人正常软骨细胞和骨性关节炎软骨细胞体外培养对照研究

目的:对人正常软骨细胞和骨关节炎软骨细胞进行体外培养,并就其2组在传代过程中生物学特性变化进行比较和评价。方法:酶两步顺序消化法消化关节软骨分离细胞;体外传代培养观察细胞形态、生长,MTT法测定增殖,甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色,从蛋白和基因水平检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖的变化,以及用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:①骨性关节炎软骨细胞形态似成纤维细胞,生长速度明显较正常软骨细胞慢。②MTT检测骨关节炎组2、4、6代软骨细胞增殖均低于正常组(P0.05),Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝O染色均较弱,传至第4代软骨细胞生物学特性基本消失。③2、4代骨关节炎软骨细胞凋亡率明显高于正常软骨细胞(P0.05)④各代骨性关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达量都不如正常软骨细胞。结论:体外培养的人骨性关节炎软骨细胞符合软骨细胞退变的表现,能很好的为骨关节炎细胞水平的研究提供最佳实验对象。     

加味阳和汤对膝骨性关节炎软骨细胞凋亡的影响研究

目的:观察加味阳和汤对膝骨关节炎兔关节软骨骨形态发生蛋白-2(BMP2)及Sry相关组蛋白9(Sox9)表达的影响。方法:将健康新西兰大白兔随机分为正常组、模型组和实验组。除正常组外,其余2组动物均按照改良赫尔特法(Hulth法)制作膝骨关节炎模型后,分组处理,4,6,8周后取材,制作标本,行免疫组化染色观察Ⅱ型胶原(ColⅡ)的变化、实时聚合酶链反应(PCR)监测软骨组织中BMP2和Sox9的表达情况、TUNEL监测软骨组织中软骨细胞凋亡情况。结果:正常组Ⅱ型胶原的表达量最高,模型组表达量最少,骨性关节炎时间越长阳性染色越浅,同一时间段内实验组染色较好,且分布较均匀;BMP2在正常软骨中少量表达,而在骨性关节炎软骨中有大量表达,骨性关节炎时间越久,BMP2的表达量越多,同一时间段内实验组的BMP2的表达量比模型组低;而Sox9在正常组中有大量表达,而在模型组中表达量明显减少,在同一时间段内实验组均较模型组的表达量增高。正常组软骨中凋亡的软骨细胞数量较少,而在模型组中同一时间段内软骨细胞凋亡数量较正常组明显增加,骨性关节炎时间越久凋亡细胞数量越多,实验组经治疗后细胞调亡数量减少。结论:加味阳和汤能够下调膝关节中BMP2的表达量,上调Sox9的表达量,从而减缓骨性关节炎软骨退变,促进Ⅱ型胶原的表达,进而减少软骨细胞的凋亡。     

牛膝总皂苷体外干预人膝骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原表达及最佳浓度的实验研究

目的:观察牛膝总皂苷(TSA)体外干预人膝骨关节炎软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原(Collagen Ⅱ)表达水平及最佳浓度.方法:将人膝骨关节炎软骨细胞进行分离、培养、鉴定,并将其分为6组,分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/ml组.制备TSA存储液及6组不同TSA浓度DMEM/F12(D/F12)培养基,分别用6组培养基对P3代软骨细胞培养并进行细胞形态学观察;采用CCK-8法检测软骨细胞P1、P2、P3传代增殖情况,观察其生长曲线;采用Western-blot法检测P3代软骨细胞CollagenⅡ蛋白表达、RT-PCR法检测Collagen Ⅱ mRNA表达.结果:软骨细胞体外分离并培养成功,经甲苯胺蓝染色鉴定细胞为软骨细胞来源;CCK-8法绘制的生长曲线符合Logistic生长曲线规律,P3代软骨细胞增殖速度高于P1、P2代;Western-Blot法检测结果显示,Collagen Ⅱ蛋白表达量浓度为0.5 mg/ml时达最高,RT-PCR法检测结果显示,各组浓度AST能促进软骨组织Ⅱ型胶原mRNA表达上调,以0.5 mg/ml组最明显(P＜0.05).结论:TSA能体外有效促进软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原mRNA表达上调,以0.5 mg/ml浓度最明显,具有促进软骨修复的作用,具体作用机制有待进一步研究.     

胎牛血清和大鼠血清对体外软骨组织构建的影响

目的观察胎牛血清和大鼠血清对体外构建大鼠软骨组织的效应,为组织工程软骨筛选出合适的培养方法。方法取大鼠原代软骨细胞,离心后,培养箱中放置48 h,细胞团块会自发形成软骨小结。分为胎牛血清组和大鼠血清组。每隔一天换一次液,连续培养2周。取出软骨组织,称量重量,固定于4%多聚甲醛,经过脱水、石蜡包埋、切片后,经HE(苏木素-伊红)染色,甲苯胺蓝和藏红-固绿染色及细胞免疫荧光检测Ⅱ型胶原(Col2a1)、I型胶原(Col1a1)的表达。结果胎牛血清组的软骨组织重量比大鼠血清组的软骨组织明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。HE染色结果表明:大鼠血清组的组织形态呈纤维样结构,而胎牛血清组组织形态呈典型的软骨结构。胎牛血清组的组织甲苯胺蓝和藏红染色明显,而大鼠血清组的组织甲苯胺蓝淡染,固绿深染,提示软骨组织退变或非软骨组织。进一步免疫荧光检测软骨标志基因Ⅱ型胶原和Ⅰ型胶原,胎牛血清组Ⅱ型胶原高表达,而大鼠血清组低表达,Ⅰ型胶原在两组的表达和Ⅱ型的表达呈相反的结果,即在大鼠血清组高表达,在胎牛血清组低表达。结论胎牛血清可促进体外软骨组织的形成,而大鼠血清抑制了软骨组织形成。胎牛血清适合体外构建大鼠软骨组织。     

桃仁膝康丸激活软骨细胞自噬延缓骨性关节炎软骨退变的研究

目的观察桃仁膝康丸(TRXK)对外科手术诱导的大鼠骨性关节炎(OA)软骨退变的保护作用并探讨其与软骨细胞自噬的关系。方法将健康雄性SD大鼠40只随机分为:假手术组、模型组、TRXK组和TRXK+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,采用改良的Hulth法制备大鼠膝关节OA模型。术后2周开始TRXK组和TRXK+3-MA组给予TRXK 1.25 g·kg-1·d-1灌胃,TRXK+3-MA组同时给予3-MA 1.5 mg·kg-1·d-1腹腔注射,连续用药12周。光镜下观察软骨组织形态学变化,并进行Mankin评分,Real-time PCR法检测膝关节软骨组织中Ⅱ型胶原α1(COL2A1)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、基质金属蛋白酶13(MMP13)和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5(ADAMTS5)m RNA的表达,Western Blot法检测软骨组织中ULK1、Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ/Ⅱ(LC3-Ⅰ/Ⅱ)蛋白质的表达。结果与模型组比较,TRXK能明显降低Mankin评分,升高软骨组织中COL2A1和Aggrecan,而降低MMP13和ADAMTS5 m RNA表达(P0.05);另外,TRXK能提高ULK1、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白质表达(P0.05)。结论桃仁膝康丸可以通过诱导软骨细胞自噬延缓或阻止外科手术诱导的大鼠膝关节OA的软骨退变,其激活软骨细胞自噬的机制有待进一步研究。     

牛蒡子苷元对关节软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原表达的影响

  目的：观察牛蒡子苷元(arctigenin,ARC-G)对关节软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原表达的影响  方法：采用酶消化法体外分离关节软骨细胞,取第1代软骨细胞分别接种于6孔培养板和96孔培养板中,实验分为空白组、牛蒡子苷元低浓度组(低浓度组)和牛蒡子苷元高浓度组(高浓度组)。各组分别给予相应的干预措施,48 h后,以SABC免疫组织化学染色法观察软骨细胞Ⅱ型胶原的表达情况,以MTT法检测细胞的增殖情况,以酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清Ⅱ型胶原的含量  结果：①与空白组比较,低浓度组和高浓度组在软骨细胞数量和阳性染色强度上均有所增加,且高浓度组优于低浓度组;②与空白组比较,低浓度组和高浓度组软骨细胞OD值及Ⅱ型胶原含量均明显提高(P<0.05),且高浓度组优于低浓度组(P<0.05)  结论：牛蒡子苷元可明显促进体外培养关节软骨细胞的增殖和Ⅱ型胶原的表达,较好地维持软骨细胞表型,从而可有效用于骨关节炎的治疗。     

淫羊藿苷影响软骨细胞基质分泌和基因表达的体内研究

目的:研究淫羊藿苷(icariin,Ica)对体内异位组织工程化软骨细胞基质分泌和特异性基因表达的影响,以评估Ica作为软骨组织工程促进剂的可能性。方法:分离、培养新生家兔关节软骨细胞;制备封装在包埋盒中含Ica终浓度为1×10-5M的软骨细胞-胶原水凝胶构建物,体外培养1周后植入家兔背部皮下,分期取材。激光共聚焦显微镜观察Ica对构建物中软骨细胞生长活性的影响;生化方法检测糖胺聚糖(gLycosaminogLycans,GAG)的分泌量;ELISA测定II型胶原(CollagenⅡ,ColⅡ)的合成情况;实时荧光定量聚合物酶联反应检测软骨特有基因表达情况。结果 :在凝胶中载入1×10-5M浓度范围内的Ica可使细胞-凝胶构建物外观更为致密,类似于软骨组织;维持软骨细胞表型及生长活性;促进GAG和ColⅡ的分泌;提高Aggrecan、CollagenⅡ和Sox9等软骨细胞特有基因的表达。结论:Ica可维持体内异位环境下组织工程化软骨细胞表型,促进细胞外基质分泌和软骨特有基因的表达,有望成为软骨组织工程中一种安全有效的促进剂。     

黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变关节软骨VEGF表达的影响

目的:研究黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变关节软骨VEGF表达的影响。方法:取人手术后的退变膝关节软骨,进行细胞培养,将培养的软骨细胞分离传代后,取第三代细胞,通过HE、Ⅱ型胶原免疫荧光染色进行软骨细胞鉴定,并进行VEGF免疫荧光染色。观察软骨细胞退变情况后分为6组(A组:软骨细胞+DMEM对照组;B组:软骨细胞+25mmol/L黄芪甲苷;C组:软骨细胞+50 mmol/L黄芪甲苷;D组:软骨细胞+75 mmol/L黄芪甲苷;E组:软骨细胞+100mmol/L黄芪甲苷;F组:软骨细胞+500 mmol/L黄芪甲苷),取4 h、8 h、24 h、48 h、72 h采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测各组退变软骨内VEGF表达mRN A的表达情况。结果:培养的细胞为退变的软骨细胞;实时荧光定量PCR结果显示,不同浓度黄芪甲苷有上调退变膝关节软骨细胞VEGF的作用,且75 mmol/L黄芪甲苷在48 h时上调作用最好;在24 h、48 h、72 h不同浓度(50～100 mmol/l)黄芪甲苷膝关节软骨细胞VEGF表达量高于对照组(F=21.304,P<0.001)。结论:黄芪甲苷可通过调节退变软骨细胞合成VEGF延缓膝骨关节炎关节软骨细胞的退变。     

少阳生骨方对去分化软骨细胞增殖以及Ⅱ型胶原表达影响研究

目的：对比观察少阳生骨方（SYSGF）与盐酸氨基葡萄糖胶囊对去分化软骨细胞增殖以及Ⅱ型胶原表达的影响,探讨少阳生骨方对膝关节软骨保护方面的作用。方法：①去分化软骨细胞体外培养体系的建立以及鉴定;②用CCK-8法观察少阳生骨方以及盐酸氨基葡萄糖对去分化软骨细胞增殖影响;③用免疫组化法观察少阳生骨方以及盐酸氨基葡萄糖对去分化软骨细胞Ⅱ型胶原表达影响。结果：①通过酶消化法建立1周龄SD大鼠去分化软骨细胞体外培养体系,通过镜下观察、甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原表达染色鉴定,确认分离培养的软骨细胞符合软骨细胞的生物学特性。②CCK-8法观察去分化细胞结果显示：0.6%、1.2%、2.4%含少阳生骨方药物以及盐酸氨基葡萄糖的药物血清与空白组相比,其均能促进去分化软骨细胞的增殖（P〈0.05）,但少阳生骨方组与盐酸氨基葡萄糖组相比其结果差异性没有统计学意义（P〉0.05）。③用免疫组化染色法观察去分化软骨细胞结果显示：不同药物以及不同药物浓度干预去分化软骨细胞后其Ⅱ型胶原均有表达,表达部位在胞浆,为红棕色颗粒或成片状,但与空白组相比,少阳生骨方组与盐酸氨基葡萄糖组表达率明显增加（P〈0.05）。同浓度含药血清少阳生骨方组与盐酸氨基葡萄糖组Ⅱ型胶原表达结果差异性没有统计学意义（P〉0.05）。结论：少阳生骨方能促进去分化软骨细胞的增殖以及Ⅱ型胶原的表达,提示少阳生骨方能有效保护关节软骨,这或许是其防治骨性关节炎的机制之一。     

牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞软骨定向分化的实验研究

目的:观察牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)软骨定分化的作用。方法:密度梯度离心联合骨髓贴壁法分离培养新西兰大白兔BMSCs,取P3代细胞随机分成5组(空白组、完全诱导组、牛膝醇提物低剂量组、牛膝醇提物中剂量组、牛膝醇提物高剂量组),连续诱导培养21d,倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫细胞学检测Ⅱ型胶原蛋白荧光表达,qRT-PCR检测软骨分化标记基因Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA表达情况,Western Blot检测Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达水平。结果:牛膝醇提物高、中、低剂量组与空白组相比Ⅱ型胶原蛋白荧光阳性表达明显;牛膝醇提物高、中剂量组与空白组相比软骨分化标记基因Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原明显增加(P0.05),Western Blot验证Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达明显(P0.05),其中牛膝醇提物高剂量组效果最佳(P0.01),与完全诱导组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:牛膝醇提物能够诱导兔BMSCs成软骨分化,其具体作用机制有待进一步研究。     

大鼠中药血清对骨关节炎患者膝关节软骨细胞胶原和金属蛋白酶mRNA表达的影响

目的:观察祛痰除湿剂对原代培养骨关节炎(OA)患者的膝关节软骨细胞中Ⅱ型胶原、X型胶原和相关代谢酶MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA表达的影响,探讨祛痰除湿剂治疗骨关节炎的作用及其机制.方法:原代培养骨关节炎患者的膝关节软骨细胞,用第三代细胞进行试验.关节软骨细胞经含药血清作用72h后,采用Real Time-PCR法检测细胞中Ⅱ型胶原(Col Ⅱ)、Ⅹ型胶原(Col Ⅹ)、基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、基质金属蛋白酶-13的mRNA表达.结果:OA患者膝关节软骨细胞经祛痰除湿剂含药血清作用后Col Ⅱ mRNA表达明显高于仅使用胎牛血清培养的空白对照组,经10％祛痰除湿剂含药血清作用后Col Ⅹ及MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA表达均明显低于空白对照组.结论:祛痰除湿剂可调节OA患者关节软骨中胶原及相关金属蛋白酶(MMPs)的mRNA表达,从而对退变的软骨细胞有一定的修复作用并可延缓关节软骨细胞的进一步退变.     

含粉防己碱生物材料对体外培养软骨细胞的影响

[目的]研究含粉防己碱生物材料对体外培养关节软骨细胞的影响。[方法]制备空白对照聚乳酸膜和含粉防己碱的聚乳酸膜。在两种材料表面培养软骨细胞，测定载粉防己碱聚乳酸膜和空白对照聚乳酸膜表面培养软骨细胞的增殖和细胞活性。利用全细胞酶联免疫吸附试验(Cell ELISA)测试溴代尿苷在DNA合成过程中的掺入量和软骨细胞的Ⅱ型胶原分泌量，测定不同材料表面培养软骨细胞的差别。通过MTT试验测试细胞活性，测定糖胺聚糖分泌量评价软骨细胞功能表达。[结果]细胞形态、活性和组织化学分析结果都表明含有粉防己碱的聚乳酸材料能够促进软骨细胞的增殖和细胞功能表达。[结论]含有粉防己碱的聚乳酸生物材料适用于软骨组织的修复重建和软骨组织工程。     

关节康中药血清促进去分化软骨细胞再分化的实验研究

目的:观察体外经传代培养去分化的关节软骨细胞,经关节康血清培养后生物学性状及功能的变化,探索使去分化软骨细胞再分化的手段,为软骨细胞组织工程种子细胞建立合适的体外培养方法。方法:无菌条件下取兔关节软骨组织,酶消化法分离软骨细胞,分成对照组及实验组,实验组常规培养3代后添加关节康血清,继续培养2周。观察对照各组细胞形态,细胞爬片后进行阿利新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测,观察细胞表型变化。结果:兔关节软骨细胞体外培养3代后迅速去分化,增殖缓慢。添加关节康血清后去分化速度明显减缓,血清混合培养2周后,细胞外形恢复良好,阿利新蓝染色阳性及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。结论:关节康血清与软骨细胞的混合培养,能延缓软骨细胞的去分化,并可以促进去分化后的软骨细胞再分化,分泌Ⅱ型胶原及糖蛋白,保持软骨细胞的形态和功能,有望用于在体外培养时防止软骨细胞的去分化及促进去分化软骨细胞的再分化。     

IL-1β诱导新西兰大白兔膝关节退变软骨细胞的体外培养及鉴定

目的探讨并鉴定IL-1β诱导新西兰大白兔膝关节软骨细胞退变的方法,为从体外培养退变软骨细胞的中医药研究骨关节炎提供实验依据。方法无菌条件下取4周龄新西兰大白兔双侧膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法分离关节软骨细胞,细胞传至第2代时,随机分为正常对照组（Z组）与IL-1β诱导的模型组（M组）,Z组不加任何干预,M组加入舍10ng／mLIL-1β的10％FBS培养基,两组均传至第3代。采用形态学、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及流式细胞仪技术比较鉴定。结果倒置显微镜下见Z组第2、3代关节软骨细胞表型稳定,增殖力良好,绝大部分细胞变为梭形、铺路石样,M组第2、3代关节软骨细胞变为长梭形或不规则形状;甲苯胺蓝染色及免疫组织化学技术显示Z组第2、3代关节软骨细胞染色后阳性表达均优于M组;流式细胞仪分析显示,M组第2代软骨细胞凋亡率与Z组比较,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论采用IL-1β诱导新西兰大白兔膝关节软骨细胞体外培养模型,细胞明显退变,可用于骨关节炎的相关实验研究。     

龟鹿二仙胶及其拆方对豚鼠软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白多糖合成的影响

目的:通过观察龟鹿二仙胶及其拆方对豚鼠软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成的影响,探讨龟鹿二仙胶的配伍机制。方法:体外培养豚鼠膝关节软骨细胞,免疫组化染色检测龟鹿二仙胶及其拆方对软骨细胞Ⅱ型胶原合成的影响,Alcian Blue染色检测软骨细胞蛋白多糖合成。结果:龟鹿二仙胶促进软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达极显著(P<0.01),龟板和鹿角均能显著提高Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达(P<0.05),但药效显著低于龟鹿二仙胶(P<0.05);人参和枸杞对Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达均无明显促进作用。结论:龟鹿二仙胶可显著促进软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达,这是其保护软骨细胞,延缓软骨退变的作用机制之一。龟鹿二仙胶发挥此作用的主要药物是龟板和鹿角;人参和枸杞本身并不能促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达,而与龟板和鹿角配合,可明显增强龟板和鹿角的促进软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的作用。     

伸筋易骨矫形手法对兔膝关节软骨细胞代谢及Sox9表达的影响

[目的]探讨伸筋易骨矫形手法对兔膝关节软骨细胞代谢及Sox9表达的影响。[方法]将膝骨关节炎(KOA)模型兔随机分为3组,治疗组采用伸筋易骨矫形手法治疗,对照组采用关节腔注射玻璃酸钠治疗,模型组不做干预,同条件饲养,取材后分离膝骨关节软骨细胞体外培养,镜下观察并通过四甲基偶氮唑盐比色法(MMT)对比3组软骨细胞增殖情况;通过蛋白免疫印迹分析3组软骨细胞Sox9的表达变化。[结果]镜下观察治疗组、对照组关节软骨的增殖速度均快于空白组,其中治疗组增殖速度最快,MMT法检测治疗组软骨细胞增殖能力高于对照组(P0.05),蛋白免疫印迹分析显示治疗组Sox9表达高于对照组(P0.05)。[结论]伸筋易骨矫形手法具有提高软骨细胞增殖速度,增强软骨细胞增殖能力,同时该手法可以提高损伤软骨组织Sox9的表达水平,从而促进软骨细胞的合成代谢。     

六味地黄汤含药血清对兔软骨细胞表型的影响

目的:探讨六味地黄汤含药血清对关节软骨细胞增殖及表型的影响。方法:无菌条件分离新生24小时胎兔长骨干骺端透明软骨,用酶消化法分离原代关节软骨细胞,取P_2代软骨细胞分别种于96孔板(用于细胞增殖实验)和6孔板(用于细胞分泌性蛋白检测),设置空白对照组、正常兔血清组和六味地黄汤含药血清组,每组4个复孔。连续干预96小时后,CCK8法测定细胞增殖情况,ELISA法测定各组培养上清中Ⅱ型胶原(CollagenⅡ,colⅡ)、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量。结果:干预结束后,CCK8法测定正常兔血清组和六味地黄汤含药血清组OD值均高于空白对照组,六味地黄汤含药血清组OD值高于正常兔血清组,差异均具有统计学意义(P0.05);ELISA法检测六味地黄汤含药血清组colⅡ、GAG含量均高于空白对照组,差异均具有统计学意义(P0.05);与正常兔血清组比较,六味地黄汤含药血清组GAG含量高于正常兔血清组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:六味地黄汤含药血清可以促进体外培养兔关节软骨细胞的增殖,促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和GAG,从而更好地维持软骨细胞表型。     

黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变关节软骨细胞基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-3mRNA表达的影响

目的：研究黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变关节软骨细胞基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-3mRNA表达的影响。方法：取膝骨关节炎患者膝关节软骨进行细胞培养,将培养的软骨细胞分离传代后取第3代细胞,通过HE染色、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色进行软骨细胞鉴定,并进行基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-3免疫荧光染色。观察软骨细胞退变情况后将其分为6组,A组不进行干预;B组加入25 mmol.L-1黄芪甲苷;C组加入50 mmol.L-1黄芪甲苷;D组加入75 mmol.L-1黄芪甲苷;E组加入100 mmol.L-1黄芪甲苷;F组加入500 mmol.L-1黄芪甲苷。分别于培养开始后4 h、8 h、24 h、48 h、72 h 5个时间点,采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测各组退变软骨细胞内基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-3mRNA表达的情况。结果：①形态观察。原代细胞中梭形细胞和多角形细胞并存,细胞核偏于细胞的一侧而贴近细胞膜,细胞纤丝较长。HE染色细胞质为红色,胞膜呈蓝色;甲苯胺蓝染色细胞质和胞膜均呈深蓝色;Ⅱ型胶原染色阳性为绿色荧光,细胞核采用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚复染,在不同波段荧光激发下,胞浆和胞膜可见清晰绿色荧光,细胞核区域未见明显绿色荧光,证明培养细胞表达特征性基因Ⅱ型胶原,主要分布在胞浆和细胞膜上,证明所培养的细胞为软骨细胞。基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-3免疫荧光染色可见清晰绿色荧光,软骨细胞以多角形多见。②基质金属蛋白酶-1mRNA表达。不同时间点间软骨细胞基质金属蛋白酶-1mRNA表达水平有差异（F=11.027,P=0.000）;不同组间软骨细胞基质金属蛋白酶-1mRNA表达水平有差异（F=102.345,P=0.000）,A组高于B组、C组、D组、E组（P=0.000;P=0.000;P=0.000;P=0.000）,F组高于A组、B组、C组、D组、E组（P=0.009;P=0.000;P=0.000;P=0.000;P=0.000）;时间因素和组间因素存在交互效应（F=8.258,P=0.000）。③基质金属蛋白酶-3mRNA表达。不同时间点间软骨细胞基质金属蛋白酶-3mRNA表达水平有差异（F=12.316,P=0.000）;不同组间软骨细胞基质金属蛋白酶-3mRNA表达水平有差异（F=66.112,P=0.000）,A组高于B组、C组、D组、E组（P=0.008;P=0.000;P=0.000;P=0.000）,F组高于A组、B组、C组、D组、E组（P=0.000;P=0.000;P=0.000;P=0.000;P=0.000）;时间因素和组间因素存在交互效应（F=14.846,P=0.000）。结论：低浓度的黄芪甲苷能通过抑制退变软骨细胞合成基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-3,延缓软骨细胞退变;浓度过高则会促进退变软骨细胞合成基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-3,加速软骨细胞退变。     

独活寄生汤水提物对退变大鼠椎间盘软骨细胞功能的影响

目的探究独活寄生汤水提物对经IL-1β诱导退变的大鼠椎间盘软骨细胞中Wnt4、GSK-3β、β-catenin、DKK-1的影响。方法采用机械-酶消化法分离大鼠椎间盘软骨组织,进行软骨细胞体外培养、镜下观察与鉴定,分为正常组、模型组(经10 ng/m L浓度IL-1β造模)、实验1组(独活寄生汤水提物组200μg/m L干预24 h)、实验2组(独活寄生汤水提物组200μg/m L干预48 h)。观察4组大鼠椎间盘软骨细胞中Wnt4、GSK-3β、β-catenin、DKK-1 m RNA与蛋白的表达及上清液中Sox 9表达。结果 (1)第2代大鼠椎间盘软骨细胞增殖速度快,呈现多边形,胞核清晰,且含有1~2个核仁,融合后出现"铺路石"状,经Ⅱ型胶原法染色后,阳性对照组胞浆区域浸染为棕黄色;(2)与正常组比较,模型组中软骨细胞Wnt 4、GSK-3β、β-catenin m RNA与蛋白表达及上清液Sox 9含量明显提高(P0.05),DKK-1 m RNA与蛋白表达明显降低(P0.05);与模型组比较,实验1组、实验2组中软骨细胞Wnt 4、GSK-3β、β-catenin m RNA与蛋白表达及上清液Sox 9含量明显降低(P0.05),DKK-1m RNA与蛋白表达明显提高(P0.05),以实验2组变化最为显著(P0.05)。结论独活寄生汤水提物组可调控退变椎间盘软骨细胞的功能,下调Wnt 4、GSK-3β、β-catenin和上调DKK-1 m RNA与蛋白表达,进而延缓大鼠椎间盘软骨细胞的退变。     

桂枝加葛根汤通过SDF-1/CXCR4信号轴改善大鼠椎间盘终板软骨细胞退变的研究

[目的]探讨桂枝加葛根汤在体外力学刺激诱导的大鼠终板软骨细胞退变中的作用与机制。[方法]分离培养大鼠的终板软骨细胞,采用Flexcell FX-5000^TM细胞应力加载系统建立终板软骨细胞退变模型,实验分为对照组、模型组、桂枝加葛根汤组(造模前200 mL/L桂枝加葛根汤含药血清处理细胞24 h)、桂枝加葛根汤+SDF-1α组(造模前200 mL/L桂枝加葛根汤含药血清和100μg/L SDF-1α处理细胞24 h)。CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖与凋亡,甲苯胺蓝染色与鬼笔环肽染色观察细胞形态变化,免疫荧光染色检测细胞中CXC趋化因子受体4(CXCR4)阳性表达,逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测细胞中Ⅱ型胶原纤维α1(COL2A1)、HMG盒超家族成员9(SOX9)mRNA与蛋白表达水平变化。[结果]与对照组比较,大鼠终板软骨细胞在力学刺激后细胞活性下降(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05),细胞出现退变,且形态由多边形变成纺锤形,细胞中COL2A1、SOX9 mRNA与蛋白的相对表达量均下降(P<0.05);与模型组比较,加入桂枝加葛根汤处理的终板软骨细胞活性升高(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05),细胞退变得到抑制,细胞形态改变有所减轻,同时,COL2A1、SOX9 mRNA与蛋白的相对表达量升高(P<0.05),而在桂枝加葛根汤与SDF-1α共培养的细胞中未发现改善作用。[结论]桂枝加葛根汤可体外干预SDF-1/CXCR4信号通路,阻断SDF-1与软骨细胞表面的CXCR4受体结合,减轻大鼠椎间盘终板软骨细胞退变。