右美托咪定联合Tol样受体4抑制剂对缺氧复氧心肌细胞凋亡和炎症反应的影响及其机制

目的探讨右美托咪定(DEX)联合Toll样受体4(TLR4)抑制剂TAK-242对缺氧复氧(H/R)心肌细胞凋亡和炎症反应的影响及其机制。方法心肌细胞H9C2分为对照(Con)组、H/R组(H/R损伤)、DEX组(1.0μmol/L DEX,再行H/R损伤)、TAK-242组(30μmol/L TAK-242,再行H/R损伤)和DEX+TAK-242组(30μmol/L TAK-242及1.0μmol/L DEX,再行H/R损伤处理)。各组细胞复氧培养6 h后,采用MTT法、流式细胞仪、试剂盒、酶联免疫吸附法检测细胞增殖、凋亡、乳酸脱氢酶(LDH)释放率、白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,Western blot检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、裂解的caspase-3(cleaved caspase-3)、TLR4和核因子B p65(NF-κB p65)蛋白表达。结果五组细胞凋亡率、LDH释放率、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、TLR4、NF-κB p65蛋白表达水平、IL-1β、TNF-α含量比较差异均有统计学意义(F=316.938、330.004、839.933、169.750、378.365、476.535、298.527、99.219、293.498,P<0.05)。与Con组相比,H/R组细胞的凋亡率、LDH释放率、Bax、cleaved caspase-3、TLR4和NF-κB p65蛋白表达水平、细胞上清液中IL-1β和TNF-α含量均明显升高(均P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平明显降低(均P<0.05)。与H/R组相比,DEX组、TAK-242组和DEX+TAK-242组的细胞凋亡率、LDH释放率、Bax蛋白、cleaved caspase-3、TLR4和NF-κB p65蛋白、IL-1β、TNF-α的表达水平均明显降低,Bcl-2蛋白表达水平明显升高(均P<0.05)。与DEX组、TAK-242组相比,DEX+TAK-242组的细胞凋亡率、LDH释放率、Bax、cleaved caspase-3、TLR4和NF-κB p65蛋白表达、IL-1β、TNF-α表达水平更低,Bcl-2蛋白的表达更高(均P<0.05)。结论DEX和TAK-242联合可协同抑制H/R引起的心肌细胞凋亡和炎症反应,其作用机制可能与协同抑制TLR4/NF-κB通路有关。     

趋化因子Fractalkine与心肌细胞缺血再灌注损伤

目的 探讨一种新的化学趋化因子Fractalkine(FKN)与缺血再灌注关系及其信号转导途径.方法 分别培养心肌细胞(MC)、心肌成纤维细胞(CFs)、人脐静脉内皮细胞(ECV304),利用缺氧(缺血液)和复氧液(再灌注液)造成3种细胞的缺氧复氧模拟缺血再灌注,观察3种细胞存活率及RT-PCR检测的FKN的mRNA表达;对人脐静脉内皮细胞给NF-κB特异性抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸酯(PDTC),检测的FKN的mRNA表达变化.结果 1)CFs在整个缺氧复氧过程中没有FKN的表达.2)ECV304缺氧前与复氧即刻FKN无表达,缺氧复氧后0.5、1、2、3、4 h FKN表达增加,分别是(0.21±0.02)、(0.43±0.02)、(0.58±0.02)、(0.40±0.02)、(0.13±0.02),于复氧后2 h到达表达最高值(全部P＜0.01).3)MC缺氧复氧后0.5、1、2 h FKN表达增加,分别是(0.12±0.01)、(0.34±0.05)、(0.41±0.05),于复氧后2 h到达表达最高值(P均＜0.01).4)每个时间段MC的FKN表达均低于ECV304(P＜0.01).5)PDTC(3、10 μmol/L)是 NF-κB的抑制剂,可明显抑制ECV的FKN mRNA的表达(P＜0.01).结论 FKN参与心肌缺血再灌注过程,内皮细胞是表达FKN的主要细胞;NF-κB可能参与FKN表达的信号转导通路.     

趋化因子Fractalkine与心肌细胞缺血再灌注损伤

目的探讨一种新的化学趋化因子Fractalkine(FKN)与缺血再灌注关系及其信号转导途径。方法分别培养心肌细胞(MC)、心肌成纤维细胞(CFs)、人脐静脉内皮细胞(ECV304),利用缺氧(缺血液)和复氧液(再灌注液)造成3种细胞的缺氧复氧模拟缺血再灌注,观察3种细胞存活率及RT-PCR检测的FKN的mRNA表达;对人脐静脉内皮细胞给NF-κB特异性抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸酯(PDTC),检测的FKN的mRNA表达变化。结果1)CFs在整个缺氧复氧过程中没有FKN的表达。2)ECV304缺氧前与复氧即刻FKN无表达,缺氧复氧后0.5、1、2、3、4hFKN表达增加,分别是(0.21±0.02)、(0.43±0.02)、(0.58±0.02)、(0.40±0.02)、(0.13±0.02),于复氧后2h到达表达最高值(全部P<0.01)。3)MC缺氧复氧后0.5、1、2hFKN表达增加,分别是(0.12±0.01)、(0.34±0.05)、(0.41±0.05),于复氧后2h到达表达最高值(P均<0.01)。4)每个时间段MC的FKN表达均低于ECV304(P<0.01)。5)PDTC(3、10μmol/L)是NF-κB的抑制剂,可明显抑制ECV的FKN mRNA的表达(P<0.01)。结论FKN参与心肌缺血再灌注过程,内皮细胞是表达FKN的主要细胞;NF-κB可能参与FKN表达的信号转导通路。     

不规则趋化因子对人单个核细胞p38和转录因子-κB的影响

目的探讨不规则趋化因子(FKN)在动脉粥样硬化形成中的作用及其可能的信号转导途径,以及FKN影响人单个核细胞表达NFκB过程与Ras/p38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路的相关性。方法采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,将细胞预处理后分为:空白1组、FKN 1组、FKN+Ras抑制剂组(FTI-277组)、空白2组、FKN 2组、FKN|p38抑制剂组(SB203580组)。分别于30 min时,采用Western blot方法对磷酸化p38及NF-κB进行半定量测定。结果与空白1组、空白2组比较,FKN 1组、FKN 2组NF-κB和p38相对吸光度值明显增加(P<0.01),与FKN 1组、FKN 2组比较,FTI-277组、SB203580组NF-κB和p38相对吸光度值明显降低(P<0.01)。结论 FKN可以使NF-κB表达和磷酸化p38增加;Ras/p38介导了FKN刺激单个核细胞引起NF-κB活化的增加;Ras/p38途径为FKN诱导NF-κB活化的信号转导通路之一。     

吡咯烷二硫氨基甲酸脂对缺氧再给氧冠状动脉内皮细胞凋亡的影响

目的:探讨缺氧再给氧(H/R)时冠状动脉内皮细胞(CAEC)氧自由基清除功能和细胞凋亡率的变化及抗氧化剂吡咯烷二硫氨基甲酸脂(PDTC)对它的影响。方法:将体外培养的猪CAEC分为3组。对照组:未经处理;H/R组:作H/R处理;PDTC组:在H/R前于培养液中加入PDTC。分别检测各组细胞谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量、核转录因子(NF-κB)表达及细胞凋亡率。结果:实验期对照组GSH、MDA含量、NF-κB的表达及细胞凋亡率无明显改变;H/R及PDTC组GSH含量明显低于对照组同期,而MDA含量、NF-κB表达及细胞凋亡率明显高于对照组同期;但PDTC组GSH含量明显高于H/R组同期,MDA含量、NF-κB的表达及细胞凋亡率明显低于H/R组同期。结论:H/R使细胞GSH含量明显减少,MDA含量、NF-κB的表达及细胞凋亡率明显增加;PDTC能有效降低NF-κB的表达,改善细胞氧自由基清除功能,降低细胞凋亡率,减轻H/R损伤。     

N-乙酰半胱氨酸通过抑制活性氧-p38通路减轻缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡

目的 探讨N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)抑制缺氧复氧(hypoxia-reoxygenation,H/R)诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的机制.方法 心肌细胞培养48 h后随机分为对照组、缺氧复氧组(H/R组)、缺氧复氧+NAC组(100 p.mol/L)(H/R+NAC组).H/R组心肌细胞先缺氧6 h,随后复氧72 h,H/R+NAC组在H/R组细胞培养液中加NAC(100 μmol/L).采用锥虫蓝检测心肌细胞活性.流式细胞仪与Annexin V测定细胞早期凋亡.TUNEL检测细胞晚期凋亡.活性氧绿色荧光显色试剂检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)浓度.RT-PCR检测bcl2、bax基因mRNA水平.Western blot检测bel2、bax、p38与pp38基因蛋白水平.结果 H/R组有活性的细胞数量为74.9%,显著低于对照组(93.5%,P<0.01),H/R+NAC组有活性的细胞数为89.9%,显著高于H/R组(P<0.01).H/R组早期凋亡的心肌细胞数为25.2%,显著高于对照组(6.5%,P<0.01),H/R+NAC组早期凋亡的细胞数为11.1%,显著低于H/R组(P<0.01).H/R组晚期凋亡的心肌细胞数为33.5%,显著高于对照组(3.5%,P<0.01),H/R+NAC组晚期凋亡的细胞数为13.5%,显著低于H/R组(P<0.01).H/R组心肌细胞ROS产生显著高于对照组,H/R+NAC组心肌细胞ROS产生显著低于H/R组.H/R组pp38/p38条带密度比值(13.40)也显著高于对照组(3.89).H/R+NAC组pp38/p38条带密度比值(1.95)显著低于H/R组(13.4),P<0.01.H/R组bcl2 mRNA与蛋白水平显著低于对照组,bax mRNA与蛋白水平显著高于对照组.H/R+NAC组bcl2 mRNA与蛋白水平显著高于H/R组.H/R+NAC组bcl2/bax mRNA水平比值(1.79)显著高于H/R组(1.22),P<0.05,但仍低于对照组(1.85).H/R+NAC组bcl2/bax条带密度比值(0.71)显著高于H/R组(0.50),P<0.05,但仍低于对照组(2.53).结论 NAC通过抑制ROS-p38通路减轻缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡,这一作用具有潜在的临床应用价值.     

RhoA/ROCK通路在缺氧复氧诱导的人心肌AC16细胞损伤中的作用机制

目的 探讨Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)通路在缺氧复氧(H/R)诱导的人心肌AC16细胞损伤中的作用及其机制。方法 将体外培养的AC16细胞分为对照组(正常培养)、H/R组(构建H/R模型)、H/R＋NC-siRNA组(转染NC-siRNA后构建H/R模型)和H/R＋RhoA-siRNA组(转染RhoA-siRNA后构建H/R模型),采用MTT法检测AC16细胞存活率,流式细胞术检测AC16细胞凋亡率,比色法检测AC16细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性和Caspase-3活性,ELISA检测AC16细胞上清液中白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,试剂盒检测AC16细胞超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平,实时荧光定量PCR检测AC16细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、核因子κB(NF-κB)p65及IkB激酶(IKK)的mRNA表达水平,Western blot检测AC16细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、NF-κB p65、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)p65及IKK的蛋白表达水平。结果 与对照组比较,H/R组细胞存活率、SOD水平显著降低,细胞凋亡率、LDH活性、Caspase-3活性、MDA水平和细胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKK mRNA与蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05);H/R＋NC-siRNA组和H/R组之间上述各指标差异均无统计学意义(P＞0.05);与H/R＋NC-siRNA组比较,H/R＋RhoA-siRNA组细胞存活率、SOD水平显著升高,细胞凋亡率、LDH活性、Caspase-3活性、MDA水平和细胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKK mRNA与蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05)。结论 靶向抑制RhoA/ROCK通路可通过降低炎症反应、氧化应激和细胞凋亡减轻H/R诱导的心肌细胞损伤。     

HMGB1 siRNA对缺氧复氧胃黏膜上皮细胞凋亡的影响及机制

目的探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)siRNA对缺氧复氧胃黏膜上皮细胞凋亡的影响及机制。方法将体外培养的人胃黏膜上皮GES-1细胞随机分为对照组(正常培养)、A/R组(缺氧复氧培养)、A/R+si NC组(转染Control siRNA后,缺氧复氧培养)和A/R+si HMGB1组(转染HMGB1 siRNA后,缺氧复氧培养),MTT法检测细胞的活力,流式细胞仪检测细胞的凋亡,Western blotting检测细胞中HMGB1、NF-κB p65和IκB-α、Bcl-2和Bax蛋白表达,ELISA法检测LDH含量。结果 A/R处理能够引起GES-1细胞存活率降低,细胞凋亡率和LDH含量升高,Bcl-2和IκB-α蛋白表达下降,HMGB1、Bax和NF-κB p65蛋白表达上调;HMGB1siRNA则能够抑制A/R的作用,升高GES-1细胞存活率,降低细胞凋亡率和LDH含量,上调Bcl-2和IκB-α蛋白表达,下调HMGB1、Bax和NF-κB p65蛋白表达。结论缺氧复氧可引起胃黏膜上皮GES-1细胞中HMGB1表达升高,下调HMGB1表达可明显抑制缺氧复氧诱导的细胞凋亡,其机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。     

吡格列酮对培养大鼠大脑皮质神经元氧-葡萄糖剥夺/复氧后PPARγ、NF-κB c-Rel和Bcl-xL表达的影响

目的 探讨吡格列酮(pioglitazone,PIO)对Wistar大鼠大脑皮质神经元氧-葡萄糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)后过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptors γ,PPARγ)、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)亚基c-Rel以及抗凋亡因子Bcl-xL表达的影响.方法 大鼠大脑皮质神经元体外原代培养,建立OGD/R模型,分为正常组、OGD4 h/R6 h组、OGD4 h/R12 h、OGD4 h/R6 h+PIO组、OGD4 h/R6 h+PPARγ抑制剂T0070907 (TIO)组、OGD4 h/R12 h+PIO组以及OGD4 h/R12 h+TIO组.采用蛋白质印迹法检测神经元内PPARγ和NF-κB c-Rel蛋白表达,采用逆转录-聚合酶链反应检测神经元内Bcl-xL mRNA表达.结果 蛋白质印迹分析显示,OGD/R后PPARγ和NF-κB c-Rel蛋白表达水平较正常组显著性增高(P＜0.01),给予PIO后PPARγ和NF-κB c-Rel蛋白表达水平进一步增加,显著高于单纯OGD4 h/R6 h组和OGD4 h/R12 h组(P＜0.01),而给予TIO后PPARγ和NF-κB c-Rel蛋白表达减少,显著性低于单纯OGD/R组(P＜0.05)以及相应PIO组(P＜0.01).逆转录-聚合酶链反应分析显示,OGD4 h/R6 h组Bcl-xL mRNA表达水平较正常组显著性增高(P＜0.01),PIO组Bcl-xL mRNA表达水平显著性高于单纯OGD4 h/R6 h组和OGD4 h/R12 h组(P＜0.01),给予TIO后Bcl-xL mRNA表达减少,显著性低于单纯OGD/R组(P＜0.05)以及相应PIO组(P＜0.01).结论 PIO可上调培养大脑皮质神经元OGD/R后PPARγ蛋白表达,进而增加NF-κB亚基c-Rel调控的抗凋亡因子Bcl-xLmRNA表达,这可能是PPARγ神经保护作用的部分机制.     

Corin基因通过NF-κB信号通路对心肌细胞增殖凋亡的机制研究

目的探讨Corin基因通过核转录因子-κB(NF-κB)信号通路对心肌细胞增殖凋亡的影响。方法通过脂质体LipofectamineTM2000将过表达Corin转染H9c2细胞及H2O2刺激细胞,细胞分为Control组、pcDNA3.1组、H2O2组(150μmol/L的H2O2处理细胞6 h)和pcDNA3.1-Corin组(转染pcDNA3.1-Corin后再用H2O2处理细胞6 h),BAY 11-7082作为NF-κB信号通路抑制剂,各组细胞活力通过CCK8法检测,凋亡率通过流式细胞仪检测,通过Western blotting检测各组细胞中增殖相关蛋白ki67、凋亡相关蛋白p53及NF-κB信号通路NF-κB和IκBα的蛋白表达。结果 H2O2刺激的H9c2细胞中Corin的表达明显降低,过表达Corin后Corin的表达显著升高;与pcDNA3.1组比较,H2O2组细胞活力及ki67和IκBα的表达均显著降低,凋亡率及p53和NF-κB的表达均显著升高(P0.05);与H2O2组比较,pcDNA3.1-Corin组细胞活力及ki67和IκBα的表达均显著升高,凋亡率及p53和NF-κB的表达均显著降低(P0.05);与pcDNA3.1-Corin组比较,pcDNA3.1-Corin+BAY 11-7082组细胞活力及ki67和IκBα的表达均显著升高,凋亡率及p53和NF-κB的表达均显著降低(P0.05)。结论过表达Corin可通过抑制NF-κB信号通路提高心肌细胞活力及降低细胞凋亡。     

肝孤核受体激动剂对间充质干细胞的抗缺氧复氧损伤作用及机制

目的探讨肝孤核受体(LXR)激动剂对脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)缺氧损伤的保护作用及可能机制。方法酶消化法分离稳定表达萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因的小鼠AD-MSCs,流式细胞术检测CD90、CD44、CD34、CD45细胞表面标记物。3代AD-MSCs分为7组:对照组;缺氧6 h/复氧2 h组(缺氧复氧组);缺氧/复氧+DMSO组(DMSO组);缺氧复氧+不同浓度LXR激动剂T0901317干预组(1μmol/L组、5μmol/L组、10μmol/L组、15μmol/L组)。运用Fluc报告基因生物发光成像技术对AD-MSCs细胞增殖进行定量评价,免疫印迹法检测细胞NF-κB表达水平,ELISA法检测AD-MSCs的白细胞介素6(IL-6)、TNF-α分泌水平。结果流式细胞术结果显示.AD-MSCs呈CD44(+)、CD90(+)、CD34(-)、CD45(-)。光学成像结果显示,AD-MSCs细胞数与Fluc平均生物发光信号强度呈正相关(r~2=0.97)。与对照组比较,缺氧复氧组AD-MSCs分泌TNF-α、IL-6、NF-κB明显升高;与缺氧复氧组比较,10μmol/L组AD-MSCs分泌TNF-α、IL-6、NF-κB明显减少(P<0.05,P<0.01)。结论 LXR激动剂可以促进缺氧复氧损伤后AD-MSCs的存活,并能通过NF-κB信号途径抑制炎性因子IL-6、TNF-α的释放,可为干细胞移植治疗心肌缺血再灌注损伤提供新的细胞保护方法。     

下调CopineⅠ抑制缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡

目的 研究Copine Ⅰ（CPNE1）对缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation,H/R）诱导H9c2细胞凋亡的作用及可能的机制。 方法 以H9c2心肌细胞为研究对象,建立H/R模型,细胞被随机分为对照组（CON）、H/R组、阴性对照（NC）+H/R和CPNE1 siRNA+H/R组,阻断实验用NF-κB的阻断剂PDTC（10 μmol/L）预处理细胞30 min。RT-PCR和Western blot方法用于检测CPNE1表达水平。细胞乳酸脱氢酶（LDH）活性采用ELISA方法检测。细胞经Annexin-V/PI染色后用流式细胞仪检测凋亡率,Western blot方法检测claved-caspase3（c-caspase3）、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。细胞中NF-κB活性采用ELISA方法检测。 结果 与CON组相比,H/R组CPNE1表达水平上调、LDH活性升高、凋亡率上升、c-caspase3和Bax蛋白表达升高、Bcl-2蛋白表达水平下降。与NC+H/R组相比,CPNE1 siRNA+H/R组细胞的LDH活性下降、凋亡率降低、c-caspase3和Bax蛋白表达减少、Bcl-2表达增多。此外,沉默CPNE1细胞核中NF-κB活性增强且蛋白表达上升,PDTC可逆转CPNE1 siRNA对细胞凋亡的抑制作用。 结论 下调CPNE1的表达能够抑制H/R诱导的H9c2细胞凋亡,其可能机制是通过增强NF-κB活性发挥心肌保护作用。     

吡格列酮保护缺氧复氧诱导乳鼠心肌细胞凋亡的离子通道机制

目的观察吡格列酮对缺氧复氧大鼠心肌细胞凋亡的保护作用,并探讨保护作用与ATP敏感性钾通道开放的关系。方法原代培养的SD乳鼠心肌细胞,分为8组:溶媒组、缺氧复氧组、0.1μmol/L吡格列酮组、1 μmol/L吡格列酮组、2μmol/L吡格列酮组、2μmol/L吡格列酮+30μmol/L HMR-1098组、2μmol/L吡格列酮+0.5mmol/L 5-羟基葵酸盐(5-HD)组、2μmol/L吡格列酮+30μmol/L HMR-1098+0.5 mmol/L 5-HD组。利用膜联蛋白-V与碘化丙啶双染法及Hoechst 33258染色法检测心肌细胞凋亡。结果缺氧复氧组乳鼠心肌细胞发生明显凋亡,经吡格列酮预处理后减少心肌细胞凋亡(P<0.05);与0.1μmol/L、1μmol/L及2μmol/L吡格列酮组比较,5-HD削弱吡格列酮抑制心肌细胞凋亡的作用(P<0.05),HMR-1098无作用(P>0.05)。结论吡格列酮对缺氧复氧乳鼠心肌细胞凋亡具有保护作用,线粒体ATP敏感性钾通道的开放可能介导了吡格列酮的保护作用。     

黄芪多糖对大鼠缺氧/复氧诱导的心肌细胞自噬及凋亡抑制作用的机制探讨

目的：探究黄芪多糖（APS）通过调控高迁移率族蛋白1/Toll样受体4/核转录因子-κB(HMGB1/TLR4/NF-κB)信号通路对大鼠缺氧/复氧（H/R）诱导的心肌细胞自噬及凋亡的抑制作用。方法：建立H9C2心肌细胞H/R损伤模型并分为4组：对照组、H/R组、APS组和HMGB1抑制剂组。CCK-8法和EdU染色法检测细胞增殖能力;酶联免疫吸附试验检测细胞肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6含量;透射电镜观察细胞自噬小体的形成;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（AnnexinV-FITC/PI）双染法检测细胞凋亡;实时定量PCR检测细胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法检测细胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)、P62、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(MAP1LC3,缩写为LC3)-Ⅱ蛋白表达水平。结果：与对照组相比,H/R组细胞增殖能力明显减弱,凋亡及自噬水平明显增加,细胞内可见大量自...     

Toll样受体4和核因子-κB信号通路在溶血磷脂酸致动脉粥样硬化中的作用

目的探讨Toll样受体4(TLR4)/NF-κB信号通路在溶血磷脂酸(LPA)致动脉粥样硬化中的作用。方法以不同浓度LPA(0¹0μmol/L)刺激人单核细胞株THP-1细胞4h,以及LPA 1μmol/L处理THP-1细胞不同时间(010μmol/L)刺激人单核细胞株THP-1细胞4h,以及LPA 1μmol/L处理THP-1细胞不同时间(0⁸h),荧光定量RT-PCR法测定TLR4mRNA表达,Western blot检测TLR4蛋白、细胞核NF-κB p65表达变化,ELISA法测定细胞因子TNF-α,随后在LPA 1μmol/L条件下,TLR4单抗干预THP-1细胞,观察其对LPA诱导的细胞核NF-κB p65表达及TNF-α分泌水平的影响。结果当LPA 1μmol/L时,TLR4mRNA和蛋白及细胞核NF-κB p65表达较0μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L LPA明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)。LPA 1μmol/L处理THP-1细胞4h时,THP-1细胞TLR4mRNA和蛋白及细胞核NF-κB p65表达水平明显高于0、1、2、8h(P<0.01)。与TLR4单抗干预前比较,TLR4干预后LPA诱导的THP-1细胞NF-κB p65表达及TNF-α分泌水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 LPA可显著上调THP-1细胞TLR4表达及促进NF-κB的活化,LPA致动脉粥样硬化作用可能部分是由TLR4/NF-κB信号途径介导的。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对大鼠胰腺腺泡细胞信号传导途径的影响

目的 了解经雨蛙肽处理的胰腺腺泡细胞AR42J中过氧化物酶体增殖因子活化受体γ(PPARγ)与核因子(NF)-κB活性间的关系.方法 将胰腺腺泡AR42J细胞分为对照组(常规培养)、吡咯列酮组(40 μmol/L吡咯列酮)、吡咯列酮+雨蛙肽组(40 μmol/L吡咯列酮+10~(-8) mol/L雨蛙肽)、雨蛙肽组(40 μmol/L二甲基哑砜+10~(-8)mol/L雨蛙肽)和吡咯列酮+GW9662+雨蛙肽组(40 μmol/L吡咯列酮+5 μmol/L GW9662+10~(-8)mol/L雨蛙肽),各组培养30 min后检测PPARγ和NF-κB活性.Western印迹法检测NF-κB、PPARγ蛋白和磷酸化NF-κB抑制物(IκB)α抗体、IκB激酶(IKK)β和IκBα的表达差异、IKKβ活性和IκBα磷酸化的变化.免疫荧光法和Western印迹法检测NF-κB(p65和p50)的核移位.免疫沉淀法检测IκBα与NF-κB的变化.结果 吡咯列酮不仅抑制IKKβ活性(吡咯列酮+雨蛙肽组:雨蛙肽组为1.6;3.7)及IκBα的磷酸化(吡咯列酮+雨蚌肽组:雨蛙肽组为0.9:1.5),还能加强IκBα与NF-κB的结合(吡咯列酮+雨蛙肽组:雨蛙肽组为0.8:0.3),抑制NF-κB的核移位及NF-κB的转录活性(P<0.01),而PPARγ拮抗剂GW9662则逆转了吡咯列酮对NF-κB活性的抑制作用(P<0.05).结论 在雨蛙肽处理的AR42J细胞中PPARγ通过干扰NF-κB的活化产生抗炎作用.     

阿托伐他汀对晚期糖基化终末产物诱导的人内皮细胞单核细胞趋化蛋白-1mRNA表达影响及其机制的实验研究

目的 观察阿托伐他汀对晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGE)诱导的人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的影响,并探讨其作用机制.方法 实验分组:(1)空白对照组.(2)牛血清白蛋白(BSA)对照组.(3)AGE诱导组:不同作用浓度的AGE(10-4、10-3、10-2及10-1g/L)与细胞共同培养24 h.(4) AGE+阿托伐他汀组:用不同作用浓度的阿托伐他汀(0.1、1、10 μmol/L)分别与细胞培养1 h,而后加入10-1 g/L AGE[根据(3)实验结果选取最佳浓度]与细胞共孵育24 h.(5)PPAR-γ激动剂(15 d-PGJ2)组:15 d-PGJ2( 10 μmol/L)与细胞孵育1 h后加入10-1 g/L AGE再与细胞共孵育24 h.(6)PPAR-γ抑制剂(GW9662)组:GW9662(5000 g/L)与细胞孵育1 h后加入AGE(10-1 g/L)和阿托伐他汀(1 μmol/L)[根据(4)实验结果选取最佳浓度]再与细胞共孵育24 h.胶原酶消化法获取人脐静脉内皮细胞.逆转录聚合酶链反应法分析细胞MCP-1和过氧化物酶增殖物活化受体γ(PPAR-γ)基因的表达.蛋白免疫印迹法测定细胞核因子-κB(NF-κB )p65表达水平.结果 (1)AGE(10-4、10-3、10-2及10-1 g/L)呈浓度依赖性提高人脐静脉内皮细胞MCP-1 mRNA表达水平,分别是空白对照组的1.53倍、2.12倍、2.56倍及4.71倍;AGE浓度为10-4 g/L时,细胞MCP-1 mRNA表达明显高于空白对照组(0.26±0.02比0.17±0.04,P<0.01).(2)与AGE组比,阿托伐他汀(0.1、1、10 μmol/L)呈浓度依赖性抑制AGE诱导的人内皮细胞MCP-1 mRNA的表达;阿托伐他汀浓度为1 μmol/L时,细胞MCP-1 mRNA表达水平显著低于AGE(10-1g/L)组(0.63±0.11比1.03±0.07,P<0.01).(3)AGE(10-1 g/L)组人脐静脉内皮细胞PPAR-γ mRNA的表达水平显著低于空白对照组(0.22±0.08比0.69±0.09,P<0.01),磷酸化和非磷酸化NF-κB p65蛋白表达水平显著高于空白对照组(0.78±0.06比0.31±0.01和1.61±0.16 比0.59±0.14,P均<0.01).(4)阿托伐他汀(1、10 μmol/L)组人脐静脉内皮细胞PPAR-γ mRNA表达水平显著高于AGE(10-1 g/L)组(0.59±0.02和0.61±0.06比0.22±0.08,P均<0.01);阿托伐他汀(1 μmol/L)组磷酸化和非磷酸化NF-κB p65蛋白表达水平显著低于AGE(10-1g/L)组(0.40±0.03比0.78±0.06和0.65±0.12比1.61±0.16,P均<0.01).(5)PPAR-γ激动剂(15 d-PGJ2)组细胞磷酸化和非磷酸化NF-κB p65蛋白表达水平显著低于AGE(10-1g/L)组 (0.21±0.01比0.78±0.06和0.67±0.14比1.61±0.16,P均<0.01),MCP-1 mRNA表达水平显著低于AGE(10-1g/L)组(0.17±0.02比0.93±0.12,P<0.01).(6)PPAR-γ抑制剂(GW9662)组细胞磷酸化和非磷酸化NF-κB p65蛋白表达水平显著高于AGE(10-1g/L)+阿托伐他汀(1 μmol/L)组(0.53±0.02比0.40±0.03和1.38±0.18比0.65±0.12,P均<0.01),MCP-1 mRNA表达水平显著高于AGE(10-1g/L)+阿托伐他汀(1 μmol/L)组(0.62±0.05比0.30±0.07,P<0.01).结论 阿托伐他汀可通过提高AGE诱导的人脐静脉内皮细胞对PPAR-γ表达抑制细胞NF-κB信号途径,进而抑制AGE诱导的人脐静脉内皮细胞的炎性反应.

Abstract：

Objective To investigate the effects of atorvastatin on advanced glycation end products (AGE) induced monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1) expression in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)and whether this effect could be linked to peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ) and nuclear factor-κB(NF-κB).Methods Grouping: (1)Blank control group;(2)BSA group;(3)AGE group:cells were incubated with different concentrations of AGE(10-4,10-3, 10-2 and 10-1g/L)for 24 hours; (4)AGE+Atorvastatin group: cells were incubated with different concentrations of atorvastatin(0.1,1,10 μmol/L)for 1 hour,then incubated with AGE (10-1 g/L) for 24 hours; (5)PPAR-γ agonist(15 d-PGJ2)group: cells were incubated with 15 d-PGJ2(10 μmol/L)for 1 hour,then incubated with AGE (10-1g/L) for 24 hours;(6)PPAR-γ inhibitor(GW9662)group:cells were incubated with GW9662(5000 nmol/L)for 1 hour,then incubated with atorvastatin (1 μmol/L)and AGE (10-1g/L) for 24 hours. Collagenase was used to isolate the endothelial cell from human umbilical vein;RT-PCR was performed to examine the mRNA expression of MCP-1 and PPAR-γ;Western blot was performed to detect NF-κB p65 protein.Results (1) The expression of MCP-1 mRNA was increased in proportion with increasing concentrations of AGEs which could be blocked by atorvastatin in a dose-dependent manner. (2) AGE(10-1g/L)significantly downregulated the expression of PPAR-γ mRNA(0.22±0.08 vs. 0.69±0.09, P<0.01) while upregulated the expression of phospho-NF-κB p65 protein (0.78±0.06 vs. 0.31±0.01,P<0.01) and nonphospho-NF-κB p65 protein (1.61±0.16 vs. 0.59±0.14,P<0.01) comparaed with the control group which could be significantly attenuated by atorvastatin. (3) PPAR-γ agonist decreased the expression of phospho-NF-κB p65 protein (0.21±0.01 vs. 0.78±0.06, P<0.01),nonphospho-NF-κB p65 protein (0.67±0.14 vs. 1.61±0.16,P<0.01)and MCP-1 mRNA (0.17±0.02 vs. 0.93±0.12, P<0.01)compared with AGE(10-1g/L)group. (4) PPAR-γ inhibitor antagonized the effect of atorvastatin on the expression of phospho-NF-κB p65 protein, nonphospho-NF-κB p65 protein and MCP-1 mRNA stimulated by AGE in HUVECs(P<0.01).Conclusion The anti-inflammatory properties of atorvastatin in AGE stimulated HUVECs may partly be attributed to the effect on upregulation of PPAR-γ and downregulation of NF-κB signaling pathway.