肥大细胞抗原活化时钙离子信号变化的研究

目的为哮喘等Ⅰ型变态反应性疾病的靶向信号转导分子治疗寻找药物设计新靶点提供基础。方法应用钙离子荧光指示剂Fluo-3,通过流式细胞仪和激光共聚焦荧光显微镜分析肥大细胞RBL-2H3活化时细胞内钙离子浓度（［Ca2＋］i）的变化和细胞外钙离子浓度对释放组胺的影响,观察钙离子信号与肥大细胞活化的关系。结果抗原可使致敏RBL-2H3细胞迅速释放组胺和升高［Ca2＋］i,90~110s时最强达（525±42）nmol／L（n＝12）,激光共聚焦荧光显微镜观察到胞浆内充满绿荧光;胞外加入钙离子螫合剂EDTA后［ca2＋］i为（80±4）nmol／L,与基础［Ca2＋］i（79±3）nmol／L差异无显著性（P＞0．05,n＝12）;但显著增高磷酸酪氨酸浓度;加入佛波酯后再加入DNP－BSA,前后［Ca2＋］i差异无显著性（P＞0．05,n＝8）。结论　钙离子参与致敏肥大细胞的抗原活化过程。     

高糖对人大血管细胞钾依赖钠钙交换蛋白6表达的影响

目的 观察钾依赖钠钙交换蛋白6（NCKX6）基因在人主动脉内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞的表达，以及高糖对大血管NCKX6表达的影响。方法 Western印迹检测正常血管组织和2型糖尿病血管组织NCKX6蛋白的差异表达，RT—PCR检测NCKX6基因在人主动脉平滑肌细胞（HASMC）、人主动脉内皮细胞（HAEC）和人血管巨噬细胞（THP-1）中的表达，Northern印迹杂交检测高糖作用HAEC细胞NCKX6mRNA的表达差异。结果 Western印迹初步显示NCKX6在2例糖尿病患者大血管中明显高表达，RT—PCR观察到NCKX6基因主要在HAEC细胞中表达，而HAMSC和THP-1细胞中表达量低。Northern印迹杂交进一步观察到随着培养液D-葡萄糖浓度的增加，作用72h后HAEC细胞NCKX6mRNA表达明显增高，30mmol／LD-葡萄糖作用下NCKX6mRNA表达量可增加5—6倍。结论 NCKX6主要在人主动脉内皮细胞中表达，并且受到葡萄糖的调控。提示NCKX6与糖尿病大血管病变有密切的关系。     

安氏隐孢子虫ATP结合盒式转运蛋白1基因的克隆与离子转运

目的研究安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)ATP结合盒式转运(ATP-binding cassette,ABC)蛋白1基因对细胞内液和细胞外液中K~+、Ca~(2+)、Na~+和Mg~(2+)的转运作用。方法设计特异性引物,从安氏隐孢子虫基因组中PCR扩增CaABC1。构建真核表达质粒pEGFP-C1-CaABC1,采用脂质体转染法将重组质粒转染至小鼠肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)中表达,设空白组(未转染质粒组)、对照组(转染空质粒pEGFP-C1组)和转染组(转染重组质粒pEGFP-C1-CaABC1组)。用溶液离子浓度检测试剂盒检测IEC细胞内液和细胞外液中的K~+、Ca~(2+)、Na~+和Mg~(2+)的浓度。结果扩增出544 bp的CaABC1基因,构建了真核表达质粒载体pEGFP-C1-CaABC1。转染小鼠IEC后,空白组未观察到绿色荧光,对照组和转染组均观察到绿色荧光。在细胞内液中,空白组K~+、Ca~(2+)、Na~+和Mg~(2+)的浓度分别为(5.51±0.51)、(1.98±0.06)、(108.33±1.33)和(0.93±0.03)mmol/L,对照组分别为(6.25±0.70)、(1.90±0.13)、(107.73±1.79)和(0.87±0.05)mmol/L,转染组分别为(14.84±0.90)、(3.40±0.14)、(127.64±1.49)和(1.72±0.20)mmol/L。在细胞外液中,空白组K~+、Ca~(2+)、Na~+和Mg~(2+)的浓度分别为(12.72±0.83)、(3.72±0.03)、(116.83±1.04)和(2.02±0.18)mmol/L,对照组分别为(10.11±0.90)、(3.58±0.06)、(115.89±1.86)和(1.71±0.41)mmol/L,转染组分别为(5.77±0.21)、(1.29±0.18)、(96.21±1.19)和(0.64±0.02)mmol/L。转染组K~+、Ca~(2+)和Mg~(2+)与对照组相比,差异均有统计学意义(P0.05)。结论CaABC1蛋白具有协助转运K~+、Ca~(2+)和Mg~(2+)离子的作用。     

GFP基因真核表达质粒的构建及其在人胚肾293细胞中的表达

目的 克隆绿色荧光蛋白（GFP）基因并构建真核表达载体，观察其在人胚肾293（下称293细胞）细胞中的表达和分布，为制备自行设计的以λ噬菌体为载体的人类免疫缺陷病毒（HIV）核酸疫苗的阳性对照奠定基础。方法 以克隆好的pUC18／GFP为模板，根据Genbank中GFP的核苷酸序列设计引物，并在引物的5′端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点，特异性扩增GFP基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒，再经双酶切、连接构建含GFP编码基因的真核表达载体，酶切鉴定分析后，将该重组质粒通过脂质体介导，转染293细胞。荧光显微镜观察GFP在细胞内的表达和分布。结果重组质粒经Barn HⅠ、XhoⅠ双酶切成5．4kb与0．7kb的片断，表明表达载体pcDNA3．1（＋）中插入了GFP基因片断，测序结果表明编码框正确，并在293细胞中获得了表达，分布均匀。结论 pcDNA3．1（＋）／GFP真核表达载体已成功构建，并可在293细胞中表达。     

人HCN2基因编码的心脏起搏通道的电生理

目的将人超极化激活的阳离子通道基因2(human hyperpolarization-activated cation channel2,hHCN2)表达于HEK293细胞系上,观察其表达的通道的电生理特点。方法利用全细胞膜片钳技术,记录转染了hHCN2的HEK293细胞上的超极化激活的阳离子流(If)。结果转染hHCN2的HEK293细胞上表达If样内向电流,在超极化时激活,随刺激电压的延长而增大,半数最大激活电压为(-109.1±0.7)mV,曲线斜率为(-12.7±0.7)mV。刺激电压变负时,激活变快。-100mV和-160mV时,激活时间常数分别为(2.5±1.1)s和(217±29)ms。此电流是细胞外钾离子浓度依赖性的,对钠离子和钾离子的相对通透性为0.67。2mmol/L的Cs+可明显抑制此电流。结论目的基因hHCN2在HEK293细胞上成功表达,表达的蛋白能形成有功能的通道,产生If样电流。     

BTBD10基因的真核表达载体构建和亚细胞定位

目的构建BTBD10重组真核表达载体,观察BTBD10在HEK293细胞中的定位。方法利用PCR方法扩增BTBD10全长,经HindIII和BamHI酶切后连接入pGFP-C3真核表达载体,构建pGFP—C3-BTBD10重组表达质粒,转染HEK293细胞,利用激光共聚焦显微镜观察BTBD10在细胞中的定位。结果经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框。激光共聚焦显微镜观察到空质粒pGFP—C3转染后,整个细胞内弥散绿色荧光,而转染pGFP-C3-BTBD10重组载体后,可见绿色荧光分布于HEK293细胞膜一侧的细胞浆中,提示BTBD10定位于细胞浆中。结论成功构建人BTBD10真核表达载体,BTBD10定位于哺乳细胞的细胞浆中,可能发挥蛋白之间的相互作用。     

钙离子浓度对鼠白血病WEHI-3细胞 Caspase-3、Caspase-12和Bcl-2表达的影响

目的：研究细胞内钙离子浓度[Ca^2 ]i的升高对鼠白血病WEHI-3细胞株中Caspase-3、Caspase-12和Bel-2表达的影响。方法：在体外培养下，经不同浓度Econazole处理的WEHI-3细胞株用荧光指示剂Fura-2／AM于双波长荧光分光光度仪上测定[Ca^2 ]i。用western blot方法检测Caspase-3、Caspase-12和Bcl-2的表达。结果：随着[Ca^2 ]i提高，Caspase-12表达逐渐增加，Bcl-2表达逐渐减弱，而Caspase-3表达不变。结论：[Ca^2 ]i的升高对WEHI-3细胞株可诱发不通过Caspase-3途径的细胞凋亡。     

噻虫啉对表达多房棘球绦虫nAChR基因HEK293细胞内钙的影响

目的 构建多房棘球绦虫nAChR真核表达质粒并在HEK293细胞中表达，探讨噻虫啉(thiacloprid, Thia)对异源表达nAChR-HEK293细胞内游离钙离子的影响，为进一步研究nAChR基因的结构和功能奠定基础。方法 对多房棘球绦虫nAChR蛋白进行生物信息学分析。扩增nAChR序列全长，构建真核表达质粒pCMV-EGFP-nAChR并转染HEK293细胞。噻虫啉刺激后检测转染细胞内游离钙离子水平及全细胞膜电流。结果 nAChR为四次跨膜蛋白，α螺旋和无规则卷曲是该蛋白的主要组成成分。噻虫啉与nAChR活性位点附近PHE 207、PHE 24、ARG 244形成Pi-Pi相互作用，与LEU 60形成盐桥。PCR扩增在接近2 000 bp处观察到明显条带，经过测序证实获得nAChR序列与Wormbase Parasite数据库序列一致。重组质粒pCMV-EGFP-nAChR转染HEK293细胞成功表达nAChR蛋白于细胞膜上。噻虫啉促进nAChR-HEK293细胞内游离钙离子水平增加，并诱发nAChR-HEK293细胞内向型膜电流。结论 噻虫啉促进异源表达nAChR-HEK...     

微小RNA-1负性调控L-钙通道β_2亚基抑制心肌细胞肥大的机制研究

目的:研究微小RNA-1(miR-1)对L-钙通道β2亚基的调控作用及对心肌细胞肥大的影响。方法:ISO诱导心肌细胞肥大。qRT-PCR和Western blot法分别检测心肌细胞ANP、β-MHC、miR-1和β2亚基mRNA和蛋白表达水平。应用Targetscan预测miR-1的靶基因。构建的重组质粒和miR-1共转染HEK293细胞。转染miR-1mimic使其过表达。RNAi干扰β2蛋白表达。激光共聚焦显微镜检测心肌细胞内钙离子浓度。结果:①ISO诱导心肌细胞肥大时,miR-1表达明显降低;转染miR-1mimic使其过表达,心肌细胞表面积、ANP和β-MHC mRNA表达均显著降低。②Targetscan预测显示,L-钙通道β2亚基为miR-1的潜在靶基因;将miR-1和含β23′UTR报告基因共转染HEK293细胞,其萤光值显著降低;转染miR-1mimic使其过表达,可明显抑制β2蛋白的表达。③ISO诱导心肌细胞肥大时,β2蛋白表达明显增加;RNAi干扰β2蛋白表达可明显抑制心肌细胞表面积、ANP和β-MHC mRNA表达的增加;④转染miR-1mimic使其过表达或RNAi干扰β2蛋白表达,心肌细胞内钙离子浓度均明显降低。结论:L-钙通道β2亚基为miR-1的靶基因。MiR-1可能通过负性调控L-钙通道β2亚基的表达,降低细胞内钙离子浓度,抑制心肌细胞肥大。     

人QKI6基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达鉴定

目的:构建人RNA结合蛋白（QKI6）基因的重组腺病毒载体,并在心肌细胞中表达。方法:利用PCR技术,从原始质粒中扩增出QKI6目的基因片段,酶切后连接到pShuttle-GFP-CMV重组穿梭质粒上。再将pShuttle-GFP-QKI6 转移到pAdxsi载体上,得到带有QKI6目的基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6。酶切、PCR鉴定重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6,并完成扩增与纯化。经Pacl线性化后,转染HEK 293细胞进行腺病毒包装,并测定病毒的滴度及目的基因的表达。以包装好的重组腺病毒感染大鼠新生心肌细胞,通过GFP表达观察病毒感染效率。用PCR检测目的基因QKI6在感染的心肌细胞中的表达。结果:含QKI6基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6构建成功,酶切、PCR鉴定及DNA测序证实了其正确性。重组腺病毒可重复感染HEK 293细胞,荧光显微镜下可见GFP表达,且QKI6基因的表达明显升高。包装的重组腺病毒可有效感染新生心肌细胞,并表达目的基因QKI6。结论:成功地构建QKI6基因重组腺病毒载体,以其感染293细胞及新生心肌细胞后,可有效地表达QKI6基因,为进一步研究QKI6基因在糖尿病心肌细胞凋亡的机制以及在糖尿病性心肌病治疗中的应用奠定实验基础。     

pEGFP-C3/SUMF2重组真核表达载体的构建及在人支气管上皮细胞中的表达

目的构建与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）融合的人硫酸酯酶修饰因子2（SUMF2）真核表达载体。方法用RT-PCR技术从人支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cells,HBEC）获得SUMF2的cDNA模板,PCR方法扩增人SUMF2基因。用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切扩增人SUMF2基因及质粒pEGFP-C3;将2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10;挑取菌落培养,提取质粒,酶切鉴定,测序;将测序正确的重组载体用脂质体法转染HBEC,荧光倒置显微镜观察。提取转染细胞的总蛋白进行Western blot检测。结果扩增出1条约857bp的片段,与预期的SUMF2大小相符。酶切结果显示重组质粒pEGFP-C3/SUMF2被切成2条片段,其中1条为pEGFP-C3载体,另1条为目的片段。经测序鉴定,序列与GenBank（NM₀15411.2）中的序列高度同源。荧光倒置显微镜观察显示,人SUMF2基因主要在内质网表达。Western blot结果显示在相对分子质量为37×103处有一蛋白条带,与预期大小相符。结论成功构建重组表达载体pEGFP-C3/SUMF2,为进一步研究SUMF2对IL-13的作用奠定了实验基础。     

人Rob04基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建人Rob04（hRob04）基因的重组腺病毒表达载体,为研究Rob04的功能和作用机制以及Rob04的基因治疗奠定基础。方法采用DNA重组与细菌内同源重组技术,通过PCR方法以hRob04的表达质粒为模板扩增得到hRob04的编码序列,克隆到穿梭质粒pDC316-hRob04中,经测序验证后,将骨架质粒（pBHGlox_E1）和穿梭质粒共转染到HEK293细胞中,同源重组产生重组腺病毒;包装收获病毒颗粒;PCR鉴定该重组腺病毒是否携带目的基因。结果PCR及限制性内切酶酶切鉴定表明成功构建携带人Rob04基因的腺病毒载体。结论运用同源重组技术能够构建携带人Rob04基因的重组腺病毒载体。     

FAT10真核质粒的构建、转染及其蛋白的表达

目的构建类泛素基因FAT10的真核表达质粒,观察其蛋白在转染人胚肾细胞系293T中的表达。方法采用RT-PCR法扩增FAT10全长基因片段后,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FAT10克隆至pcDNA5-FRT表达载体并行酶切鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000分别介导空质粒（空载组）及重组质粒（FAT10质粒组）转染293T细胞,以脂质体混合PBS（PBS组）及未加入脂质体（未转染组）作为对照。转染48 h后,收集细胞。采用Western blot法检测293T细胞中的FAT10蛋白。结果 pMD18-FAT10重组质粒经双酶切获得498 bp片段,对PCR产物及498 bp片段进行测序,结果与GenBank报道序列完全一致。FAT10质粒组、未转染组、空载体组和PBS组FAT10蛋白表达量分别为1.556±0.072、0.334±0.051、0.425±0.095、0.382±0.063,FAT10质粒组与未转染组、空载体组和PBS组比较,P均〈0.05。结论成功构建了FAT10的真核表达质粒pcDNA5-FRT-FAT10,FAT10蛋白在293T细胞中高表达。     

pSS—CAD—Proins载体的构建与细胞水平功能鉴定

目的构建可随ATP浓度变化而在内质网与葡萄糖反应蛋白78（GRP78）可逆性结合与解聚的人胰岛素原基因表达载体,并研究其在HepG2细胞中的表达及葡萄糖对其分泌的影响。方法人工合成含胰岛素信号肽（ss）及条件结合／解聚区域（CAD）的多聚核苷酸链,将其与人胰岛素原基因相连,构建SS—CAD-人胰岛素原表达载体（pSS-CAD-Proins）,将其经脂质体转染HepG2细胞,于不同浓度葡萄糖的培养液中培养,检测培养液中的胰岛素浓度并提取细胞总RNA。结果成功构建pSS-CAD-Proins表达质粒。转染HepG2细胞后48h,在葡萄糖浓度分别为5、15及25mmol／L的培养基中,胰岛素分泌量分别为（4．73±0．52）、（8．84±0．43）及（14．15±0．32）mU／L,不同葡萄糖浓度诱导的胰岛素mRNA表达量明显不同。结论pSS—CAD-Proins载体能够在HepG2细胞中成功表达,并且胰岛素的分泌及转录受葡萄糖的调控。     

GFP示踪FLAG抗原表位标记BMP2转基因腺病毒穿梭质粒的构建

目的构建同时表达具有抗原表位FLAG标记的重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP2）目的蛋白和示踪绿色荧光蛋白（GFP）报告分子的腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-BMP2＋-IRES-hrGFP-1。方法采用PCR技术对pcDNA3-BMP2携带的BMP2基因诱变,去除翻译终止密码子后的基因序列并添加新的酶切识别位点XhoⅠ。测序检测诱变情况,将诱变后的BMP2基因定向导入pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1,将质粒分别转染人胚肾细胞HEK293A和兔骨髓间充质干细胞（MSCs）。通过限制性内切酶酶切图谱分析该质粒;采用荧光显微镜检查和免疫组化SP法测定HEK293A中的GFP和MSCs中的BMP2,行重组腺病毒穿梭质粒鉴定。结果质粒pShuttle CMV-BMP2＋-IRES-hrGFP-1经双酶切鉴定图谱分析构建正确,HEK293A、MSCs中均有GFP和BMP2表达。结论 pShuttle CMV-BMP2＋-IRES-hrGFP-1构建成功。     

腺相关病毒介导的仓鼠δ-SG基因在TO-2型仓鼠骨髓间充干细胞的表达

目的构建含有δ-SG基因的腺相关病毒载体并检测经腺相关病毒介导基因转染的TO-2型仓鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中目的基因的表达。方法用EcoRI酶和XhoI酶酶切含有δ-SG基因的pUC57-SG质粒,获得δ-SG基因。片段回收后定向插入腺相关病毒载体质粒pITR-GFP中重组成pITR-GFP-SG,并同pXX680、pHelper三质粒经钙磷沉淀法共转染HEK293细胞,斑点杂交法测定重组病毒颗粒滴度,再将重组病毒颗粒转染TO-2型仓鼠的MSCs,利用RT-PCR法,免疫荧光检测目的基因的表达,MTT检测转染细胞增殖能力。结果成功构建了δ-SG基因的腺相关病毒载体。含δ-SG基因的腺相关病毒感染TO-2型仓鼠MSCs48h后,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳出现884bp-DNA片段;免疫荧光检测显示TO-2型仓鼠MSCs中呈现绿色颗粒,大小深浅不一;MTT证实转染后细胞的增殖能力未受明显影响。结论采用腺相关病毒介导的方法,可以将δ-SG基因导入TO-2型仓鼠的MSCs并成功表达。     

融合基因CPA—LTB在大肠埃希菌中表达条件的优化

目的在构建含有CPA—LTB融合基因的重组菌株基础上,对其表达条件进行优化,以获得高效表达的CPA—LTB融合蛋白。方法采用限制性内切酶酶切鉴定含CPA—LTB融合基因的重组质粒pCPA—LTB,然后采用均匀设计法对影响目的蛋白表达的因素和水平进行优化：设计实验方案,分别以不同浓度的IPTG和乳糖为诱导剂诱导融合蛋白的表达,SDS-PAGE检测不同条件下融合蛋白的表达情况。结果双酶切鉴定重组质粒含有CPA-LTB融合基因（1700bp）,且阅读框架正确。以IPTG为诱导剂在pH7．5、诱导温度31℃、转化菌菌液A-500值为1．2、IPTG终浓度0．4mmol／L诱导6h,目的蛋白表达量最大,占菌体总蛋白相对含量的54％;以乳糖为诱导剂在pH6．5、温度34℃、转化菌菌液A-500值为0．6、乳糖终浓度0．1mmol／L诱导6h,融合蛋白的表达量最大,占菌体总蛋白相对含量的61％。优化前后两种诱导剂诱导表达的蛋白量分别增加63％和42％。结论CPA—LTB融合基因表达质粒转化大肠埃希菌在优化的表达条件下高效表达目的蛋白,为研制α毒素基因工程亚单位疫苗奠定了基础。     

丙型肝炎病毒HLA-A2限制性复合多表位基因重组腺病毒的包装、筛选及鉴定

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）HLA-A2限制性复合多表位基因的重组转移质粒pAdtrack-CMV-Ub-Mep,转染HEK293细胞,包装重组腺病毒rAd-Ub-Mep。方法复合表位Ub-Mep基因克隆到pAdTrack-CMV穿梭质粒,得到重组的穿梭质粒pAdtrack-CMV-Ub-Mep,将穿梭质粒pAdtrack-CMV-Ub-Mep和腺病毒骨架质粒pAdEasy1共转染HEK293细胞,产生重组腺病毒rAd-Ub-Mep,通过检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达和PCR扩增目的基因的方法鉴定重组腺病毒,并测定重组腺病毒滴度。结果经酶切鉴定、PCR鉴定和荧光分析,均证实得到重组的腺病毒。测定病毒滴度为1.2×1011cfu/L。结论成功包装出重组腺病毒rAd-Ub-Mep,构建了HCV HLA-A2限制性多表位基因的重组腺病毒疫苗,为进一步研究HLA-A2限制性复合多表位基因诱导的细胞免疫应答奠定了基础。