弓形虫感染对小鼠和人子宫自然杀伤细胞的影响

目的　观察弓形虫感染对小鼠和人子宫自然杀伤细胞（uterine natural killer cells, uNK cells）比例、数量、分化和功能的影响,探讨uNK细胞在弓形虫感染致早孕流产中的作用。方法　妊娠第6.5天给予孕鼠腹腔注射弓形虫速殖子,建立孕早期弓形虫感染致流产小鼠模型,妊娠第9.5天分离小鼠子宫淋巴细胞。取人正常妊娠孕早期流产新鲜蜕膜组织,分离人子宫淋巴细胞,与弓形虫RH株速殖子体外共培养48 h（弓形虫与子宫淋巴细胞比例分别为0.5∶1、1∶1、2∶1）。采用流式细胞术检测小鼠uNK细胞表型（CD122、NK1.1、DX5）、人uNK细胞表型（CD3、CD56、CD11b、CD27）及胞内细胞因子γ⁃干扰素（interferon⁃γ, IFN⁃γ）和肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α, TNF⁃α）表达水平。磁珠分选小鼠和人uNK细胞,以小鼠YAC⁃1或人K562细胞作为靶细胞、以小鼠或人uNK细胞作为效应细胞,采用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放法检测效应细胞/靶细胞比例分别为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时uNK细胞的杀伤功能。结果　妊娠第9.5天,弓形虫感染组小鼠流产率较对照组显著上升（83.02% vs. 3.51%;[χ2] = 71.359,P < 0.001）。与对照组比较,弓形虫感染组小鼠uNK细胞绝对数量显著降低[（4 547 ± 1 610）个/只 vs.（8 978 ± 3 339）个/只;U = 2.000,P < 0.05]、细胞表面NK1.1表达水平显著下降[（74.53 ± 8.37）% vs.（93.00 ± 1.11）%;U = 0.000,P < 0.05]、NK1.1⁃DX5⁃细胞比例显著上升[（20.10 ± 8.03）% vs.（5.04 ± 0.68）%;U = 0.000,P < 0.05]、NK1.1+DX5+细胞比例显著下降[（21.70 ± 12.48）% vs.（45.75 ± 2.26）%;U = 0.000,P < 0.05]、IFN⁃γ表达水平显著升高[（16.74 ± 1.36）% vs.（8.13 ± 1.90）%;U = 0.000,P < 0.05],但TNF⁃α表达水平无显著改变[（67.98 ± 9.20）% vs.（52.93 ± 10.42）%;U = 2.000,P > 0.05]。弓形虫感染组小鼠uNK细胞表现出较强杀伤能力,且杀伤作用随着效应细胞/靶细胞比例升高逐渐增强;效应细胞/靶细胞比例为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时,感染组uNK细胞对YAC⁃1细胞的杀伤活性分别为2.30%、4.32%、8.12%和12.65%,对照组分别为1.21%、1.63%、2.51%和3.22%。将人子宫淋巴细胞与弓形虫RH株速殖子共培养48 h后,弓形虫感染组人uNK细胞在子宫淋巴细胞中所占比例较对照组显著降低[弓形虫2∶1组 vs. 对照组：（6.61 ± 1.75）% vs.（17.48 ± 4.81）%;F = 7.307,P < 0.01]、绝对数量显著减少[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（12 104 ± 5 726）个/孔 vs.（65 285 ± 21 810）个/孔;H =11.540,P < 0.01]。弓形虫感染组uNK细胞中,CD56brightCD16⁃调节型NK细胞亚群比例较对照组减少（弓形虫2∶1组vs. 对照组：（25.25 ± 5.90）% vs.（36.03 ± 4.51）%;F = 3.213,P > 0.05]、CD56dimCD16+杀伤型NK细胞亚群比例增加[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（11.15 ± 2.15）% vs.（7.09 ± 2.24）%,F = 2.992,P > 0.05],两者比值显著降低[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（2.37 ± 0.92）vs.（5.58 ± 2.39）;H = 8.228,P < 0.05];CD11b+CD27⁃细胞比例显著上升[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（30.28 ± 6.91）% vs.（17.48 ± 4.67）%;H = 6.556,P < 0.05],IFN⁃γ [弓形虫2∶1组vs. 对照组：（14.13 ± 1.28）% vs.（15.19 ± 1.64）%;F = 1.639,P > 0.05]、TNF⁃α表达水平无显著改变[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（54.76 ± 10.02）% vs.（50.33 ±3.67）%;F = 0.415,P > 0.05]。弓形虫感染组人uNK细胞具有较强杀伤能力,且杀伤作用随着效应细胞/靶细胞比例升高逐渐增强;效应细胞/靶细胞比例为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时,感染组uNK细胞对K562细胞的杀伤活性分别为11.90%、28.11%、49.91%和73.35%,对照组分别为11.21%、21.63%、33.51%和48.22%。结论　弓形虫感染对小鼠和人uNK细胞分化和分泌功能产生了不同影响,但均可引起小鼠和人uNK细胞绝对数量减少、杀伤功能增强。     

可诱导共刺激分子及相关细胞因子在细粒棘球蚴感染小鼠免疫调控中的作用

目的　探讨可诱导共刺激分子（inducible costimulatory molecule, ICOS）及相关细胞因子在细粒棘球蚴感染小鼠免疫调控中的作用。方法　80只BALB/c小鼠（体质量18 ~ 22 g）随机分为对照组和感染组，每组40只。按10 000个原头节/只腹腔注射制备细粒棘球蚴感染小鼠模型，腹腔接种2、8、30、60、180 d后，测定小鼠血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）含量，检测小鼠外周血细胞因子白细胞介素10（IL⁃10）和IL⁃4含量。取小鼠肝脏进行HE染色和免疫组织化学染色，应用实时定量PCR（qPCR）技术检测小鼠肝组织中ICOS表达水平。结果　细粒棘球蚴感染后2、8、30、60、180 d，小鼠血清ALT、AST和ALP水平差异均有统计学意义（F = 12.082、6.347、52.186，P均< 0.05）。感染后2 [（61.72 ± 9.89） vs. （50.65 ± 4.67） U/L]、30 d [（80.61 ± 23.71） vs. （67.75 ± 9.79） U/L]，感染组小鼠血清ALT水平显著高于对照组（P均< 0.05）；感染后2 [（181.06 ± 60.61） vs. （115.58 ± 17.66） U/L]、180 d [（137.84 ± 29.01） vs. （108.05 ± 10.33） U/L]，感染组小鼠血清AST水平显著高于对照组（P均< 0.05）；感染后2 [（162.90 ± 21.04） vs. （64.54 ± 5.99） U/L]、8 [（176.36 ± 24.56） vs. （62.70 ± 9.21） U/L]、30 d[（138.86 ± 13.59） vs. （58.60 ± 5.28） U/L]，感染组小鼠血清ALP水平显著高于对照组（P均< 0.05）。感染后30 d，感染组小鼠肝脏可见少量炎性细胞；感染后60 d，小鼠肝脏结构未见明显改变；感染后180 d，小鼠包囊浸润区肝脏可见大量上皮样细胞呈纤维化生长，生成角质层，在病灶区及肝细胞间隙有大量红细胞存在。感染组小鼠肝脏中ICOS呈阳性表达，阳性细胞主要位于肝细胞胞质中，ICOS表达水平随着感染时间延长而逐渐增强；ICOS mRNA在感染180 d后相对表达量为2.732 ± 0.094，明显高于感染后2 d（0.746 ± 0.049）。对照组小鼠血清IL⁃4、IL⁃10水平在细粒棘球蚴感染后不同时间点无显著变化；感染组小鼠血清IL⁃4、IL⁃10水平分别于感染后180 d和60 d达高峰。感染后8 [（22.50 ± 3.24） vs. （5.82 ± 0.49） pg/mL]、30 [（15.49 ± 4.73） vs. （5.10 ± 1.38） pg/mL]、60 [（36.93 ± 6.14） vs. （4.13 ± 1.19） pg/mL]、180 d [（198.35 ± 0.70） vs. （4.19 ± 0.98） pg/mL]，感染组小鼠血清IL⁃4水平均显著高于对照组（P均< 0.05）；感染后2 [（4.84 ± 1.91）vs.（2.11 ± 1.03） pg/mL]、8 [（44.72 ± 14.63）vs.（3.16 ± 0.60） pg/mL]、30 [（25.47 ± 8.00） vs. （3.83 ± 1.87） pg/mL]、60 [（187.16 ± 60.44） vs. （3.69 ± 1.05） pg/mL]、180 d [（85.40 ± 7.15） vs. （3.25 ± 0.93） pg/mL]，感染组小鼠血清IL⁃10水平均显著高于对照组（P均< 0.05）。结论　细粒棘球蚴感染小鼠肝脏出现ICOS高表达；随感染时间的延长，ICOS阳性表达逐渐增强，免疫活化水平逐渐升高，导致免疫炎症引起的肝细胞损伤逐渐加重。     

日本血吸虫可溶性虫卵抗原诱导 小鼠巨噬细胞凋亡机制

目的　观察日本血吸虫感染过程中巨噬细胞数量及其凋亡动态变化,并探讨血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）诱导巨噬细胞凋亡的可能机制。方法　将C57BL/6小鼠（6～8周龄）随机分为4组,其中3组作为实验组,另1组作为正常对照组。实验组每只小鼠均经腹部皮肤感染（12 ± 1）条日本血吸虫尾蚴,于感染后3、5周和8周各处死1组小鼠;正常对照组小鼠不感染血吸虫,于实验组小鼠感染当天处死。取各组小鼠肝组织和腹腔渗出细胞,检测肝脏和腹腔巨噬细胞数量及其凋亡动态变化。此外,体外用SEA、PBS及卵清蛋白（ovalbumin,OVA）处理纯化的小鼠腹腔巨噬细胞,流式细胞术检测巨噬细胞凋亡;以实时定量PCR和Western blotting技术检测巨噬细胞中BCL⁃2家族成员mRNA和蛋白表达水平;以流式细胞术和Western blotting技术检测caspase 3活化水平。同时,体外在caspase抑制剂、H2O2或N⁃乙酰⁃L⁃半胱氨酸（NAC）存在时用SEA处理巨噬细胞,以流式细胞术检测巨噬细胞凋亡水平。结果　感染日本血吸虫尾蚴后3、5周和8周,小鼠肝脏[（0.873 ± 0.106）× 106、（2.737 ± 0.460）× 106个和（3.107 ± 0.367） × 106个;F = 81.900,P < 0.01]和腹腔中巨噬细胞总数[（5.282 ± 1.136） × 105、（7.500 ± 1.200） × 105个和（12.800 ± 0.800） × 105个;F = 55.720,P < 0.01]不断增加,且感染小鼠肝脏[（0.092 ± 0.018） × 106、（0.186 ± 0.025） × 106 个和（0.173 ± 0.027）× 106 个;F = 57.780,P < 0.000 1]和腹腔中凋亡的巨噬细胞数量[（0.335 ± 0.022）× 105、（0.771 ± 0.099） × 105个和（1.094 ± 0.051） × 105个;F = 49.460,P < 0.01]亦不断增加。经SEA体外处理的巨噬细胞凋亡比例[（24.330 ± 0.784）%]高于PBS [（18.500 ± 1.077）%]及OVA[（18.900 ± 1.350）%]处理组（P均 < 0.01)。经SEA和PBS处理的巨噬细胞中,Bcl⁃2 [（1.662 ± 0.943） vs. （1.00 ± 0.00）;t = 1.215,P > 0.05]、Bax [（0.711 ± 0.200） vs. （1.00 ± 0.00）;t = 2.507,P > 0.05]、Bak [（1.255 ± 0.049） vs. （1.00 ± 0.00）;t = 0.897,P > 0.05]、BCL⁃2 [（0.068 ± 0.004） vs. （0.070 ± 0.005）;t = 0.699,P > 0.05]、BAX [（0.089 ± 0.005） vs. （0.097 ± 0.003）;t = 2.232, P > 0.05]、BAK [（0.439 ± 0.048） vs. （0.571 ± 0.091） ; t = 2.231,P > 0.05]表达水平差异均无统计学意义。在caspase抑制剂存在时,SEA仍能诱导巨噬细胞凋亡（F = 0.411,P > 0.05）;而在H2O2或NAC存在时,SEA不能诱导巨噬细胞凋亡（F = 11.880、9.897,P均< 0.05）。结论　在日本血吸虫感染过程中,SEA可能通过促进活性氧表达而诱导巨噬细胞凋亡。     

缺氧诱导因子⁃1在弓形虫感染孕鼠中的表达

目的　探讨缺氧诱导因子⁃1（hypoxia⁃inducible factor⁃1, HIF⁃1）在小鼠妊娠早期感染弓形虫后母胎界面的表达及可能发挥的作用。方法　将20只妊娠C57BL/6小鼠（体质量为16～20 g）随机分为4组,即12 d对照组、12 d感染组和18 d对照组、18 d感染组。在小鼠孕6 d时,给予12 d感染组、18 d感染组小鼠腹腔注射弓形虫PRU株速殖子150个/只,孕12 d、孕18 d对照组孕鼠则注射等量PBS。于孕12 、18 d分别处死相应对照组和感染组小鼠,取各组孕鼠胎盘和子宫组织观察其组织病理变化;采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测孕鼠胎盘和子宫中HIF⁃1α、HIF⁃1β及血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达水平,并分析HIF⁃1α和VEGF mRNA表达水平的相关性。此外,设置孕12 d感染组和孕18 d感染组PBS阴性对照组,采用免疫组化染色检测孕鼠胎盘和子宫组织中HIF⁃1α表达水平。结果　与孕12 d、孕18 d对照组相比,孕12 d、孕18 d感染组孕鼠出现畸胎、胎盘发育不良等不良妊娠结局。HE染色结果显示,与相应对照组相比,孕12 d、孕18 d感染组小鼠胎盘组织迷路区细胞分别出现肿胀和瘀血,且均出现血窦减少、炎性细胞浸润;两组小鼠子宫组织均有柱状上皮细胞损伤和炎性细胞浸润。qPCR检测结果显示,与同期对照组相比,孕12 d感染组小鼠胎盘组织中HIF⁃1α、HIF⁃1β mRNA表达水平显著上升（F ＝ 132.6、286.9,P 均＜0.05）,子宫组织中HIF⁃1α、HIF⁃1β mRNA表达水平显著下降（F ＝111.5、55.2,P均＜ 0.05）;孕18 d感染组小鼠胎盘和子宫组织中HIF⁃1α、HIF⁃1β mRNA表达水平均显著下降（F ＝ 215.8、418.9、156.8、200.1,P 均＜ 0.05）。与同期对照组相比,孕12 d感染组小鼠胎盘组织中VEGF⁃A、VEGF⁃B和VEGF⁃C mRNA表达水平均显著下降（F ＝426.2、104.6、566.9,P 均＜0.05）,子宫组织中VEGF⁃A、VEGF⁃B和VEGF⁃C mRNA表达水平显著上升（F ＝ 95.8、502.4、610.0,P均＜0.05）;孕18 d感染组小鼠胎盘组织和子宫组织中VEGF⁃A、VEGF⁃B和VEGF⁃C mRNA表达水平均显著上升（F ＝521.9、100.6、275.9、224.6、108.2、333.4,P均＜ 0.05）。免疫组化染色结果显示,与相应对照组相比,孕12 d、孕18 d感染组小鼠胎盘迷路区HIF⁃1α分别呈强阳性和弱阳性表达,子宫组织中HIF⁃1α均不表达。结论　小鼠孕早期感染弓形虫后,胎盘组织中HIF⁃1α表达呈现孕中期上升、孕晚期下降的趋势,且与VEGF⁃A、VEGF⁃B、VEGF⁃C表达变化趋势相反;推测HIF⁃1α通过抑制VEGF表达而抑制小鼠妊娠期间胎盘血管生成,导致不良妊娠结局。     

急性弓形虫感染小鼠脑蛋白质二维电泳图谱初步分析

目的应用二维电泳（2-DE）技术研究急性弓形虫感染对小鼠脑蛋白质组的改变。方法分别提取纯化急性弓形虫感染和正常同窝配对的C57BL/6J小鼠脑组织蛋白,以固相pH3～10梯度聚焦为第一向,SDS-PAGE垂直电泳为第二向进行双向凝胶电泳,应用PDQuest 1.0软件分析蛋白差异。结果急性弓形虫感染与正常同窝配对的C57BL/6J小鼠脑组织2-DE图谱分别检测出（132±10）个和（170±13）个蛋白斑点,对两组电泳图谱进行匹配后,有19个蛋白点仅在急性弓形虫感染小鼠脑蛋白2-DE图谱中表达;另有37个蛋白斑点仅在正常同窝配对小鼠中表达。部分蛋白在两组小鼠脑组织中含量也发生明显变化。结论急性弓形虫感染小鼠脑蛋白质有明显改变,为研究弓形虫感染致脑组织损害及筛选治疗新药提供了有益的线索。     

CD47及其配体在孕期弓形虫感染小鼠中的表达

目的　观察孕早期弓形虫感染小鼠中分化簇CD47及其配体信号调节蛋白α（SIRPα）和血小板反应蛋白1（TSP⁃1）在孕中、晚期的动态表达。方法　以C57BL/6J小鼠（6～8周龄）构建孕早期弓形虫感染小鼠模型,将孕鼠随机分成正常对照组和感染组,每组10只。感染组孕鼠于孕6.5 d（Gd6.5）时腹腔注射150个弓形虫速殖子,正常对照组孕鼠同一时间腹腔注射等体积生理盐水。于Gd12.5、Gd18.5时,收集各组孕鼠子宫和胎盘组织,并记录妊娠状态结局。通过苏木精⁃伊红（HE）染色观察两组孕鼠子宫、胎盘组织Gd12.5和Gd18.5时病理损伤,采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测各组孕鼠子宫、胎盘组织中CD47、SIRPα、TSP⁃1、主要表面抗原1（SAG1）及γ干扰素（IFN⁃γ）、白细胞介素2（IL⁃2）、IL⁃4和IL⁃13 mRNA表达水平,采用免疫组织化学技术检测CD47、SIRPα和TSP⁃1在孕鼠子宫、胎盘组织中的表达水平。结果 　与正常对照组相比,感染组孕鼠孕期出现弓背、耸毛、颤栗和精神萎靡状态,个别出现阴道流血和流产等现象。HE染色结果显示,感染组孕鼠子宫、胎盘组织均出现不同程度炎症细胞浸润、淤血和坏死等病理损伤。Gd12.5和Gd18.5时,感染组孕鼠流产率均较对照组升高（[χ2] = 20.405、28.644,P 均< 0.001）。qPCR检测结果显示,Gd12.5和Gd18.5时正常对照组和感染组孕鼠胎盘组织中 CD47、SIRPα、TSP⁃1、SAG1、INF⁃γ、IL⁃2、IL⁃4和IL⁃13表达水平差异均有统计学意义[F′（F）= 37.511、29.337、97.343、53.755、67.188、21.145、8.658、13.930,P均< 0.001];与对照组相比,Gd12.5时感染组孕鼠胎盘组织中CD47、SIRPα和TSP⁃1表达水平升高（P 均< 0.01）,而Gd18.5时表达降低（P 均< 0.001）;Gd12.5和Gd18.5时感染组孕鼠胎盘组织中均有SAG1 表达（P 均< 0.01）;此外,Gd12.5和Gd18.5时感染组孕鼠胎盘组织中INF⁃γ和IL⁃2表达水平均升高（P 均< 0.001）,IL⁃4和IL⁃13表达下降（P 均< 0.001）。Gd12.5和Gd18.5时正常对照组和感染组孕鼠子宫组织中 CD47、TSP⁃1、SAG1、INF⁃γ、IL⁃2、IL⁃4和IL⁃13表达水平差异均有统计学意义[H （F′、F）= 14.951、25.977、18.711、48.595、39.318、14.248、15.468,P 均< 0.01];与正常对照组相比,Gd12.5和Gd18.5时感染组孕鼠子宫组织中CD47和TSP⁃1表达水平均升高（P 均< 0.01）,但SIRPα表达无变化（P > 0.05）;Gd12.5和Gd18.5时感染组孕鼠子宫组织中均有SAG1 表达（P 均< 0.01）;Gd12.5和Gd18.5时感染组孕鼠子宫组织中INF⁃γ和IL⁃2表达水平均升高（P 均< 0.001）,IL⁃4和IL⁃13 表达水平下降（P 均< 0.001）。相关性分析显示,Gd12.5时感染组孕鼠胎盘组织中CD47表达水平与IFN⁃γ（rs = 0.735）、IL⁃2（rs = 0.655）表达水平呈正相关（P 均< 0.05）,与IL⁃4（rs = -0.689）、IL⁃13达水平（rs = -0.795）表呈负相关（P 均< 0.05）;Gd18.5时胎盘组织中CD47表达水平与IFN⁃γ表达水平（rs = -0.745）、IL⁃2（rs = -0.816）呈负相关（P 均< 0.05）,与IL⁃4（rs = 0.704）、IL⁃13表达水平（rs = 0.802）呈正相关（P均< 0.05）。免疫组织化学染色结果显示,Gd12.5和Gd18.5时正常对照组孕鼠子宫、胎盘组织中CD47、SIRPα和TSP⁃1均呈弱表达;Gd12.5时感染组孕鼠胎盘组织中CD47、SIRPα和TSP⁃1呈强表达,子宫组织中CD47和TSP⁃1呈强表达。结论　孕早期弓形虫感染可致小鼠孕中、晚期母胎界面出现CD47及其配体SIRPα和TSP⁃1异常表达,可能与虫体在母胎界面免疫逃逸有关。     

人体刚地弓形虫感染对血脂水平的影响

目的　分析人体刚地弓形虫感染对血脂水平的影响。方法　以2017年1月至2019年12月某三级医院1 000例体检健康者作为研究对象,根据酶联免疫吸附试验（enzyme⁃linked immunosorbent assay, ELISA）是否检出血清抗弓形虫抗体分为感染组和对照组,检测并比较两组研究对象血清总胆固醇（total cholesterol, TC）、高密度脂蛋白（high⁃density lipoprotein, HDL）、低密度脂蛋白（low⁃density lipoprotein, LDL）和甘油三酯（triglyceride, TG）水平。结果　1 000例研究对象血清抗弓形虫抗体阳性率为8.40%,感染组和对照组研究对象性别（[χ2] = 1.29,P > 0.05）和年龄构成（[χ2] = 1.41,P > 0.05）差异均无统计学意义。感染组研究对象血清LDL和TC均值显著高于对照组（t = 3.89、3.81,P均< 0.05）,但两组研究对象血清TG和HDL差异均无统计学意义（t = 0.97、0.75,P均> 0.05）;感染组研究对象LDL和TC值不正常比例均显著高于对照组（[χ2] = 9.69、10.39,P均< 0.01）,但两组研究对象TG和HDL值不正常比例差异均无统计学意义（[χ2] = 0.02、0.11,P均> 0.05）。结论　人体刚地弓形虫感染影响血脂水平变化,血清抗弓形虫抗体阳性者平均LDL和TC值及TC和LDL值不正常比例均显著高于抗体阴性者。     

刚地弓形虫慢性感染小鼠脑组织中lncRNA102796的差异表达及其作用机制

目的 了解长链非编码RNA102796 (lncRNA102796)在刚地弓形虫慢性感染小鼠脑组织中的差异表达及其作用机制。方法取SPF级雌性BALB/c小鼠构建弓形虫慢性感染小鼠模型。感染后2个月,取感染小鼠（10只）和健康对照小鼠（10只）脑组织,提取总RNA以及神经细胞的细胞质和细胞核RNA,采用实时定量PCR (qRT-PCR)检测小鼠脑组织中lncRNA102796的表达和在神经细胞中的定位。生物信息学分析预测lncRNA102796的靶基因为阿片受体1 (opioid receptor delta 1, oprd1)基因。取感染小鼠和健康对照小鼠脑组织,提取总RNA和细胞蛋白,qRT-PCR检测脑组织中oprd1 mRNA相对转录水平,蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测脑组织中OPRD1的表达情况。构建lncRNA102796的干扰质粒（干扰lncRNA102796）和过表达质粒（过表达lncRNA102796）,分别以未干扰lncRNA102796的质粒pGPU6/GFP/Neo和未过表达lncRNA102796的质粒pcDNA3.1+为干扰对照和过表...     

PCR法评价泼尼松龙诱导弓形虫隐性感染小鼠的复发及阿奇霉素对复发的疗效

目的探讨PCR方法诊断泼尼松龙诱导弓形虫隐性感染小鼠复发的敏感性及阿奇霉素对其复发的治疗效果。方法36只20g左右的雌性ICR小鼠以每组6只随机分成正常组（C）、泼尼松龙组（P）、感染弓形虫组（I）、感染弓形虫＋阿奇霉素组（IA）、感染弓形虫＋泼尼松龙组（IP）、感染弓形虫＋泼尼松龙组＋阿奇霉素组（IPA）。0周,I组、IA组、IP组和IPA组小鼠分别经腹腔注射感染Prugniaud株弓形虫包囊10个/只;第6～7周,P组、IP组、IPA组小鼠每只每天后肢内侧皮下注射盐酸泼尼松龙1mg,IA组、IPA组小鼠每只每天按250mg/kg剂量腹腔注射阿奇霉素。分别在0、1、2、3、4、5、6、7周对各组小鼠采血,并萃取全血DNA,通过PCR法扩增弓形虫特异性B1基因。第7周剖杀所有小鼠计数其脑组织弓形虫包囊数。结果相比AF14652基因引物,B1基因引物敏感度更高且特异性好;感染弓形虫前5周的小鼠可以通过PCR方法扩增到B1基因特异性产物,5周后PCR法未能扩增出特异性产物;感染弓形虫激素组（IA）小鼠在使用泼尼松龙2周后小鼠全部死亡,感染弓形虫激素治疗组（IP）小鼠死亡率低（P〈0.05）;相比感染组（I）和感染＋阿奇霉素组（IA）和感染＋泼尼松龙＋阿奇霉素组（IPA）,感染＋泼尼松龙组（IP）小鼠脑组织包囊个数显著增加（P〈0.01）。结论在PCR方法诊断中,B1基因是很好的诊断弓形虫病的目的基因;泼尼松龙能诱导弓形虫隐性感染小鼠的复发并导致小鼠的死亡;阿奇霉素对弓形虫病治疗有效,但不能完全治愈弓形虫病。     

白细胞介素9促进日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞激活

目的　探讨小鼠感染日本血吸虫后,白细胞介素-9（interleukin-9, IL-9）在小鼠肝星状细胞活化中的作用。方法　采用肝脏原位灌注消化结合密度梯度离心法,分离日本血吸虫感染7周后小鼠原代肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）并进行体外培养。将HSCs分为PBS对照组和IL-9刺激组（浓度20 ng/mL）。分别于刺激后48、72 h收集细胞,采用免疫印迹试验检测HSCs中α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（typeⅠcollagen, ColⅠ）和Ⅲ型胶原蛋白（type Ⅲ collagen, Col Ⅲ）表达水平。结果　经20 ng/mL IL-9刺激48 h后,IL-9刺激组HSCs中α-SMA [（0.87 ± 0.02） vs. （0.69 ± 0.01）;t = 17.39,P < 0.01]、ColⅠ[（0.74 ± 0.02） vs. （0.65 ± 0.01）;t = 9.56,P < 0.01]、Col Ⅲ蛋白 [（0.94 ± 0.04） vs. （0.75 ± 0.03）;t = 6.15,P < 0.01]表达水平均显著高于PBS对照组;刺激72 h后,IL-9刺激组HSCs中α-SMA蛋白水平显著高于PBS对照组 [（0.76 ± 0.02） vs. （0.58 ± 0.02）;t = 12.52,P < 0.01],但两组间ColⅠ[（0.68 ± 0.02） vs. （0.66 ± 0.02）;t = 1.15,P > 0.05]和Col Ⅲ蛋白[（0.75 ± 0.01） vs. （0.72 ± 0.02）;t = 2.22,P > 0.05]表达水平差异均无统计学意义。结论　IL-9可促进日本血吸虫感染小鼠HSCs激活。     

硒对氟致大鼠肾脏损伤保护作用的实验观察

目的 观察硒对氟致大鼠肾脏损伤的保护作用,探讨硒的最佳作用剂量及作用靶点.方法 断乳SD雄性大鼠80只,按体质量随机分8组,每组10只.对照组饮用自来水;染氟组饮用50 mg/L的氟化钠溶液;低、中、高硒组分别饮用0.375、0.750、1.500 mg/L的亚硒酸钠溶液;氟+低、中、高硒组分别饮用50 mg/L的氟化钠和0.375、0.750、1.500 mg/L的亚硒酸钠两两组合的溶液.染毒6个月后,测大鼠肾脏组织的氧化水平和核因子κB(NF-κB)的表达量.结果 染氟组大鼠体质量[(695.95±55.89)g]低于对照组[(782.69±56.12)g,P＜0.01],染氟组谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性[(55.86±5.09)U/mgprot]与对照组[(68.66±4.52)U/mgprot]比较,差异无统计学意义(P＞0.05),但有降低的趋势.染氟组大鼠总抗氧化能力(T-AOC)水平[(7.54±1.35)U/mgprot]低于对照组[(9.03±0.37)U/mgprot,P＜0.05],染氟组丙二醛(MDA)水平[(3.86±0.31)nmol/mgprot]高于对照组[(3.14±0.32)nmol/mgprot,P＜0.05].氟+高硒组GSH-Px活性[(74.99±8.41)U/mgprot]高于染氟组[(55.86±5.09)U/mgprot,P＜0.05],MDA水平[(3.17±0.20)nmol/mgprot]低于染氟组[(3.86±0.31)nmol/mgprot,P＜0.05].染氟组、高硒组和氟+低硒组的NF-κB的表达水平(0.360±0.015,0.367±0.007,0.376±0.006)高于对照组(0.312±0.022,P均＜0.05),氟+高硒组(0.312±0.005)低于染氟组(0.360±0.015,P＜0.05).结论 1.500 mg/L硒是本实验条件下硒对慢性氟中毒致大鼠肾脏损伤的最佳保护作用剂量,NF-κB可能是硒拮抗氟中毒的药物靶点.

Abstract：

Objective To explore the protective effect of selenium, an antioxidant, on fluoride-induced renal injury in rats and find out the optimal level of selenium against fluoride toxicity and its valid molecular target.Methods All 80 male weanling SD rats were randomly divided into 8 groups by body weight as follows: normal control group(drinking tap water), fluoride exposed group (drinking water containing 50 mg/L of NaF), low, middle,high selenium exposed groups(drinking water containing 0.375, 0.750, 1.500 mg/L of Na2SeO3) and low, middle,high Se-fluoride groups (drinking water containing both 50 mg/L NaF and three doses of Na2SeO3 as abovementioned, respectively). After 6 months, the rats were killed then the oxidation level and nuclear factor κB(NF-κB)expression level in kidney were measured. Results The weight of the fluoride exposed group[(695.95 ± 55.89 )g]was significantly deceased than the controls[(782.69 ± 56.12)g, P ＜ 0.01]. Glutathione peroxidase(GSH-Px)activity of fluoride exposed group[(55.86 ± 5.09)U/mgprot] was not significantly different but decreased. Tatal antioxidant capacity (T-AOC) activity in fluoride exposed group [(7.54 ± 1.35)U/mgprot] significantly decreased than the controls[(9.03 ± 0.37 )U/mgprot, P ＜ 0.05]. In addition, a significant increase of malondialdehyde ( MDA )in fluoride exposed group[(3.86 ± 0.31 )mnol/mgprot, P ＜ 0.05] was observed than the controls[(3.14 ± 0.32)nmol/mgprot, P ＜ 0.05]. GSH-Px activity of high Se-fluoride group[(74.99 ± 8.41 )U/mgprot] was significantly higher than the fluoride exposed group[(55.86 ± 5.09)U/mgprot, P ＜ 0.05] and its MDA level[(3.17 ± 0.20)nmol/mgprot] was lower than the fluoride exposed group[(3.86 ± 0.31 ) nmol/mgprot, P ＜ 0.05]. NF-κB expression levels of fluoride group, high selenium group and low Se-fluoride group(0.360 ± 0.015,0.367 ± 0.007,0.376 ± 0.006,respecyively) were obviously increased compared with the controls(0.312 ± 0.022, P ＜ 0.05); it was significantly lower in high Se-fluoride group(0.312 ± 0.005) than in fluoride exposed group(0.360 ± 0.015, P ＜ 0.05). Conclusions Na2SeO3 of 1.5 mg/L is the optimal dose against chronic fluorosis on kidney injury under this experimental condition.NF-κB is likely to be a target molecule of the selenium as an antagonist on fluorosis.     

FibroTouch联合肝纤维化四项生化指标评估慢性血吸虫病肝病患者肝纤维化程度价值

目的　评价联合使用FibroTouch技术及肝纤维化四项生化指标检测对慢性血吸虫病肝病患者肝纤维化程度的效果。方法　以2021年1—3月昆山市第三人民医院收治的63例慢性血吸虫病肝病患者作为观察组,另选择同期在该院进行健康体检的50例健康志愿者作为对照组。用FibroTouch技术检测两组研究对象肝脏硬度值（LSM）,用化学发光法检测两组研究对象肝纤维化四项生化指标。绘制LSM、肝纤维化四项指标单独及联合应用诊断慢性血吸虫病肝病患者肝纤维化程度的受试者工作特征（ROC）曲线,计算曲线下面积（AUC）,评价单独及联合使用两种方法诊断肝纤维化程度的价值。结果　观察组共63例患者,其中男性28例、女性35例,平均年龄（65.34 ± 12.56）岁,平均体质指数（24.47 ± 11.05） kg/m2;对照组共50例,其中男性22例、女性28例,平均年龄（64.28 ± 13.10）岁,平均体质指数（25.12 ± 11.64） kg/m2。两组研究对象性别构成比（[χ2] = 0.002,P＞0.05）、年龄（t = 0.437,P＞0.05）、体质指数（t = 0.303,P＞0.05）差异均无统计学意义。观察组和对照组患者LSM [（8.65 ± 5.22） vs. （3.24 ± 1.10） kPa; t = 8.013, P < 0.05]、IV型胶原（IV⁃C） [（51.80 ± 9.45） vs. （30.10 ± 10.34） ng/L; t = 11.506, P < 0.05]、Ⅲ型前胶原（PC⁃Ⅲ） [（77.28 ± 17.22） vs.（48.62 ± 9.54） ng/L; t = 11.224, P < 0.05]、透明质酸酶（HA） [（39.55 ± 5.32） vs. （84.89 ± 10.34） ng/L; t = 30.158, P < 0.05] 和层黏连蛋白（LN） [（99.47 ± 7.37） vs. （61.93 ± 9.80） ng/L; t = 22.496, P < 0.05] 水平差异均有统计学意义,前者均高于后者。Spearman相关分析显示,慢性血吸虫病肝病患者肝纤维化程度与LSM、Ⅳ⁃C、PC⁃Ⅲ、HA、LN水平均呈正相关（rs = 0.675、0.421、0.517、0.550、0.539,P均< 0.01）。ROC曲线分析显示, LSM预测慢性血吸虫病肝病肝纤维化程度的AUC值为0.864（P < 0.001）,当约登指数最大时,LSM截断值为11.75 kPa,灵敏度为71.43%,特异度为84.00%;肝纤维化四项指标预测慢性血吸虫病肝病肝纤维化程度的AUC值为0.577～0.670,截断值为70.174～115.237 ng/L,灵敏度为17.46%～68.25%,特异度为71.01%～96.00%;两者联合应用诊断慢性血吸虫病肝病肝纤维化程度的灵敏度为92.06%,特异度为95.07%。结论　联合应用FibroTouch和肝纤维化四项指标检测诊断慢性血吸虫病肝纤维化灵敏度、特异度高,值得临床推广应用。     

弓形虫感染对大鼠脑组织神经丝mRNA表达和细胞免疫水平的影响

目的 探讨弓形虫感染对大鼠大脑组织神经丝(NF)mRNA表达和细胞免疫水平的影响.方法 将4周龄雄性SD大鼠分成两组(每组10只):弓形虫感染组腹腔感染2×10~(10)个/L弓形虫速殖子悬液2 ml;对照组腹腔注射灭菌生理盐水2 ml.9周后,应用RT-PCR法检测大鼠大脑组织中高相对分子质量NF(NF-H)、中相对分子质量NF(NF-M)和低相对分子质量NF(NF-L)mRNA表达水平:流式细胞术检测大鼠外周血CD3~+、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞;酶联免疫吸附试验测定其血清γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素4(IL-4)水平.结果 大鼠弓形虫感染9周后,大脑组织NF-L、NF-H mRNA表达量(0.51±0.06、0.68±0.05)较对照组(0.79±0.03、0.76±0.05)明显下降(t值分别为3.41、2.17,P<0.01或<0.05);NF-M mRNA表达量(0.69±0.02)与对照组(0.72±0.03)比较.差异无统计学意义(t=2.09,P>0.05).弓形虫感染组大鼠的CD4~+T细胞[(32.19±5.01)%]和CD8~+T细胞[(20.06±2.28)%]与对照组[(35.82±3.71)%、(22.06±3.90)%]比较,差异均无统计学意义(t值分别为1.69、1.88,P均>0.05).弓形虫感染组大鼠血清IFN-γ[(6.03±0.16)ng/L]、TNF-α[(18.05±1.93)ng/L]、IL-4[(15.76±1.59)ng/L]水平均高于对照组((4.77±0.13)、(9.54±1.57)、(5.67±0.42)ng/L,t值分别为2.81、2.74、2.63,P均<0.05].结论 弓形虫感染可导致大鼠大脑组织中NF亚单位mRNA表达水平下降,血清IFN-γ、TNF-α、IL-4水平升高.     

短期铁缺乏对大鼠甲状腺功能的影响

目的 研究短期铁缺乏对大鼠甲状腺功能的影响,并探讨其机制,为碘缺乏病的防治工作提供新的线索和思路.方法 选择健康SPF/VAF级初断乳SD雄性大鼠22只,按体质量随机分为对照组(饲料含铁量为65 mg/kg)和铁缺乏组(饲料含铁量为15 mg/kg),每组11只.喂养4周后,测定大鼠体质量和甲状腺质量,并计算甲状腺相对质量.取大鼠全血并分离血清,采用生化法检测血红蛋白、血清铁水平和总铁结合力;化学发光法检测血清游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)和促甲状腺激素(TSH)水平.甲状腺常规固定包埋切片后,免疫组化染色观察甲状腺过氧化物酶(TPO)蛋白表达情况.结果 铁缺乏组大鼠体质量[(214.3±18.1)g]比对照组[(243.8±16.4)g]减轻(t=4.002,P＜0.01),甲状腺绝对质量[(11.9±1.6)mg]比对照组[(13.4±1.3)mg]降低(t=2.369,P＜0.01),但甲状腺相对质量[(0.055±0.004)g/kg]与对照组[(0.055±0.006)g/kg]比较未见明显变化(t=0.162,P＞0.05).铁缺乏组大鼠血红蛋白水平[(100.4±8.9)g/L]和血清铁水平[(7.0±0.8)μmol/L]比对照组[(146.5±16.3)g/L、(26.1±5.1)μmol/L]降低(t值分别为8.233、12.277,P均＜0.01),总铁结合力[(124.8±6.3)μmol/L]比对照组[(74.0±4.6)μmol/L]升高(t=21.531,P＜0.01).铁缺乏组大鼠血清FT3、FT4和FT3/FT4[(4.71±0.53)、(29.69±2.63)pmol/L、0.16±0.02]均较对照组[(5.69±0.61)、(31.98±2.49)pmol/L、0.18±0.01]降低(t值分别为4.044、2.096、3.255,P＜0.01或＜0.05).铁缺乏组大鼠TPO蛋白表达强度较对照组减弱.结论 铁缺乏可导致甲状腺功能低下,可能与铁缺乏状态下TPO活性降低有关,碘铁联合补充可能会改善铁缺乏地区碘缺乏病防治的效果.

Abstract：

Objective To explore the effect of short-term iron deficiency on thyroid function of rat and its mechanism, and to provide new clues and ideas for prevention and control of iodine deficiency disorders. Methods Twenty-two healthy SPF/VAF level weaning male SD rats were randomly divided into control group(iron content in diet was 65 mg/kg) and iron deficiency group(iron content in diet was 15 mg/kg) by body weight, and 11 in each group respectively. After 4 weeks feeding, body weight and thyroid glands weight were measured, and the relative weight of thyroid gland was calculated. Rat whole blood was collected and serum was separated. Hemoglobin, serum iron levels and total iron binding capacity were tested using biochemical assay;serum free iodine thyroid three original acid (FT3), free thyroxine (FT4) and thyroid stimulating hormone (TSH) levels were detected by chemiluminescence;after thyroid were fixed in formalin, embedded with paraffin and sectioned regularly, and immunohistochemical stained, the protein expression of thyroid peroxidase(TPO) was observed. Results Compared with control group [(243.8 ± 16.4)g], iron deficiency group of animals had less body weight[(214.3 ± 18.1 )g, t = 4.002, P ＜ 0.01];there was a lower absolute thyroid weight in iron deficiency group[(11.9 ± 1.6)mg]than in control group[(13.4 ±1.3)mg, t = 2.369, P ＜ 0.01], but no significant changes of the relative weight of thyroid gland between the two groups[(0.055 ± 0.004),(0.055 ± 0.006)g/kg, t = 0.162, P ＞ 0.05]. Hemoglobin and serum iron in iron deficiency group were ( 100.4 ± 8.9)g/L and (7.0 ± 0.8)μmol/L, which were less than that in control group[( 146.5 ±16.3)g/L, (26.1 ± 5.1 )μmol/L, t = 8.233,12.277, all P ＜ 0.01]. Total iron binding capacity in control group was (74.0 ± 4.6)μ mol/L and that in iron deficiency group[(124.8 ± 6.3)μmol/L], and the difference was significant (t = 21.531, P＜ 0.01). At the same time, their serum hormones FT3, FT4 and FT3/FT4[(4.71 ± 0.53), (29.69 ±2.63)pmol/L, 0.16 ± 0.02]were lower than that in control group[(5.69 ± 0.61),(31.98 ± 2.49)pmol/L, 0.18 ±0.01, t = 4.044,2.096,3.255, P ＜ 0.01 or ＜ 0.05]. The expression of TPO protein decreased in iron deficiency group than in control group. Conclusions Iron deficiency reduces thyroid function, which perhaps is due to the reduction of TPO activity. Combined supplementation of iodine and iron will possibly improve the prevention effect on iodine deficiency disorder in iron deficiency areas.