感物质的种类和含量明显增加。其中辛酸、乙醛、十六烷为丹参产生的主要化感物质,其相对含量与须根添加量呈正相关。须根腐解促使丹参产生有机酸类(乙酸、辛酸等)、小分子醛(乙醛等)、脂肪酸(十六烷酸等)、烃类(十六烷)、酚酸及衍生物类(邻苯二甲酸等)等一系列化感物质。结论:大田丹参残留须根在腐解后会促使植物产生一系列的化感物质,对丹参连作障碍的形成具有一定的促进作用。     

均匀设计优化纤维素酶解提取三七工艺的研究

目的:应用纤维酶以提高三七中有效成分的提取率,优化三七的提取工艺.方法:采用U6*(6)4均匀设计表[1]选用第1,3例,D值为0.187,以人参皂苷Rg1为指标应用紫外分光光度法测定含量,考察纤维素酶在三七提取工艺中的用量及酶解时间.结果:影响酶解效率的因素大小顺序为酶解时间＞纤维素酶用量＞酶用量与酶解时间的交互作用.前两者的影响呈二次曲线模型而后者呈负相关.最优条件为0.47h,28.6U/g(生药材),预期试验结果最大值为962mg.采用0.5h,30U进行实验,结果总皂苷含量为812.3mg,比同提取条件不加酶工艺提取率提高1.39%.结论:纤维素酶可提高三七中有效成分的提取率,确定酶解工艺为30U/g(生药材),0.5h.     

丹参动态阶段连续逆流提取工艺研究

目的:研究丹参动态阶段连续逆流提取工艺.方法:以丹参素钠、总酚酸含量及固形物收率为指标,对丹参动态阶段逆流提取温度、时间、溶剂用量、提取单元组数等技术参数进行筛选,并与普通温浸、煎煮法进行对比研究.结果:丹参动态阶段连续逆流提取在保证有效成分提取效果的情况下,溶媒用量较温浸法、煎煮法减少2/3,固形物量降低23.9%,同时低温提取有效防止了丹参酚酸类成分的降解或聚合.结论:为对热不稳定的丹参酚酸类有效成分的后续分离纯化创造有利条件.     

酸碱预处理后酶解提升丹参药渣中丹参酮类成分的提取效率研究

通过酸碱预处理丹参药渣,并利用纤维素酶降解,比较不同处理方法对丹参酮类成分提取效率的影响,以期为丹参药渣中丹参酮类成分的开发利用提供科学依据。结果表明,未经酸碱预处理的丹参药渣中,当酶C浓度为6 U·m L~(-1),酶解4.5 d时可使大部分纤维素降解,所得葡萄糖质量分数最高为59.74 mg·g~(-1)。对不同预处理方法评价,发现碱预处理-纤维素酶C降解后的效果最佳,葡萄糖质量分数达119.50 mg·g~(-1),相同浓度纤维素酶C酶解的酸预处理药渣次之。丹参酮的提取量经酶液降解后,与常规非酶法处理相比,丹参酮ⅡA提取量提高了82.54%,质量分数达2.451 mg·g~(-1);丹参酮Ⅰ提取量提高了81.82%,质量分数达2.373 mg·g~(-1);隐丹参酮提取量提高了64.4%,质量分数达1.080 mg·g~(-1);二氢丹参酮Ⅰ提取量提高了61.3%,质量分数达0.601 2 mg·g~(-1)。通过酸碱预处理与纤维素酶降解相结合的方法可有效提高丹参药渣中丹参酮类成分的提取效率,该方法具有可操作性和实用性,有利于提升丹参药渣中丹参酮类资源性化学物质的利用效率。     

酶辅助提取畲药三叶青总三萜的工艺研究

目的:确定酶辅助优化畲药三叶青总三萜提取工艺参数。方法:采用紫外分光光度法对三叶青总三萜进行测定,以总三萜提取率为评价指标。在单因素试验基础上,以酶的种类、酶解pH值、酶解温度、酶解时间、酶添加量为考察因素,通过L9(34)正交试验优化三叶青总三萜提取工艺。结果:酶解提取三叶青总三萜的最佳工艺参数为:纤维素酶添加量为2.5%、酶解温度为45℃、酶解时间为90 min、酶解pH值为5。在此工艺条件下,经放大验证试验,三叶青总三萜提取率为(2.74±0.07)%,RSD为2.17%。结论:正交实验优化的酶辅助提取三叶青总三萜工艺参数合理,可为三叶青三萜类成分的提取利用提供参考。     

复合酶法提取毛脉酸模中有效成分的工艺研究

目的采用复合酶法提取毛脉酸模中有效成分,研究其提取最佳工艺。方法以毛脉酸模根中白藜芦醇苷、白藜芦醇、大黄酚苷、酸模素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚及出膏率为考察指标,采用多指标综合评分和正交设计实验优化复合酶法提取毛脉酸模有效成分的工艺。结果复合酶法提取毛脉酸模有效成分的最佳酶解条件:酶量为3%,酶解时间120min,酶解温度40℃,pH=6。结论验证试验结果表明该提取工艺稳定可行,适用于毛脉酸模有效成分的提取。     

一个新的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶3基因的克隆及其表达分析

目的:对丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3methylglutary CoA reductase,HMGR3)基因的cDNA克隆并进行序列分析。方法:利用丹参转录组文库克隆一种新的丹参次生代谢途径上的功能基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,Clustal W比对丹参中已有的3条HMGR的氨基酸序列,构建系统进化树,QRT-PCR检测丹参HMGR3基因在根、茎、叶中的mRNA水平,并检测Ag+诱导子诱导后丹参毛状根中该基因的转录水平。结果:克隆得到一个新的丹参HMGR3基因,该基因ORF全长1 692 bp,编码563个氨基酸,具有HMGR基因家族的特征序列,与SmHMGR1和SmH-MGR2分别具有75.04%,80.64%的同源性,QRT-PCR分析表明该基因在丹参根茎叶中均有表达,在叶中表达量最高,Ag+诱导24 h时mRNA水平达到最高值。结论:首次克隆得到了1条新的丹参HMGR家族基因SmHMGR3,这一结果为进一步研究丹参次生代谢途径提供了新的思路和靶点。     

丹参毛状根的诱导及培养条件的优化

为了建立丹参毛状根的诱导方法及液体培养体系,以发根农杆菌A4,LBA9402,15834为试验菌株分别侵染丹参无菌苗叶片,诱导丹参毛状根,PCR扩增筛选阳性株系,HPLC测定丹酚酸含量并在此基础上进一步优化毛状根的液体培养条件。结果显示：3种发根农杆菌A4,LBA9402,15834均诱导出丹参毛状根,经PCR鉴定证明其Ri质粒T-DNA均已整合到丹参基因组中,其中发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根丹酚酸含量较高,质量分数分别为（3.27±0.37）%,（3.17±0.20）%;由发根农杆菌LBA9402诱导MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量较高,质量分数为（4.56±0.36）%;由发根农杆菌LBA9402诱导,pH为4.81的MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量最高可达4.85%。因此,以发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根在pH为4.81的MSOH液体培养基中培养的丹酚酸含量较高。为进一步利用基因工程技术改良中药丹参的品质奠定了基础。     

丹参2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)基因全长克隆及其生物信息学分析

目的:从丹参毛状根中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)全长基因,并进行生物信息学分析.方法:根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆SmMCS全长cDNA,并对SmMCS进行蛋白结构预测、序列多重比对和构建进化树等分析;同时采用实时定量PCR检测Ag+诱导子诱导丹参毛状根不同时期的SmMCS基因转录水平.结果:克隆的SmMCS全长cDNA由988个核苷酸组成,具有完整编码框,编码234个氨基酸,蛋白相对分子质量约24.6 kDa,等电点pI 8.53;实时定量PCR结果表明该基因受Ag+诱导后表达水平在12 h时急剧上升并达到最高值.结论:从丹参毛状根中克降得到一条SmMCS全长cDNA,为进一步研究丹参酮类成分的生物合成和萜类次生代谢提供靶基因.     

丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析

目的:建立起丹参的转基因毛状根诱导及离体培养体系。方法:考察了不同外植体、不同农杆菌侵染时间和共培养时间诱导丹参毛状根的效率,共培养外植体用400 g.L-1Cef水除菌5 min,接种在MS+400 g.L-1Cef+2.5 g.L-1Hyg的固体培养基上,完全除菌后转接入6,7-V+2.5 g.L-1Hyg液体培养基继代培养,GFP荧光检测阳性毛状根,PCR检测农杆菌特征基因rolC,并测定不同生长时期的毛状根干重和二氢丹参酮I的积累。结果:用丹参叶片基部诱导毛状根,成功率可达到93.3%;农杆菌侵染10 min诱导效率最高为63.3%;共培养2～3 d诱导效果最好;PCR结合GFP荧光检测的方法鉴定阳性转基因材料具有较高的可信性;丹参毛状根生物量变化与次生代谢物积累之间有着紧密联系。结论:成功建立起丹参转基因毛状根离体培养体系,为进一步的基因工程应用打下基础。     

不同光质对丹参生长及有效成分积累和 相关酶活性的影响

目的:以丹参幼苗为材料,研究不同光质(白光,蓝光,红光)对其生长,有效成分积累和相关酶活性的影响.方法:不同光质处理丹参幼苗,测定相关指标,结合方差统计方法进行分析比较.结果:丹参生长及有效成分积累受不同光色影响显著,与同等PAR的白光相比较,增加蓝光(WB)处理使植株株高显著降低;增加红光(WR)处理使丹参根长、根直径、根鲜重和干重分别显著增加.丹酚酸B含量在补充蓝光与补充红光后均显著提高,而丹参酮ⅡA含量未受补充光质显著影响;蓝光处理下氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)和多酚氧化酶(PPO)活性显著提高;红光处理下过氧化物酶(POD)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)和多酚氧化酶(PPO)活性显著提高.同时实验证明,种子直播幼苗比根栽苗对光色反应敏感.结论:补充红光能够显著促进丹参根系的生长,其有效成分丹酚酸B含量在补充蓝光与补充红光后显著提高,补充蓝光与补充红光能够显著提高丹参TAT和PPO活性.     

丹参枯萎病及其病原菌的研究

丹参是世界公认的治疗心脑血管病的首选药物,栽培丹参枯萎病发生严重,严重影响栽培丹参产量和质量。针对上述问题,采用形态学和病原学实验手段对从发生枯萎病丹参植株茎和根中分离得到的病原菌进行鉴定,同时根据ITS序列采用PCR的方法进行进一步确定。结果表明丹参枯萎病多发生7—8月高温、多雨季节,栽培一年丹参枯萎病的发生率为10%左右,而栽培三年或者三茬丹参枯萎病的发生率达到了60%~70%。枯萎病会引起丹参根腐,因此生产上易误认为根腐病。形态学鉴定结果表明该病原菌为尖孢镰刀菌,ITS序列也表明其与黄瓜枯萎病菌的ITS序列同源性为99%。因此,作者认为引起丹参枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌。     

活性氧在密旋链霉菌Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累中的作用

作者前期研究成果显示密旋链霉菌Act12可以上调丹参酮生物合成途径上的关键酶基因的表达大幅提高丹参毛状根中丹参酮含量。该实验则进一步研究了活性氧在Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累的作用。在继代培养21 d的丹参毛状根中添加Act12不同的诱导子及诱导子组合,分别测定不同收获期毛状根的生物量,毛状根中活性氧积累量,丹参酮类成分的积累量和关键酶基因表达量。Act12诱导后丹参毛状根中活性氧含量上升,HMGR和DXR基因表达上调,最高分别达到对照的32.4,4.8倍,毛状根中丹参酮积累增加,最高达到对照的10.2倍;加入活性氧抑制剂CAT和SOD后,丹参毛状根中的活性氧含量较Act12处理显著下降,HMGR和DXR基因表达也明显下降,毛状根中丹参酮含量较Act12处理下降了74.6%。活性氧介导了Act12诱导丹参酮积累,Act12很可能是通过ROS信号通路激活了MVA和MEP途径,从而提高了丹参酮在毛状根中的含量。     

PMI基因作为选择标记的植物表达载体构建及转化白花丹参体系的建立

目的：构建含有大肠杆菌6- 磷酸甘露糖异构酶（6-phosphomannose isomerase,PMI）基因并替换潮霉素抗性（hygromycin,hyg）基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI,同时建立以PMI/甘露糖为筛选标记的白花丹参转基因体系。方法：首先从大肠杆菌Escherichia coli DH5α中克隆PMI基因,然后以PMI基因替换植物表达载体 pCAMBIA1305 中的hyg基因,构建了以PMI 基因为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI,并用电击转化方法导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404 中,用叶片浸染法转化白花丹参。结果：在白花丹参MS+6-BA 1.5 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1固体分化培养基中附加20 g·L^-1甘露糖和10 g·L^-1蔗糖为碳源的选择压力下,pCAMBIA1305-PMI 的转化率为23.7%,对再生植株用PCR检测证实了PMI基因的导入。结论：建立了以PMI-甘露糖为选择系统的白花丹参转基因体系,可应用于后续目的基因的转化奠定了基础。     

阳春砂仁不同部位挥发油成分的GC-MS分析

目的： 对阳春砂仁不同部位的挥发油成分进行分析比较。 方法： 采用水蒸气蒸馏法提取阳春砂仁完整果实、果皮和种子团3个部位挥发油,采用GC-MS技术对挥发油的化学成分进行分析鉴定,并采用面积归一化法获得各化合物的相对含量。 结果： 从阳春砂仁果实、种子团和果皮挥发油中分别鉴定出29,20,31种化合物,占各部位挥发油总量的94.82%,93.99%,87.39%。三者共鉴定化合物出40种,其中共有成分13种。 结论： 阳春砂仁完整果实与种子团挥发油化学成分相似,果皮挥发油与二者化学成分差异较大。阳春砂仁果皮的药理作用和功效尚待进一步研究明确。     

HS-SPME-GC-MS分析茸毛木蓝地上部分和根挥发性成分

目的:分析茸毛木蓝地上部分和根的挥发性成分。方法:采用顶空固相微萃取和气质联用技术(HS-SPME-GC-MS),结合保留指数法首次并用峰面积归一化法测定相对百分含量。结果:从茸毛木蓝的地上部分鉴定了35个化合物,根鉴定了21个化合物,分别占总峰面积85.66%和93.74%。两者有12个共有成分。结论:茸毛木蓝地上部分与根挥发性成分具有差别。