DNA疫苗的研究进展

DNA疫苗是将携带抗原编码基因的质粒DNA直接注入动物体内,并在动物细胞中表达抗原蛋白以诱导动物产生免疫保护作用。DNA疫苗由载体质粒DNA内插入一个或多个抗原基因构成,主要通过肌肉注射或基因枪经皮内或皮下给予。接种后,质粒DNA被机体细胞摄取并表达相应抗原蛋白质,该蛋白质被专职抗原递呈细胞（professional antigen-presenting cell,APC）经MHC-Ⅰ类分子或MHC-Ⅱ类分子途径提呈给CD8^＋T细胞或CD4^＋T细胞,从而诱导细胞免疫和体液免疫。目前DNA疫苗在小动物身上已证明可有效应用于感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、过敏性疾病等,而且HIV、HBV、疟疾及某些肿瘤的DNA疫苗已进入临床试验并有一定疗效。尽管人们不乏有质粒DNA会整合入宿主的染色体,或者质粒DNA进入机体不诱导免疫反应而引起免疫耐受甚至产生自身免疫等担忧,但大量的实验研究及理论分析都基本肯定了DNA疫苗使用的安全性。只是DNA疫苗要想成为广泛应用于儿童和成人的一种安全有效的疫苗,还需要进行更谨慎、更系统的研究。     

癌胚抗原DNA疫苗对大肠癌特异性细胞免疫的激活效果

目的检测以质粒pIRES为载体构建的带有全序列癌胚抗原(CEA)基因的核苷酸疫苗对机体特异性抗肿瘤免疫反应的激活效果。方法将CEA基因片段连接于真核表达质粒pIRES中，用肌肉注射方法接种核酸疫苗；检测CEA在小鼠肌肉组织中的表达情况及其对小鼠脾细胞CEA特异性细胞免疫反应的激活效果。结果小鼠经肌肉注射质粒后，免疫组化证实该核酸疫苗可在体内有效表达CEA；分子免疫检测显示注射后小鼠特异性淋巴细胞增值反应明显并且伴有自然杀伤细胞NK活性显著增高。结论实验所构建的核酸疫苗pIRES-CEA可在体外及小鼠体内高效表达并表现出良好的细胞免疫原性。     

CD1D基因与B7-1基因共转染胰腺癌细胞及其抗癌作用的实验研究

目的:观察共转染小鼠B7-1和CD1D 基因对小鼠胰腺癌细胞的免疫应答。方法:将表达B7-1和CD1D 基因的逆转录病毒载体导入包装细胞系,然后转染入胰腺癌细胞。用PCR和Western方法鉴定细胞表达;用B7-1和CD1D 阳性的细胞在体内诱导抗肿瘤免疫反应。结果:B7-1和CD1D 阳性的细胞在同基因小鼠体内能诱导抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤生长。结论:B7-1基因和CD1D 基因共转染肿瘤细胞,能抑制肿瘤生长,可能为肿瘤的基因治疗开辟一条新途径。     

癌胚抗原DNA疫苗对大肠癌特异性细胞免疫的激活效果

目的检测以质粒pIRES为载体构建的带有全序列癌胚抗原(CEA)基因的核苷酸疫苗对机体特异性抗肿瘤免疫反应的激活效果。方法将CEA基因片段连接于真核表达质粒pIRES中,用肌肉注射方法接种核酸疫苗;检测CEA在小鼠肌肉组织中的表达情况及其对小鼠脾细胞CEA特异性细胞免疫反应的激活效果。结果小鼠经肌肉注射质粒后,免疫组化证实该核酸疫苗可在体内有效表达CEA;分子免疫检测显示注射后小鼠特异性淋巴细胞增值反应明显并且伴有自然杀伤细胞NK活性显著增高。结论实验所构建的核酸疫苗pIRESCEA可在体外及小鼠体内高效表达并表现出良好的细胞免疫原性。     

内部核糖体进入位点控制人癌胚抗原与共刺激分子 B7-1的表达

目的构建能在真核细胞内高效表达的CEA/B7-1共表达核酸疫苗,为进一步研究癌胚抗原(CEA)核苷酸疫苗、佐剂及它们的特异性抗肿瘤作用奠定基础。方法通过RT-PCR及基因重组技术获得CEA的真核表达质粒pIRES-CEA,并利用酶切、连接等手段与共刺激分子B7-1基因重组成通过内部核糖体进入位点连接的含有两个表达单元的真核共表达质粒pIRES-CEA/IL-2。结果全自动电化学法定量测定CEA表达量为(23.73±0.26)ng/ml,流式细胞仪测B7-1为44.65%。结论CEA/B7-1共表达载体在真核细胞中能高效表达CEA和B7-1。     

人瘦素蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的构建人瘦素因子（Leptin）的原核表达质粒pGEX-4T-3-LEP，并诱导该基因在原核细胞中大量表达。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和DNA重组技术，从人皮肤成纤维细胞内将编码人Leptin的cDNA序列克隆至原核表达载体pGEX-4T-3上，选取阳性克隆扩增后，提取DNA进行酶切鉴定和测序。同时应用SDS-PAGE和蛋白质印迹方法对其表达产物进行特异性鉴定。结果克隆出的Leptin基因的cDNA由469bp组成，包括翻译起始密码子、编码序列和终止密码子等部分，含有Letinp基因的cDNA的表达质粒pGEX-4T-3在DH5a细菌体内能够表达，并且随着诱导时间的延长，Leptin基因的表达量增加，重组Leptin蛋白主要存在于包涵体中。结论Leptin基因可以在原核细胞中获得表达，为深入研究该蛋白在创伤愈合中的具体作用奠定了基础。     

B7.1和B7.2基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中表达的实验研究

目的 构建含鼠源性B7．1和B7．2真核表达载体体系，研究其在肝癌细胞系CBRH7919中获得高效、稳定表达的方法。方法 将目的基因全长cDNA分别亚克隆到真核表达载体PCI-neo中，获得B7．1和B7．2正向单拷贝插入重组子PCI-neo-B7．1和PCI-neo-B7．2，采用酶切法和测序法鉴定。采用阳离子脂质体将PCI-neo-B7．1／B7．2分别转染CBRH7919，经G418筛选，获得阳性克隆，命名为PCI-neo-B7．1／B7．2-CBRH7919 细胞。逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因在CBRH7919中的表达。结果 PCI-neo-B7．1／B7．2酶切后，电泳显示918bp和942bp的目的基因片段和5．4kbp的线性化PCI-neo载体片段；重组子测序结果与Genebank中B7．1和B7．2序列相符，证实构建成功。RT-PCR检测结果显示B7．1和B7．2均在PCI—neo—B7．1／B7．2—CBRH7919 中获得稳定表达。结论 重组真核表达载体构建正确，并在肝癌细胞系CBRH7919中获得高效、稳定表达，为其在肝癌分子免疫治疗研究中应用奠定基础。     

p53病毒增强型质粒在血管平滑肌细胞中的表达

目的研究腺相关病毒增强型质粒载体介导的P~（53）基因在血管平滑肌细胞中的表达。方法构建带有野生型P~（53）基因的腺相关病毒增强型质粒表达载体，通过阳离子脂质体介导，转染血管平滑肌细胞。PCR检测外源基因整合，RT－PCR分析外源基因mRNA的表达，免疫组织化学检测基因表达产物。结果P~（53）基因转染血管子滑叽细胞表达相应的mRNA和蛋白质。结论血管平滑肌细胞可作为心血管疾病基因治疗的靶细胞．所构建的P~（53）腺相关病毒增强型质粒可作为基因治疗的载体。     

pVAX1-Ag85B的构建及其免疫原性的初步探索

目的构建以Ag85B基因为基础的DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法以pET28a-Ag85B基因组DNA为模板,PCR扩增获得Ag85B全长基因;将PCR产物构建成pUCm-Ag85B亚克隆;经限制性内切酶消化后克隆入pVAX1载体中构建真核表达质粒pVAX1-Ag85B,酶切、DNA测序鉴定。并将构建的DNA疫苗经肌肉免疫荷瘤小鼠,检测血清特异性抗体水平和脾淋巴细胞的增殖活性,并与BCG组、空白质粒组、生理盐水组相比较。结果经NheⅠ和HindⅢ双酶切、DNA测序鉴定后证实,Ag85B基因定向克隆入pVAX1载体,碱基无突变,序列完全正确。免疫荷瘤小鼠后,pVAX1-Ag85B组和BCG组均可提高淋巴细胞增殖活性,但效果不及卡介苗;pVAX1-Ag85B组的抗体滴度为1∶400,BCG免疫组的抗体滴度为1∶800。结论成功地构建了pVAX1-Ag85B质粒,为膀胱肿瘤的基因免疫治疗提供可靠的实验依据。免疫小鼠后,可提高小鼠免疫水平,但效果不及卡介苗。     

重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体的构建及转染兔骨髓基质干细胞的实验研究

[目的]构建人骨形态发生蛋白-7（human bone morphogenetic protein-7，hBMP-7）基因真核表达载体，评价其转染兔骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）的诱导成骨能力。[方法]从人类胎盘组织中克隆出hBMP-7基因，与真核表达载体pcDNA3．1连接，成功构建了重组pcDNA3．1-hBMP-7真核表达载体；从兔骨髓中分离培养BMSCs，分为3组：ApcDNA3，1-hBMP-7转染组；B空载体pcDNA3．1转染组；C未转染组。使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在BMSCs中的表达。检测各组细胞碱性磷酸酶，胶原，骨钙蛋白合成情况。[结果]RT．PCR、免疫组织化学检测显示经hBMP-7转染的BMSCs中有BMP-7表达。经hBMP-7转染BMSCs的碱性磷酸酶于转染后第2d显著增高，到第8d达到最高；经hBMP-7转染的BMSCs合成胶原、骨钙蛋白能力也显著提高，与转染空载体、未转染的BMSCs相比有显著性差异（P〈0.05）。[结论]成功构建了pcDNA3，1-hBMP-7真核表达载体；外源的hBMP-7基因可在兔BMSCs中充分、高效的表达，并且这种外源性hBMP-7基因具备了促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力，这为hBMP-7的基因治疗提供了坚实的理论基础。     

表达鼠精子受精素β的减毒沙门菌疫苗株的构建

目的 构建表达鼠精子抗原受精素β亚单位(Fβ)的可口服减毒沙门菌活疫苗株。方法 通过酶切从克隆载体TOP0中获得FβcDNA片段，将其插入表达载体PYA3149中，构建重组质粒pFFL，将该重组质粒转入鼠沙门伤寒杆菌疫苗株X4632，获得重组菌株X4632(pFFL)，行Western blot分析及初步毒性试验。结果 此无抗药性的重组菌株X4632(pFFL)可稳定表达被Fβ抗体识别的重组Fβ蛋白，口服该菌株无明显毒性作用。结论 该疫苗株的构建为研究以Fβ为靶抗原的精子抗原避孕疫苗打下了基础，值得进一步行诱导免疫观察。     

乙型肝炎病毒DNA疫苗的研究现状

乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)DNA疫苗是指通过克隆HBV抗原基因,并将其插入真核表达载体构建而成的重组DNA分子.通过皮下、肌肉注射或颗粒轰击技术将重组DNA分子导入体内,使目的基因在体内表达,从而诱导机体产生针对此种抗原的体液免疫和细胞免疫.……     

外源质粒DNA对小鼠肝脏基因表达谱的影响

研究了外源质粒DNA经胃肠道吸收可能对肝脏产生的作用机制。给Balb／c小鼠灌胃质粒pcDNA3 200μg，在灌胃后4h分离肝脏，提取肝脏的总RNA。利用寡核苷酸芯片对灌胃质粒pcDNA3后的Balb／c小鼠肝脏进行基因表达谱研究。结果发现17664个基因中，表达上调100条，表达下调41条。按基因功能分类，表达上调的基因可分为免疫应答基因、转录因子基因、信号转导基因、转运相关基因及代谢相关基因等；表达下调的基因主要为脂质代谢基因。灌胃外源质粒DNA后，肝脏组织主要表现为急性时相反应的加强、免疫反应的活化、细胞信号通路的活化以及脂质代谢途径的抑制。表明外源质粒DNA通过胃肠道途径可广泛调控肝脏的基因表达。     

凋亡素基因在人乳腺癌细胞中的表达及诱导凋亡作用

目的 构建pcDvp3重组真核表达质粒，并观察凋亡素基因(vp3)在人乳腺癌细胞一435中的表达及诱导凋亡作用。方法 (1)扩增vp3基因，与pcDNA3．1连接构建pcDvp3重组真核表达载体，并测序；(2)将pcDvp3和pcDNA3．1转染Hela细胞，免疫荧光技术检测凋亡素蛋白表达；(3)将pcDvp3和pcDNA3．1空质粒转染人乳腺癌细胞435和正常细胞，转染48h后用透射电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡。结果 (1)核酸序列分析证明克隆的vp3基因与文献报道一致，且正确插入载体中，表明真核表达载体pcDvp3构建成功；(2)转染pcDvp3的Hela细胞48h后可见明显的荧光，而pcDNA3．1组未见；(3)电镜可见细胞明显形态改变及凋亡小体形成；电泳见典型梯形条带；流式细胞仪检测出现凋亡峰，于转染48h后达最高，凋亡百分率为14．42％；而转染pcDNA3．1细胞未见上述改变。结论 vp3在体内能够表达并有效地诱导人乳腺癌．435细胞凋亡。     

小鼠成纤维活化蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠成纤维活化蛋白(FAP)基因的真核表达载体,并检测其在人胚肾细胞及小鼠体内的表达.方法 根据Gene Bank中mFAP基因(NM_007986)全序列设计聚合酶链反应(PCR)引物,获得其开放式阅读框(ORF).将目的基因片段克隆至真核表达载体pcDNA6/myc-His-B,转化并筛选.将重组质粒注射入小鼠尾静脉,在注射后1、3、5、7 d抽提小鼠腓肠肌组织的总RNA,检测FAP表达.结果 经过酶切鉴定、测序比对,确定所筛选的阳性克隆为pcDNA6-mFAP重组子,其可在真核细胞及小鼠体内正常表达,并产生相应蛋白质产物.在小鼠体内注射后第5天,重组子的基因(0.841±0.040)和蛋白表达量(85.380±4.425)%最高,和空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 成功构建FAP真核表达载体,为研究该基因产物的功能和进行疫苗抗肿瘤实验提供基础.     

人睾丸基因TDRG1重组真核载体的构建及其表达

目的 构建人睾丸基因TDRGl的真核表达质粒,并研究其表达.方法 取人新鲜正常睾丸组织,提取总RNA,采用逆转录.聚合酶联链反应(RT-PCR)扩增TDRG1基因编码序列;将该基因克隆到真核表达载体pYD5中,构建真核细胞表达载体pYD5-TDRG1,用限制性内切酶酶切分析,DNA序列分析鉴定重组质粒;将测序正确的重组质粒pYD5-TDRG1在脂质体介导下转染293细胞,间接免疫荧光法和Western Blot法鉴定目的 蛋白质的表达.结果 RT-PCR扩增出TDRGl基因编码序列,目的 插入片段长约303bp:产物行限制性内切酶酶切后连接到真核表达载体pYD5,重组质粒pYD5-TDRG1经酶切及DNA测序鉴定构建成功:该质粒转染293细胞48h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,阳性细胞率96.42%;行Western blot分析检测到约39-8kD的目的 蛋白表达.结论 成功构建了人类睾丸基因TDRG1的真核表达载体pYD5-TDRG1,TDRG1基因在293细胞内成功表达.     

PEI增强G250 DNA疫苗和重组肽疫苗的prime-boost免疫策略研究

目的 :探讨PEI作为免疫佐剂对G250抗原肽基因PVAX1/C-G250肽-C免疫保护效果的增强作用及联合应用CAIX蛋白疫苗进行PRIME—BOOST免疫程序免疫增强效果。方法:用Eco R I、Xho I和Eco R I、Sal I分别双酶切PVAX1及既往构建的p ET28a(+)/C-G250肽-C质粒。利用DNA重组技术构建重组质粒PVAX1/C-G250肽-C,酶切分析鉴定。大量提取质粒并分光光度计测质粒含量。将32只雌性昆明小鼠随机分为(A)裸DNA组,(B)DNA-PEI复合物组,(C)DNA-PEI+蛋白疫苗组,(D)空白对照组。按0,10,20,30天程序经股四头肌注射免疫。C组在第20天及第30天进行蛋白冲击。初次免疫前和第40天鼠尾取血,ELISA法检测抗体滴度。流式细胞术测淋巴细胞亚群CD4+和CD8+。结果:酶切及基因测序鉴定证实G250抗原肽c DNA正确插入PVAX1/C-G250肽-C真核表达的重组质粒中。昆明小鼠经4次免疫后,3个实验组都产生了特异性的体液和细胞免疫反应,B组的抗体滴度1:1.28×104及CD4+、CD8+达26.12%和12.60%,明显高于A组的1:3.2×103和CD4+,CD8+占到19.32%和10.74%。而蛋白冲击组的1:5.12×104和CD4+,CD8+占到41.96%和15.14%,明显高于B组(P0.05)。结论:成功构建重组质粒PVAX1/C-G250肽-C。该DNA疫苗与PEI和G250蛋白疫苗联合使用后产生极强的免疫原性,诱导产生了高滴度、高特异性抗体及细胞免疫反应。证实G250DNA疫苗联合PEI使用并进行蛋白疫苗冲击的免疫策略可产生强大的免疫保护作用。为恶性肿瘤的术后辅助治疗提供新的思路和方法。     

大鼠葡萄糖转运体3真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建大鼠葡萄糖转运体3（GLUT3）的真核表达载体，为进一步研究葡萄糖转运体3对缺血缺氧脑细胞的保护作用奠定基础。方法以逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）的方法从大鼠脑组织中获取GLUT3全长cDNA片段，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-Glut3，随后用Lipofectamine^TM2000介导转染HEK293细胞，以RT-PCR的方法检测重组质粒在mRNA水平的表达，以免疫组织化学的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。结果克隆的大鼠GLUT3全长cDNA大小约1．5kb且无碱基突变，以构建的重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-Glut3转染293细胞后，在基因及蛋白表达水平均检测到了葡萄糖转运体3的表达。结论成功构建了携带大鼠葡萄糖转运体3的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-Glut3，且证实其可在293细胞中成功表达目的基因。     

p21基因的saRNA表达质粒的构建及功能研究

目的构建可表达具有RNA激活功能的小激活RNA(saRNA)质粒表达载体,并对其激活前列腺癌细胞PC-3中p21WAF1/CIP1(p21)基因表达的功能进行相关研究。方法人工合成与p21基因启动子特定序列相应的DNA片段及同样长度的随机DNA序列,利用DNA重组技术将这些片段构建到真核小分子双链RNA(dsRNA)表达质粒pGenesil-1中,构建成能表达dsRNA片段的表达质粒载体(dsRNAp21-pGenesil-1)和随机对照dsRNA片段的表达质粒载体(dsRNACon-pGenesil-1)。采用脂质体介导方法,分别将dsRNAp21-pGenesil-1(实验组)、dsRNACon-pGenesil-1(随机对照组)及空白质粒pGenesil-1(空白对照组)转染到体外培养的PC-3细胞,通过荧光染色检测转染效率,采用RT-PCR和免疫组化技术检测各组细胞p21蛋白表达的差异。结果成功构建目的表达载体dsRNAp21-pGenesil-1及随机对照载体dsRNACon-pGenesil-1,将各组质粒转染到PC-3细胞后,实验组p21基因表达明显增强,而随机对照组和空白对照组无明显变化。结论本研究构建的dsRNA表达质粒载体能成功表达saRNA分子,并激活p21基因及蛋白的表达,为研究的激活效应提供有效工具。     

WWOX基因真核表达载体的构建及其在SMMC-7721中的表达

目的克隆人WWOX基因及构建WWOX基因真核表达载体并研究其表达。方法取人新鲜正常肝组织，提取总RNA，采用逆转录-聚合酶联链反应（RT—PCR）扩增WWOX基因，将该基因定向克隆到真核表达载体pEGFP—N1中，构建真核细胞表达载体pEGFP—N1-WWOX，用限制性内切酶酶切分析，DNA序列分析鉴定重组质粒；将测序正确的WWOX基因通过脂质体介导下转染肝癌细胞SMMC-7721。结果重组质粒pEGFP—N1-WWOX经HindⅢ和BamHI双酶切后，获得4700bp片断和1234bp插入片断，序列分析表明插入的片段与Gene Bank发布的序列一致；荧光显微镜下可见转染的SMMC-7721细胞有绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了真核表达载体pEGFP—N1-WWOX，WWOX基因在SMMC-7721细胞内成功表达。