DNA疫苗的研究进展

DNA疫苗是将携带抗原编码基因的质粒DNA直接注入动物体内,并在动物细胞中表达抗原蛋白以诱导动物产生免疫保护作用。DNA疫苗由载体质粒DNA内插入一个或多个抗原基因构成,主要通过肌肉注射或基因枪经皮内或皮下给予。接种后,质粒DNA被机体细胞摄取并表达相应抗原蛋白质,该蛋白质被专职抗原递呈细胞（professional antigen-presenting cell,APC）经MHC-Ⅰ类分子或MHC-Ⅱ类分子途径提呈给CD8^＋T细胞或CD4^＋T细胞,从而诱导细胞免疫和体液免疫。目前DNA疫苗在小动物身上已证明可有效应用于感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、过敏性疾病等,而且HIV、HBV、疟疾及某些肿瘤的DNA疫苗已进入临床试验并有一定疗效。尽管人们不乏有质粒DNA会整合入宿主的染色体,或者质粒DNA进入机体不诱导免疫反应而引起免疫耐受甚至产生自身免疫等担忧,但大量的实验研究及理论分析都基本肯定了DNA疫苗使用的安全性。只是DNA疫苗要想成为广泛应用于儿童和成人的一种安全有效的疫苗,还需要进行更谨慎、更系统的研究。     

免疫增强型胰腺癌MUC1-VNTR-C144 DNA疫苗的构建

目的 构建免疫增强型胰腺癌MUC1-VNTR-C144 DNA疫苗.方法 在PeDNA 3.1-VNTR/Myc-his(+)A质粒靶基因之后插入乙型肝炎病毒核心抗原C144基因,构建MUC1-VNTR-C144 DNA疫苗.45只C57BL/6小鼠随机分3组,VC组接种PeDNA 3.1-VNTR-C144/Myc-his(+)A质粒,V组单纯接种PeDNA 3.1-VNTR/Myc-his(+)A质粒,C组单纯接种pcDNA3.1-C144/Myc-his(+)A质粒.4周后加强免疫1次.结果 VC组小鼠脾细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的特异性杀伤率(46.7±8.2)%显著高于V组(34.8±3.1)%和C组(12.9±1.2)%(E/T=80/1,P<0.01).而CTL对未经VNTR合成肽孵育的靶细胞EIA-VNTR杀伤率较低(P<0.01),VU 3C6可抑制CTL对经VNTR合成肽孵育的靶细胞EIA-VNTR+的杀伤活性(P<0.01),表明具有VC组诱生的CTL应答依然保持VNTR特异性.VC组小鼠血清抗VNTR抗体等效浓度(2810.2±308.3)mg/L高于V组(2323.5±238.3)mg/L和C组(2130.9±138.5)mg/L,差异有统计学意义(P<0.01).结论 增强型胰腺癌MUC1-VNTR-C144 DNA疫苗所诱生的VNTR特异的CTL应答和抗体应答显著增强.     

人MUC1重复序列与GM-CSF融合表达的重组卡介苗疫苗对乳腺癌生长的抑制作用

目的 构建一种新的基于人MUC1重复序列与GM-CSF融合表达的重组卡介苗疫苗,并观察其对乳腺癌生长的预防性抑制作用.方法 分步克隆人MUC1重复序列1、4、8串联体基因(MVNTR1/4/8),构建人MUC1重复序列串联体与GM-CSF基因融合的大肠-分枝杆菌表达载体pDE22-MVNTR1/4/8-CSF,酶切鉴定及序列分析后,将构建的穿梭质粒电穿孔转染卡介苗,构建重组卡介苗疫苗rBCG-MVNTR1/4/8-CSF,SDS-PAGE和Western Blot检测MVNTR与GM-CSF融合蛋白的表达.在hu-PBL-SCID鼠模型评价其对乳腺癌生长的抑制作用,并通过免疫组化染色检测其免疫诱导的T细胞反应.结果 SDS-PAGE和Western Blot结果说明:人MUC1重复序列与GM-CSF基因融合的重组卡介苗疫苗分别有MVNTR1/4/8与GM-CSF融合蛋白的表达.rBCG-MVNTR4/8-CSF免疫组在MCF-7乳腺癌细胞接种42 d后,肿瘤成瘤率分别为37.5%和25%,而PBS和BCG-pDE22对照组均为100%(P＜0.05).与对照组相比,rBCG-MVNTR4/8-CSF预防接种显著抑制MCF-7乳腺癌细胞生长(P＜0.01),且生长抑制作用随着VNTR的增加而增强.肿瘤细胞接种70 d后,rBCG-MVNTR4/8-CSF组小鼠生存率分别为75%和87.5%,而BCG-pDE22对照组的生存率为12.5%(P＜0.05).rBCG-MVNTR4/8-CSF免疫组瘤体组织中可见CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润.结论 重组卡介苗疫苗rBCG-MVNTR4/8-CSF预防接种可显著抑制乳腺癌生长.     

脊髓损伤NogoA疫苗安全性和免疫效应初探

目的 制备纯化脊髓损伤NogoA疫苗,疫苗免疫后分析NogoA疫苗的安全性及免疫效应.方法 使用人工合成的NogoA-13肽,结合钥孔帽贝血蓝蛋白(KLH),增强其免疫原性并纯化.鼠龄3周Wistar雌性大鼠60只随机分为3组,A组:NogoA疫苗免疫组;B组:完全弗氏佐剂+不完全弗氏佐剂组;C组:KLH免疫组;对大鼠进行腹腔免疫,使用ELISA检测抗体的滴度和与抗原抗体反应的结合能力.分析疫苗的安全性即大鼠自身免疫性脑脊髓膜炎(EkE)的发生率.结果 A组大鼠血清中检测到抗NogoA-13肽IgG抗体的存在,倍比稀释后血清光密度(A)值呈现出规则的梯度.B、c组血清未检测到IgG抗体的存在.统计学分析发现A组与B、C两组血清不同倍比稀释浓度的A值存在明显的差异,差异具有统计学意义(P＜0.05).B、C组之间及其与未免疫的阴性对照组血清A值的差异无统计学意义.大鼠EAE发生率为0.结论 NogoA-13多肽疫苗免疫大鼠,可刺激出抗NogoA-13多肽抗体,抗体与抗原肽在体外可发生抗原抗体反应,验证了疫苗的有效性.实验动物未见EAE的表现,此多肽疫苗有较好的安全性.     

IL-15表达质粒联合HPV基因疫苗诱导特异性淋巴细胞增殖的实验研究

目的 探讨IL-15真核表达质粒对HPV16 E7基因疫苗所诱导的小鼠特异性淋巴细胞增殖的影响.方法 利用基因重组技术构建含IL-15的真核表达质粒pcDNA3.1-IL-15.将该质粒与HPV16 E7基因疫苗通过肌肉注射方式免疫雌性BALB/c小鼠.基因免疫后,制备脾淋巴细胞悬液,在体外经E7蛋白再刺激后用MTT法检测其T淋巴细胞增殖情况.流式细胞仪检测脾淋巴细胞亚群.结果 pcDNA3.1-IL-15与pcDNA3.1-E7共同注射,可以增强特异性T细胞增殖反应,A570差值为1.313,与对照组比较差异均有显著性(P＜0.05).实验组脾CD4+淋巴细胞数量和CD4+/CD8+比值均高于对照组(P＜0.05).结论 IL-15真核表达质粒可以提高HPV16 E7基因疫苗免疫原性.IL-15基因是一种优良的HPV16 E7基因疫苗的基因佐剂.     

GM-CSF增强胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗免疫效果的研究

目的研究 GM-CSF 作为免疫佐剂对胰腺癌 MUC1-VNTR 核酸疫苗免疫效果的增强作用。方法 45只 C57BL/6小鼠随机分3组,在胫前肌注射100μg/100μl质粒 DNA 生理盐水溶液(VG 组接种 pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A 质粒联用 rmGM-CSF,V 组单纯接种 pcDNA3.1-VNTR/Myc-his(+)A 质粒,G 组单纯接种 rmGM-CSF)进行免疫接种。4周后加强免疫1次,6周后取血清 ELISA 法测抗体,取脾细胞悬液体外以 VNTR 合成肽特异刺激,6d 后进行杀伤试验。结果VG 组小鼠脾细胞 CTL 的特异性杀伤率显著高于 V 组(P<0.01)和 G 组(P<0.01),表明 GM-CSF增强了疫苗所诱发的 CTL 应答。而 CTL 对未经 VNTR 合成肽孵育的靶细胞 EL4-VNTR~-杀伤较低(P<0.01),VU 3C6可抑制 CTL 对经 VNTR 合成肽孵育的靶细胞 EL4-VNTR~+的杀伤活性(P<0.01),表明具有 VG 组诱生的 CTL 应答依然保持 VNTR 特异性。VG 组小鼠血清抗 VNTR 抗体等效浓度(3119.0±110.6)μg/ml 高于Ⅴ组(2323.5±238.3)μg/ml 和 G 组(2023.9±169.0)μg/ml,差别极为显著(P<0.01)。结论 GM-CSF 可增强自行构建的胰腺癌 MUCl-VNTR 核酸疫苗所诱生的 VNTR 特异的 CTL 应答和抗体应答。     

新型胰腺癌MUC1 DNA疫苗的免疫原性研究

目的 研究所构建的新型胰腺癌MUC1 DNA疫苗的免疫原性.方法 采用三种优化策略共构建4个重组质粒,接种免疫C57BL/6J (H 2b)雌性小鼠.每2周加强免疫一次,共免疫3次.每次免疫前及处死小鼠前检测抗体和细胞因子.最后一次免疫结束后2周取脾,体外经VNTR合成肽刺激培养后进行杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀伤功能分析.结果 pIRES2-EGFP3VNTR组、pIRES2-EGFP-3VNTR-CI-144组、pIRES2-EGFP-3VNTR-mIL-18组、pIRES2-EGFP-3VNTR-CI-144-mIL-18组的CTL特异杀伤率显著高于空载体对照组和生理盐水对照组,三重优化构建的质粒pIRES2-EGFP-3VNTR-mIL-18的CTL特异性杀伤率高于双重优化构建和单重优化构建的质粒.各优化构建质粒组的抗MUC1抗体OD值均显著高于对照组(P＜0.05),但组间差异无统计学意义.各优化构建质粒组的外周血IFN-γ均高于对照组(P＜0.05),且以含有IL-18优化策略的两组为高(P＜0.05).结论 所构建的优化重组质粒免疫小鼠后均可诱发抗原特异的CTL应答和抗体应答.C1-144和IL-18可增强疫苗的免疫原性.     

表达小鼠精子受精素β胞外区减毒沙门菌疫苗株的构建

目的 :构建表达鼠精子抗原受精素 β亚单位 (Fβ)胞外区的可口服减毒沙门菌活疫苗株。　方法 :设计一对引物 ,应用PCR方法获得Fβ 胞外区cDNA片断 ,将其插入表达载体pYA3 14 9中 ,构建重组质粒pFEC ,将该重组质粒转入鼠沙门菌疫苗株X4 63 2 ,获得杂合菌株X4 63 2 (pFEC)。该重组菌口服免疫雌鼠 ,通过ELISA方法检测其诱导雌鼠血清IgG抗体和阴道分泌物IgA抗体滴度变化。　结果 :此疫苗株X4 63 2 (pFEC)可稳定表达被Fβ 抗体识别的重组Fβ 胞外区蛋白 ,口服该菌株不但可激发雌鼠产生高水平血清抗重组Fβ 蛋白IgG抗体 ,而且在阴道分泌物中可出现一定程度抗重组Fβ 蛋白IgA抗体 ,无明显毒性作用。　结论 :X4 63 2 (pFEC)疫苗株的构建为研究以Fβ 为靶抗原的精子抗原避孕疫苗打下了基础。     

表达鼠精子Cyritestin蛋白的重组沙门氏菌疫苗株的免疫性避孕效应研究

目的　为观察沙门氏菌疫苗株诱导雌鼠免疫性避孕效应。方法　应用表达鼠精子抗原cyritestin的两种重组沙门氏菌疫苗株X46 32 (pCFL)、X45 5 0 (pCFL)口服免疫雌鼠 ,通过ELISA方法检测其激发雌鼠产生抗重组Cyritestin蛋白和抗菌体LPS(脂多糖 )的血清IgG抗体和阴道分泌物IgA抗体滴度变化。 结果　发现 :两种重组疫苗株不但可激发雌鼠产生高水平血清抗重组Cyritestin蛋白和抗菌体LPSIgG抗体 ,而且在阴道分泌物中可出现相应IgA抗体。同时 ,口服免疫后雌鼠生育能力明显降低 ,两实验组雌鼠妊娠率降低 30 %～ 40 % ,一胎产仔数量平均降低 6 6 .96 %～ 70 .48%。结论　表达精子Cyritestin蛋白的重组沙门氏菌疫苗株可诱导有效的免疫性避孕效应 ,值得深入研究。     

免疫调控相关基因C12orf28在免疫组织中的分布特征

目的：制备抗人C12orf28多克隆抗体,明确C12orf28编码蛋白在免疫组织中的分布特征。方法选取免疫原性高、特异性强的羧基端257个氨基酸作为目的片段,以人外周血单个核细胞（PBMC）cDNA为模板,采用PCR获得目的基因C12orf28C257;构建其原核表达载体pET32a（＋）-C12orf28C257,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）,异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白;将重组蛋白免疫大耳白大白兔制备兔源性多克隆抗体,采用ELISA和Western blot分析检测多克隆抗体效价和特异性,采用Western blot明确C12orf28的组织分布特征。结果 PCR扩增得到C12orf28C257目的基因片段,诱导表达重组蛋白并制备了其多克隆抗体。ELISA分析结果显示,多克隆抗体效价＞1︰1.28×106,Western blot分析鉴定得出多克隆抗体具有较高的特异性。结论未知功能基因C12orf28在胎儿肠、淋巴、胸腺和心肌等组织中均有不同程度的表达。     

肾癌肿瘤相关抗原G250及G250蛋白多糖(PG)区基因的克隆、表达及鉴定

目的 探讨肾癌肿瘤相关抗原G250及G250蛋白多糖(PG)区基因的克隆,蛋白表达及鉴定.方法 从肾癌细胞786-0中提取mRNA,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出G250及G250 PC,区cDNA.将获得的cDNA片段插入pET28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-28a(+).G250/pET-28a(+)-G250 PG,转化DH5α大肠杆菌.通过PCR鉴定筛选出正确的重组子,并用其转化BL21 Codon Plus菌.采用IPTG诱导工程菌进行诱导表达,SDS-PAGE及Westernblot鉴定.结果 克隆的基因经测序证实,G250/G250 PG区序列正确.构建重组质粒pET-28a(+).G250/pET-28a(+)-G250 PG,并在原核系统中表达G250/G250 PC重组蛋白,目的 蛋白均具有较好的抗原性和特异性.结论 成功完成G250/G250 Pc区基因克隆及表达,为在G250/G250PG蛋白纯化基础上进行抗体制备和G250功能研究提供了实验依据.     

VEGF15基因表达载体的构建和鉴定

目的：构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-VEGF165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的特异表达,为重组VEGF165进一步的生物学活性和临床研究奠定基础.方法：采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,在脂质体介导下将重组质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3,以抗生素培养基筛选抗性细胞,并对抗性细胞进行单克隆化,采用双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blotting等方法对目的蛋白在细胞中的特异表达进行分析鉴定.结果：完成真核表达载体pcDNA3.1（＋）-VEGF165的构建,并成功转染NIH/3T3细胞,筛选到一批G418抗性的阳性细胞,单克隆化的阳性细胞（吸光度值0.345±0.064）与空载体转染（吸光度值0.114±0.012）的对照比较,有显著的VEGF165表达（P〈0.01）,SDS-PAGE和Western Blotting检测到VEGF165在扩大培养的克隆细胞中的特异表达.结论：应用pcDNA3.1（＋）-VEGF165载体转染的NIH/3T3细胞可高效表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白.     

基于细胞穿透肽Tat的Cre-Loxp重组酶系统的改造

目的：构建基于Tat细胞穿透肽和核定位信号NLS的重组酶Cre蛋白表达载体,引导Cre内化并人核实现细胞水平的基因敲除。方法：在带His标记的细胞穿透肽Tat和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达载体pET14b—SBP-Tat—EGFP基础上,利用酶切连接的方法将NLS—Cre片段插入带上述表达载体中,构建新的融合蛋白表达载体pET14b—SBP-Tat—NLS-cre-EGFP;经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化BL21（DE3）宿主菌,经异丙基硫代一争I）I半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,用Ni^2＋亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入到培养的cdc42基因两端带Loxp位点的C57小鼠腹腔巨噬细胞中,在Zeiss荧光显微镜下观察蛋白转导效率,并用Westernblot方法在蛋白水平检测并验证细胞水平目的基因敲除效果。结果：经酶切、基因测序证实重组载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;Zeiss荧光显微镜下观察融合蛋白穿透细胞膜并进入细胞,细胞在经融合蛋白内化处理后目的基因蛋白的表达量与对照组没加Tat融合蛋白比较有明显降低。结论：利用Tat细胞穿透肽成功构建了基于细胞穿透肽的带有NLS-Cre的Tat蛋白表达运输载体,建立了可携带Cre进入细胞核进行基因敲除的系统,说明利用该系统可以实现细胞水平的基因敲除。     

金雀异黄素对晚期蛋白氧化产物刺激大鼠系膜细胞转化生长因子β1分泌的影响

目的观察金雀异黄素（Gen）对晚期蛋白氧化产物（AOPPs）刺激下SD大鼠肾小球系膜细胞（MC）分泌转化生长因子β1（TGF-β1）的影响，从而了解作为大豆蛋白质主要成分的Gen对糖尿病肾脏病（DKD）系膜细胞的影响，进而探讨大豆蛋白饮食对DKD的治疗意义。方法以体外培养的SD大鼠MC为研究对象，分为正常培养的对照组（C组）、培养液中加入AOPPs的A组和加入10、50、100、200umol／LGen的G（10）、G（50）、G（100））、G（200）组以及培养液中同时加入AOPPs和Gen的A＋G（10）、A＋G（50）、A＋G（100）、A＋G（200）组。酶链免疫吸附（ELLSA）法检测各组细胞培养液中TGF-β1的浓度。结果培养后第12h、24h、48h，A组细胞培养液TGF-β1含量较C组升高（P〈0．05或P〈0．01）；G（10）、G（50）组与C组无差异（P〉0．05），G（100）、G（200）组较C组升高（P〈0．05或P〈0．01）；A＋G（50）、A＋G（100）、A＋G（200）组较A组和G组降低（P〈0．05或P〈0．01）。A＋G（50）、A＋G（100）、A＋G（200）组培养后第24h较培养后第12h升高；而培养后第48h较培养后第24h升高（P〈0．05或P〈0．01）。结论Gen能减少AOPP刺激下系膜细胞TGF-β1的分泌，提示大豆蛋白饮食可能对DKD患者有益。     

载脂蛋白B基因Xba I和EcoR I位点稀有等位基因与胆石症的关系

目的探讨载脂蛋白B基因XbaI、EcoRI位点稀有等位基因与内蒙古中西部地区汉族和蒙古族胆石症人群的相关性。方法收集2010年4—10月包头医学院第一附属医院100例胆石症患者（结石组）及同期行健康体检的115例正常人（对照组）的临床资料,采用病例对照研究方法和聚合酶链反应一限制性片断长度多态性（PCR—RFLP）技术,检测和分析内蒙古中西部地区的汉族和蒙古族结石组和对照组血样的载脂蛋白B基因XbaI、EcoRI多态性,包括XbaI位点的x±x±、x±X-、X—X一基因型及等位基因x-、x±（稀有等位基因）;EcoRI位点的E±E±、E±E-、E—E一基因型及等位基因E±、E-（稀有等位基因）。检测各组的血脂水平,包括TG、TC、HDL和LDL。计数资料行疋。检验,计量资料行t检验。结果汉族人群与蒙古族人群均无X±x±基因型,且蒙古族人群中亦未发现稀有等位基因X±和E-的存在。在汉族人群中,结石组LDL为（2．8±0．9）mmol／L,显著高于对照组的（1．9±0．8）mmol／L（t=2．800,P〈0．05）;蒙古族人群中,结石组HDL、LDL分别为（1．74-0．3）mmol／L、（3．5±0．8）mmol／L,显著高于对照组的（1．2±0．3）mmol／L、（2．8±0．9）mmol／L（t：7．596,2．549,P〈0．05）。蒙古族人群中,结石组TG、TC、HDL、LDL分别为（3．1±1．6）mmol／L、（5．6±1．0）mmol／L、（1．7±0．3）mmol／L、（3．5±0．8）mmol／L,均显著高于汉族结石组的（1．2±0．6）mmol／L、（4．4±1．2）mmol／L、（1．3±0．3）mmol／L、（2．8±0．9）mmol／L（t=5．501,3．667,4．448,3．430,P〈0．05）。蒙古族对照组TG、TC、LDL分别为（2．6±1．7）mmol／L、（5．1±1．1）mmol／L、（2．8±0．9）mmol／L,均显著高于汉族对照组的（1．3±0．7）mmol／L、（3．9±0．9）mmol／L、（1．9±0．8）mmol／L（t=4．298,4．772,3．888,P〈0．05）,而HDL则在汉族对照组中较高（t=1．997,P〈0．05）。汉族结石组x±x-、x-x-基因型LDL水平分别为（2．7±0．1）mmol／L和（2．6±1．0）mmol／L,E±E±、E±E-／E—E-分别为（2．6±1．0）mmol／L和（2．5±0．4）mmol／L,组内比较,差异无统计学意义（t=0．225,0．124。P〉0．05）。结论在内蒙古中西部地区,蒙古族人群可能比汉族人群容易患胆石症,但载脂蛋白B基因XbaI和EeoRI位点稀有等位基因x±和E一与血脂水平增高未见关联,可能与胆石症发生无关。     

阻断PD-1／PD—L1信号通路对负载HBsAg的树突细胞抗HBV免疫功能的影响

目的探讨阻断PD—1／PD—L1信号通路后,负载HBsAg的树突细胞（dendritic cells,DC）诱导HBV转基因小鼠免疫应答的作用特点。方法体外诱导扩增BALB／c小鼠骨髓来源的DC,尾静脉免疫HBV转基因小鼠（其中在DC免疫前1d腹腔注射PD—L1抗体,共3次）。实验分5组进行：DC／HBsAg＋PD—L1抗体组、DC／HBsAg组、DC组、mIgG组和磷酸盐缓冲液（PBS）组,分别以流式细胞术、乳酸脱氢酶（LDH）释放法、酶联免疫吸附试验（ELISA）和荧光定量聚合酶链反应（PCR）等检测HBV转基因小鼠脾脏淋巴细胞增殖及细胞内干扰素γ（IFNγ）、特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性及血清HBsAg、HBV DNA和丙氨酸转氨酶（ALT）水平。采用SPSS13．0统计软件进行分析,组间比较采用ANOVA方差分析和q检验。结果免疫后第3天和第6天,DC／HBsAg＋PD—L1抗体组与其他各组比较在诱导CD3^＋CD8^＋T淋巴细胞增殖及IFNγ分泌方面差异有统计学意义（细胞增殖：F值分别为25．22和39．01,P值均〈0．01;IFNγ分泌：F值分别为32．35和36．98,P值均〈0．01）;而DC／HBsAg组与DC组淋巴细胞增殖能力比较仅在第3天有统计学意义（t=6．79,P=0．012）。特异性CTL的活性在DC／HBsAg＋PD—L1抗体组明显升高。各组血清HBsAg在第6天差异有统计学意义（F=6．12,P〈0．05）。DC／HBsAg＋PD—L1抗体组血清ALT水平与DC／HBsAg组比较在第3天无差异,与其他各组比较在第3和第6天差异有统计学意义（F值分别为19．22和14．30,P值均〈0．05）。各组对HBV DNA的清除能力没有差别,但DC／HBsAg＋PD—L1抗体组有1只小鼠病毒载量下降1个数量级。结论封闭PD-1／PD—L1信号通路能通过提高特异性CD^3＋CD8^＋T淋巴细胞增殖及其分泌IFNγ能力,进而促进负载HBsAg的DC诱导转基因小鼠抗HBV免疫能力。     

不同肾小球滤过率估算公式在老年人肾功能评估中适用性的比较

目的比较不同肾小球滤过率估算公式在老年人肾功能状况评估中的适用性及其与内生肌酐清除率（Ccr）的相关性。方法选择720例老年内科患者,应用Cockcroft-Gault（C-G）公式、肾脏病膳食改良试验（MDRD）7（M7）公式、MDRD（Ma）公式及我国改良MDRD（Me）公式计算估计肾小球滤过率（eGFR）。分析C-G公式与其他公式计算的eGFR值与年龄和Ccr值的相关性。结果Ccr值和C-G公式计算的eGFR值均随年龄增长明显下降,与年龄呈显著负相关;其他公式计算的eGFR值与年龄均无相关性。本组患者的总体Ccr值为（50．32±23．64）ml·min-1·（1．73m2）-1;C-G公式计算的eGFR值为（45．45±18．46）ml·min-1·（1．73m2）-1,与Ccr值最为接近;其他公式的测定值均显著高于Cer值。在总体和CKD3～4期患者,C-G公式计算的eGFR值与Ccr值的相关性均高于其他公式。结论C-G公式计算的eGFR值与年龄和Ccr值的相关性最好,C-G公式可代替Ccr评估老年人的肾功能状况。     

儿童乙型肝炎病毒携带者分子流行病学特征

目的 探索江苏省和浙江省部分地区儿童乙型肝炎病毒（HBV）携带者的病毒分子流行病学特征.方法 采用酶免疫法（EIA）和Abbott公司微粒子酶免疫（MEIA）法筛选乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性儿童;采崩荧光定量PCR法检测HBV DNA载量;采用巢式-聚合酶链反应扩增乙型肝炎病毒表面抗原基因（HBV S基因）,采用DNASTAR软件进行序列分析,用VMD1.8.6软件展示HBV表面蛋白的立体结构,用SPSS 12.0软件进行数据处理.结果 共筛选出64例HBsAg阳性患儿,扩增后获得41株HBV S基因全序列.64例HBsAg阳性患儿的血清HBV DNA平均载量为（4.15±0.79）×10~7拷贝/mL.41株HBV S基因全序列中,C基因型34株（82.93%）,B基因型5株（12.19%）,B＋C型2株（4.88%）;血清型主要为adr型（34/39,87.18%）、adw型（4/39,10.24%）和ayr型（1/39,2.56%）,2株未分型.HBV表面抗原＂a＂决定簇常见的变异位点是第129位点的Q→F（谷氨酰胺→苯丙氨酸）、第145位点的G→R（甘氨酸→精氨酸）、第131位点的S→N（丝氨酸→天冬酰胺）和第144位点的C→A（半胱氨酸→丙氨酸）,变异频率分别为12.20%（5/41）、4.88%（2/41）、2.27%（1/41）和2.27%（1/41）,总变异频率为21.95%（9/41）.常见变异株第129位点＂Q→F＂和第145位点＂G→R＂S蛋白的＂a＂抗原决定簇空间结构与野生株完全不同.结论 江苏省和浙江省部分地区儿童HBV携带者体内的HBV呈高复制状态.感染以C/adr型的野生株为主,目前的乙型肝炎疫苗仍然有效.     

邻苯二甲酸二(2-乙己基)酯致小鼠睾丸基因组DNA甲基化水平变化分析

目的:探讨增塑剂邻苯二甲酸二(2-乙己基)酯(DEHP)作用于怀孕小鼠后,其仔代睾丸基因组DNA甲基化水平的改变情况。方法:妊娠KM小鼠随机分为3组:正常对照组、玉米油对照组和DEHP实验组。自妊娠12.5 d到生后第3天分别持续经口予以玉米油和DEHP[500 mg/(kg.d)],于生后第7天取仔代睾丸,应用甲基敏感扩增多态性(MSAP)技术,对仔鼠睾丸组织DNA进行EcoRⅠ/MspⅠ和EcoRⅠ/HpaⅡ两种酶切反应,经ABI 3730DNA自动测序仪电泳及检测后,运用Genescan3.1分析扩增谱带。结果:对CCGG位点,DEHP实验组小鼠仔代睾丸组织DNA甲基化程度明显增高,其甲基化水平为(34.03±3.05)%;而正常对照组和玉米油对照组小鼠仔代睾丸组织基因组DNA甲基化程度分别为(28.37±2.37)%和(28.58±2.45)%。DEHP实验组与正常对照组和玉米油对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:DEHP作用孕鼠后可导致仔代睾丸基因组DNA甲基化水平改变,影响基因组表观遗传修饰改变,可能是导致生殖系统损害的重要毒理机制之一。