乙肝肝移植受体术后骨髓CD34+细胞和PBMCs内乙肝病毒DNA的同步检测

目的 肝移植术后乙肝复发严重影响预后,HBV感染的病毒来源值得研究.采用PCR技术可检测到术后病人外周血单个核细胞(PBMCs)中HBV DNA的存在,然而PBMCs的寿命有限,其中的病毒来源仍不清楚.该研究对此问题做了初步的探索.方法 采集13例乙肝肝移植术后受体外周血和骨髓标本,运用Ficoll密度梯度离心法结合免疫磁性分离法(MACS)分别从外周血和骨髓标本中分离出PBMCs和骨髓来源CD34+细胞即造血干祖细胞,利用实时荧光定量PCR法检测细胞中的HBV DNA,同时检测血清HBV标志物和血清HBV DNA.结果 13例病人术前血清HBV DNA阳性8例,阴性5例.术后平均37个月的随访期内(16～77个月)血清中HBV DNA,HBsAg和HBeAg检测结果全为阴性;13例PBMCs中均检测到HBV DNA的存在,阳性率为100%.PBMCs中DNA含量对数平均值为3.40±0.85;13例骨髓来源CD34+细胞中都检测到HBV DNA的存在.阳性率也是100%.CD34+细胞中DNA含量对数平均值为3.30±0.58.病人PBMCs和CD34'细胞内DNA含量对数值均数差异无统计学意义(P>0.05).同一病人PBMCs与CD34+细胞HBV DNA同时为阳性.术前血清HBV DNA检测阳性和阴性病人的PBMC内DNA含量对数值均数差异无统计学意义(P＞0.05);术前血清HBV DNA检测阳性和阴性病人的CD34+细胞内DNA含量对数值均数差异也无统计学意义(P＞0.05).结论 现有预防措施下,乙肝肝移植受体虽然外周血清中不能检测到HBV DNA和HBV抗原成分的存在,但术后骨髓CD34+细胞和PBMCs中皆长期存在HBV DNA.含有HBV DNA的骨髓来源CD34+细胞可能是含有HBV DNA的PBMCs的来源,也可能是肝移植术后PMBCs内HBV DNA长期存在的原因,及以后导致HBV复发的潜在危险因素.然而,现在尚无有效方法可以完全清除这些残存病毒,术后长期的抗病毒药物预防措施是必要的.     

慢病毒载体在基因治疗中的应用进展

慢病毒载体(1entiviral vector,LV)具有可感染非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的 基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点,成为目前基因治疗中应用较为广泛的病毒载体.本文以人类免疫缺陷病毒I型(HIV-Ⅰ)为代表,综述对慢病毒载体的改进及其在基因治疗中的应用进展.     

肝门部胆管癌组织中丙肝病毒RNA的研究

目的 检测肝胆管癌组织中丙肝病毒(HCV)RNA感染，以进一步探讨肝胆管癌发生与HCV RNA的关系。方法 应用HCV RNA丙肝病毒基尺组5′末端非编码区高度保守的“专一性引物”，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)和探针杂交方法,探测6例肝门部胆管瘸石蜡包埋组织中的HCV RNA。结果 6例肝胆管癌患者癌组织中5例样本在预定的142bp位置上检测到有HCV RNA 5′NT序列片段的存在，其感染阳性率为83％(5/6)。结论 除肝细胞癌外，肝胆管癌细胞中亦有HCV RNA存在，而且有很高的感染率。     

外周血单个核细胞中HBV DNA与HBV cccDNA对慢性乙型肝炎患者免疫功能的影响

目的 比较外周血单个核细胞(PBMCs)有或无HBV感染证据组中免疫功能的差异.方法 常规分离78例CHB患者和10例健康对照组全血中的PBMCs,提取DNA,应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测PBMCs中的HBV DNA和HBV cccDNA;进行PBMCs的培养,孵育72 h后,收集PBMCs上清液,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-10(IL-10),并用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测PBMCs的增殖活性.结果 PBMCs中HBV cccDNA阳性的患者组,其PBMCs产生IFNγ水平显著下降,IL-10水平显著升高,同时伴PBMCs的增殖能力显著下降.结论 HBV感染PBMCs可能是HBV感染后机体Th1/Th2细胞因子比例失衡,特异性免疫功能低下,形成慢性HBV感染的主要原因之一.     

慢病毒介导NEP1-40及NT-3双基因转染神经干细胞的实验研究

目的通过慢病毒载体将NEP1-40(Nogo extracellular peptide residues 1-40)及神经营养因子_3(neurotrophin 3,NT-3)双基因转染入神经干细胞(neural stem cells,NSC_s)内进行表达,探讨NEP1-40及NT-3双基因转染NSC_s的可行性,为NSC_s体内实验奠定基础。方法将SD大鼠胚胎室管膜区NSC_s采用空载慢病毒载体(A组)、NEP1-40慢病毒载体(B组)、NT-3慢病毒载体(C组)及NEP1-40和NT-3慢病毒载体(D组)进行转染,以未转染病毒的细胞作为对照组(E组)。用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为5、10、15的慢病毒载体分别转染24、48、72 h,荧光显微镜观察转染后细胞内荧光表达情况,确定慢病毒载体的最佳MOI和收样时间。再分别通过实时荧光定量PCR及Western blot,检测转染后细胞中NEP1-40及NT-3基因的表达,以及细胞和培养基中NEP1-40及NT-3蛋白的表达。结果荧光显微镜观察示,MOI为10时NEP1-40和NT-3基因慢病毒载体在NSC_s内转染率最高,最佳时间为转染48 h时。实时荧光定量PCR及Western blot检测示,B、D组NEP1-40 m RNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、C组,差异有统计学意义(P0.05);A、C组间及B、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)。C、D组NT-3 m RNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、B组,差异有统计学意义(P0.05);A、B组间和C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论通过慢病毒载体可将NEP1-40及NT-3双基因成功转染入NSC_s内,在NSC_s内稳定表达,且两种目的基因在表达过程中无相互拮抗或促进作用。     

乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染对肾移植受者存活的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)和(或)丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染对肾移植受者长期存活的影响及预防措施。方法 HBV和(或)HCV感染肾移植受者110例(感染组),其中HBV感染受者56例、HCV感染受者52例,HBV与HCV合并感染2例。非HBV与非HCV感染受者694例(非感染组)。感染组受者术前有病毒复制者予积极治疗,研究早期肝功能正常者可接受肾移植,后期均用聚合酶链反应(PCR)检测,要求连续3～6个月HBV脱氧核糖核酸(DNA)0copy/ml,HCV核糖核酸(RNA)0copy/ml方可接受肾移植。术后定期检测HBV与HCV,定期检测感染组受者HBVDNA滴度、HCVRNA滴度。发现HBV复制,选用拉米夫定、阿德福韦酯治疗,酌情减少免疫抑制剂用量。分别比较两组术后1、3、5年人、肾存活率,比较两组的肝功能衰竭病死率。结果非感染组人、肾存活率分别为:1年94.2%、91.4%,3年为86.4%、85.2%,5年为82.7%、78.9%;感染组人、肾存活率分别为:1年90.2%、88.1%,3年为88.9%、86.2%,5年为81.5%、76.3%;两组数据比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。感染组中14例(12.7%)死于肝功能衰竭,其中10例为HBV感染者,非感染组受者无1例死于肝衰竭。感染组术后肝衰竭病死率明显高于非感染组(12.7%、0,P<0.05)。结论受者术前HBV和(或)HCV感染会明显增加肾移植术后肝衰竭死亡危险。患者术前处于病毒复制期应予积极治疗,在肝炎病毒停止复制6个月后再考虑肾移植。长期随访中应定期复查HBV与HCV感染指标,早确诊、早治疗,并及时调整免疫抑制剂剂量。     

RNA激活研究进展

近年的研究发现非编码RNA(ncRNA)分子能在多个水平参与基因表达的调控机制,其中小分子双链RNA(dsRNA)对相关蛋白表达的特异性抑制作用已经进行了广泛而深入的研究,如小干扰RNA(siRNA)能够诱导与其分子核糖核苷酸排列序列相一致的mRNA降解,或可使相应基因启动子区域DNA的同源序列段CpG岛发生甲基化[1,2],并导致相应的基因失去转录活性,造成特定基因沉默.细胞内源性的microRNA(miRNA)也可在基因转录和翻译水平抑制基因的表达[3-5],体现出ncRNA分子在基因表达调控中的多样性.     

微小RNA技术与病毒性肝炎研究

病毒性肝炎严重危害人民的健康,尤其乙型和丙型病毒性肝炎,相当比例感染者可发生慢性化,严重可发展为肝硬化、肝癌.免疫损伤是慢性乙型和丙型病毒性肝炎的主要发病机制,但具体机制尚不十分清楚,至今尚未完全阐明.由于微小RNA(microRNA)是普遍存在的转录后调节微小RNA,又由于慢性乙型和丙型肝炎病毒感染后在细胞内长期存在,这就为机体和病毒本身产生microRNAs提供有力条件,这样宿主与病毒microRNAs,病毒与宿主microRNAs之间必然会存在相互的联系,推测对病毒性肝炎的慢性化,肝癌的发生等都会起到一定的作用.     

慢病毒介导的膜孔相互作用分子1基因敲减对SMMC7721细胞凋亡的影响

目的 观察膜孔相互作用分子1(Stim1)基因表达下调对肝细胞癌(HCC)细胞凋亡的作用.方法 设计和合成Stim1基因干扰序列,构建慢病毒介导的RNA干扰载体,利用第3代慢病毒包装系统进行病毒制备;干扰慢病毒以2倍感染复数( MOI)感染SMMC7721细胞,定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹法(WB)检测Stim1基因表达;采用碘化丙锭(PI)和膜联蛋白V( Annexin V)双染法检测SMMC7721细胞的凋亡变化. 结果 测序结果表明干扰序列连入干扰载体;定量PCR和West-em blot法检测结果显示干扰慢病毒感染可以抑制Stim1基因75％以上的表达;流式细胞仪检测结果表明在Stim1基因被敲减后,凋亡细胞的比例从8％上升到26％.结论Stim1基因的敲减促进SMMC7721细胞的凋亡.     

蓝舌病毒HbC_3对人肾癌细胞的感染杀伤作用

目的 观察蓝舌病毒湖北株(BTV-HbC_3)对人肾癌ACHN细胞的感染特性,探讨其杀伤肾癌细胞作用及其机制.方法 BTV-HbC_3感染肾癌ACHN细胞,观察细胞病变效应及显微电镜变化,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率,RNA凝胶电泳检测BTV-HbC_3在ACHN细胞内的增殖,DNA ladder法检测感染后凋亡并用流式细胞仪检测感染后细胞凋亡指数.结果 BTV-HbC_3感染细胞后有明显的细胞病变效应,细胞胞质内出现病毒颗粒,细胞肿胀破裂,1 MOI的BTV-HbC_3感染ACHN细胞24、36、48 h的存活率分别为68.14±5.13、57.14±2.68、42.21±5.63.RNA电泳出现L1-L3、M4-M6和S7-S10特征性病毒dsRNA,DNA ladder显示非特异凋亡表现,流式细胞仪检测1 MOI的BTV-HbC_3感染ACHN细胞24、36、48 h后可见低亚二倍体峰,比例分别为13.7%、18.5%和24.2%.结论 BTV-HbC_3能有效地杀伤人肾癌ACHN细胞.     

Peripheral blood manipulation significantly affects the result of dendritic cell monitoring

It has been postulated that the plasmacytoid/myeloid dendritic cell ratio (pDC/mDC) reflects immune reactivity, and can therefore be used to monitor transplant recipients. We investigated the influence of Ficoll-Paque separation and PBMC cryopreservation on the pDC/mDC ratio and the expression of maturation markers, e.g. chemokine receptors (CKRs) CCR7, CXCR4, and CCR5, in comparison to fresh blood cells. Fractions of pDCs and mDCs, and CKR expression were measured by flow cytometry in fresh blood, in Ficoll-isolated PBMCs and in cryopreserved PBMCs from healthy individuals and kidney transplant recipients. Ficoll-isolation of PBMCs resulted in higher pDC/mDC ratios in both groups compared to fresh blood cells resulting from a relatively large increase in pDCs compared to mDCs. The pDC/mDC ratio increased further after cryopreservation of PBMCs from kidney transplant recipients. Ficoll-isolation and cryopreservation of PBMCs affected the proportion of mDCs and pDCs positive for CKRs, and their expression levels resulting in a more mature phenotype. In conclusion, the pDC/mDC ratio and pDC or mDC maturation status based on CKR expression, is dependent on manipulation of PBMCs. Therefore, fresh blood is preferable for monitoring purposes in transplant patients, as only these cells reflect the in vivo immune-status of patients accurately.     

人羊水间充质干细胞对乙型肝炎肝衰竭患者外周血Th1／Th2的体外调节

目的探讨人羊水间充质干细胞（human amniotie fluid—derived mesenchymal stem cells,h-AFMsc）对乙型肝炎肝衰竭患者外周血Th1／Th2的体外调节作用。方法选择2011年2—5月中山大学附属第三医院6例乙型肝炎肝衰竭患者和6名健康志愿者,提取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuelear cells,PBMC）,同时从孕妇中期羊水中提取h-AFMSC。将h-AFMSC分别与乙型肝炎肝衰竭患者和健康捐献者的PBMC共培养72h,乙型肝炎肝衰竭患者和健康捐献者的PBMC单独培养组作为对照。应用流式细胞仪检测共培养前后不同组PBMCIFNγ（Th1）和IL-4（Th2）的变化情况,计算Th1／Th2比值。对共培养前后数据进行Mauchly球形检验,P〉0．1满足球形假设检验则采用重复测量方差分析。结果共培养72h,乙型肝炎肝衰竭患者PBMC与h—AFMSC共培养组的Th1细胞比例与其PBMC单独培养组比较无明显差异（F=0．82,P〉0．05）,但Th2细胞比例明显下降（F=10．24,P〈0．05）,从而导致Th1／Th2比值显著上升（F=17．28,P〈0．01）。健康捐献者PBMC与h-AFMSC共培养组的Th1、Th2和Th1／Th2比值与其PBMC单独培养组比较差异均不明显（F值分别为0．54、0．68和0．74,P值均〉0．05）。结论h-AFMSC对乙型肝炎肝衰竭患者的Th1／Th2有体外调节作用,具有作为移植种子来源移植治疗乙型肝炎肝衰竭的可能性。     

强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞的生物学及免疫学特性

目的:探讨强直性脊柱炎(AS)患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)的生物学及免疫学特性,为进一步阐明AS的发病机制和寻找新的治疗靶点提供理论依据。方法 :选取37例活动期AS患者(AS组),男34例,女3例,平均年龄(24.3±5.4)岁,HLA-B27均为阳性;49例健康志愿者作为对照组(HD组),男43例,女6例,平均年龄(25.7±4.9)岁;其中HLA-B27阴性44例(HD1组),HLA-B27阳性5例(HD2组)。从每例受检者髂后上棘穿刺采集骨髓组织,分离BMSCs,培养扩增至第3代,以1×104/ml的浓度接种于96孔板中,100μl/孔,从第1天开始每日取3孔进行细胞计数,共计12d,绘制生长曲线;每日取3孔经MTT处理后测定吸光度值,绘制细胞活力曲线,观察BMSCs的生物学特性。使用流式细胞仪检测各受检者BMSCs的细胞表面表型。将第3代BMSCs细胞接种于U形底96孔板,培养4h后使用60Co照射30Gy;取健康志愿者外周血采用密度梯度法分离单个核细胞(PBMCs),加入细胞培养液,计数后按BMSCs∶PBMCs 1∶20、1∶10、1∶5、1∶2、1∶1的比例接种于已接种BMSCs的96孔板,共培养5d,观察双向混合淋巴细胞反应情况;同样获取PBMCs,计数后同样以5个比例接种于96孔板,加入植物血凝素(PHA)4μg/ml,充分接触后共培养5d,观察淋巴细胞增殖反应情况。对组间进行统计学比较。结果:AS组、HD1和HD2组第3代BMSCs体外培养1~12d时的增殖能力、细胞活力无显著性差异(P>0.05);三组细胞表面表型均为高水平表达CD105、CD73和CD90,不表达CD45、CD34、CD14和HLA-DR。HD1组和HD2组BMSCs与不同比例PBMCs共培养的双向混合淋巴细胞反应和PHA刺激的淋巴细胞增殖反应均无显著性差异(P>0.05);AS组与HD组比较有显著性差异(P<0.05)。结论:AS患者BMSCs的生物学特性无明显改变,但其免疫调节功能明显下降,其可能在AS的发病机制中扮演重要角色。     

高效抗反转录病毒疗法对HIV-1特异性CTL免疫应答的影响

目的 研究高效抗反转录病毒疗法（highly active antiretroviral therapy,HAART）对人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫应答的影响.方法 采用酶联免疫斑点技术（ELISPOT）,以HIV-1 P24编码区的氨基酸序列人工合成的12个重叠肽段组成的肽段库作为特异性抗原表位,对38例接受HAART和31例未接受HAART的HIV-1感染者的外周血单核细胞（PBMC）的干扰素γ（IFNγ）分泌细胞频率进行测定研究.应用χ2检验及秩和Mann-Whitney U检验分析治疗组和未治疗组之间HIV-1抗原特异性CTL细胞免疫应答的差异.结果 治疗组的HIV-1抗原特异性CTL阳性应答率为65.8%（24/38）,未治疗组为32.3%（10/31）,治疗组显著高于未治疗组（χ2=6.522,P＜0.05）.在全血CD4＋T淋巴细胞计数高于350个/μL的HIV-1感染者中,治疗组HIV-1抗原特异性CTL应答频率显著高于未治疗组（Z=-2.819,P＜0.05）.此外,治疗组中HAART时间超过12个月者,其HIV-1抗原特异性CTL应答频率明显高于HAART时间未超过12个月者（Z=-2.195,P＜0.05）.结论 HAART尤其是长疗程治疗可以增强HIV-1抗原特异性CTL应答.     

Interleukin-18 restores immune suppression in patients with nonseptic surgery, but not with sepsis

BACKGROUND: We investigated cellular immune responses, in particular interferon gamma (IFN-gamma) production, by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in patients with septic and nonseptic surgical stress, focusing on interleukin (IL)-18 and its receptor (IL-18R). METHODS: Thirty-two patients with alimentary tract carcinoma who underwent elective surgery (OP) and 26 septic patients (SP) with peritonitis were enrolled in this study. Blood was collected on the first postoperative day (POD1), POD5, POD10, and POD15 in the OP group and on the emergency admission in the SP group. Ten healthy volunteers served as controls. PBMCs were cultured in the presence of anti-CD3 antibody or IL-2 and IL-12, with or without additional IL-18 stimulation, to measure IFN-gamma production. IL-18R expression on CD56+ NK (natural killer) cells was evaluated by flow cytometry. RESULTS: IL-2- and IL-12-induced IFN-gamma production by PBMCs was suppressed significantly in both the OP (POD5) and SP groups compared with that in healthy controls. Interestingly, additional IL-18 stimulation up-regulated IFN-gamma production by PBMCs in the OP group as well as the control group, but not in the SP group. IL-18R expression on CD56+ NK cells was maintained consistently in the OP group as well as the control group, but decreased in the SP group. CONCLUSIONS: IFN-gamma production induced by cytokines (IL-2 and IL-12) was suppressed in PBMCs from both patients with sepsis and those who had undergone elective surgery. However, IL-18R expression on CD56+ NK cells was different between patients with sepsis and nonseptic surgical stress. Our results suggest that exogenous IL-18 administration may be effective in preventing immune suppression in patients with nonseptic elective surgery.     

Ets-1反义寡核苷酸抑制裸鼠胃癌生长的实验研究

目的 研究Ets-1反义寡核苷酸对裸鼠胃癌生长的影响及其机制。方法 建立裸鼠胃癌皮下种植模型,分别应用Ets-1反义、正义寡核苷酸与PBS行瘤内注射,观察种植瘤生长的变化;应用逆转录聚合酶链式反应检测瘤组织Ets-1 mRNA的变化,并应用免役组织化学检测瘤组织微血管密度的差异。结果 经Ets-1反义寡核苷酸治疗后,反义Ets-1组较正义组及PBS组裸鼠胃癌生长明显受到抑制[(0.60±0.11)g vs(1.18±0.11)g vs(1.28±0.13)g,P<0.01];瘤组织Ets-1 mR-NA表达降低,微血管密度显著低于正义组与PBS组[(10.4±3.1)vs(24.5±8.4)vs(20.6±7.5),P<0.01]。结论 Ets-1反义寡核苷酸能够抑制裸鼠胃癌的生长,其机制可能与减少微血管形成有关。