小干扰RNA抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞间隙连接蛋白connexin43的表达

目的:利用小干扰RNA(siRNA)抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞间隙连接蛋白connexin43(Cx43)的表达和检测细胞间间隙连接通讯功能,探讨该技术在阴茎海绵体平滑肌细胞间隙连接和阴茎勃起功能研究中的应用。方法:利用Ambion公司设计软件,构建靶向人Cx43基因的siRNA重组质粒,转染人阴茎海绵体平滑肌细胞48h后,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹检测Cx43基因和蛋白的相对表达水平、划痕标记荧光染料传输技术检测细胞间间隙通讯功能,并分别与siRNA阴性对照、空白对照组比较。结果:酶切和测序证实siRNA真核表达载体构建成功。siRNA重组质粒转染细胞后的Cx43 mRNA和蛋白相对表达水平分别为(0.45±0.08)%、(0.56±0.06)%,与siRNA阴性对照组(0.72±0.04)%、(0.80±0.08)%和空白对照组(0.74±0.09)%、(0.77±0.11)%相比,差异均有显著性(P(0.05);转染后的细胞间间隙连接通讯功能也显著降低。结论:siRNA能有效抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞Cx43的表达和阻断间隙连接介导的间隙连接通讯功能。     

靶向Pik3cb shRNA表达载体的构建及其对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的构建大鼠Pik3cb shRNA真核表达载体，并检测其下调大鼠血管平滑肌细胞Pik3cb mRNA表达的效应。方法根据Genbank中大鼠Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-1，酶切鉴定和测序无误后分别命名为pU6-Pik3cb—shRNA．1和pU6-Pik3cb—shRNA-2。通过脂质体转染大鼠胸主动脉平滑肌细胞，确定转染效率；通过荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测Pik3cb mRNA的表达；TUNEL法检测细胞凋亡。结果pU6-Pik3cb—shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2经测序和PCR扩增与原序列相同，转染大鼠平滑肌细胞48h时转染率为15．7％，荧光定量PCR结果显示转染组Pik3cb mRNA表达明显减少，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05），错配质粒组与对照组比较Pil（3cb mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05）。TUNEL结果显示转染组凋亡细胞明显增加，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论成功构建重组真核表达质粒pU6-Pik3cb—shRNA，并有效下调大鼠胸主动脉平滑肌细胞Pik3cb mRNA的表达，为靶向Pik3cb防治移植血管再狭窄的基因治疗奠定了基础。     

短发夹RNA对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞磷酸二酯酶5型基因表达的抑制作用

目的 观察短发夹RNA(shRNA)对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞磷酸二酯酶5型(PDE5)基因表达的抑制作用,探讨运用RNA干扰(RNAi)技术治疗勃起功能障碍(ED)的可行性.方法 构建靶向大鼠PDE5基因的shRNA重组腺病毒rAd-rPDE5-shRNA,将其转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞48 h后,通过荧光标签进行显微计数确定转染效率,并以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测PDE5基因的表达水平.结果 rAd-rPDE5-shRNA构建成功,转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞效率达95%以上,并使PDE5基因表达在mRNA水平抑制(80.78±2.30)%,在蛋白水平抑制(67.39±3.33)%.结论 以腺病毒为载体表达的shRNA能稳定、有效地抑制大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5基因的表达.     

反义人端粒酶RNA组分基因对胃癌细胞端粒酶活性的影响

目的 克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分（hTR）基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,研究反义端粒酶RNA对人胃癌细胞株MKN-45端粒酶活性的影响。方法 采用RT-PCH方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列,将该片段分别正向和反向插入PEF6/V5-His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分（hTR）基因正、反义真核表达载体,随后采用脂质体转染法将该正、反义载体转染入人胃癌细胞株MKN-45,用TRAP法观察后者端粒酶活性的改变。结果 所克隆的基因片段其碱基序列与文献报导完全一致,且插入载体的方向完全正确。与正常对照、转染正义载体、空载体者比较,转染反义载体者端粒酶活性显著下降。结论 本实验已成功克隆了人端粒酶RNA组分（hTR）基因的部分序列并成功构建hTR正反义真核表达载体,而且反义端粒酶RNA能有效降低人胃癌细胞株MKN-45端粒酶活性。     

腺病毒介导的激活大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞中NO／cGMP通路的实验研究

目的：探讨靶向大鼠iNOS基因的shRNA重组腺病毒载体对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞iN0s基因的激活作用,为阴茎勃起功能障碍（ED）的基因治疗提供实验依据。方法：将前期构建的重组腺病毒AdS—iN—OSrshRNA-EGFP（AdU6／shiNOS）和对照病毒AdU6／shControl,分别转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,分别在不同病毒MOI（25,50,75）值下72小时后采样检测。采用realtimeRT-PCR半定量检测AdU6／shiNOS对细胞iNOS基因mRNA表达影响;Western—blot法检测海绵体平滑肌细胞iNOS蛋白表达变化。然后培养基中加L—Arg（10mmol／L）,用酶联免疫法检测病毒转染72小时后海绵体平滑肌细胞内cGMP的浓度变化,记录AdU6／shiNOS对平滑肌细胞内cGMP的影响。结果：AdU6／shiNOS转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞72小时后,和空白对照组、阴性对照组相比iN0s基因在mRNA和蛋白表达水平均显著上调（P〈O．05）,呈剂量依赖性,MOI一75时RNAa效果最好。而且转染72小时后,实验组原代平滑肌细胞内cGMP水平显著高于对照组及空白组（Pd0．05）。结论：利用腺病毒介导的RNAa技术,提高海绵体平滑肌细胞iN0s基因表达获得成功,可以增加阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP水平,激活了NO／cGMP通路,这为勃起功能障碍的基因治疗研究开辟了新的方向。     

人胰岛素样生长因子1基因在海绵体平滑肌细胞中的表达及定位

目的观察人胰岛素样生长因子1基因在海绵体平滑肌细胞中的表达及定位情况,为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验依据。方法采用Lipofectamine2000包裹PCDB-hIGF-1质粒和PCDB空载体,转染原代培养的大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,转染后24h分别采用RT-PCR法检测hIGF-1基因mRNA表达,Westernblot法检测hIGF-1蛋白表达,荧光免疫细胞化学法检测hIGF-1细胞定位及蛋白表达。结果RT-PCR检测到hIGF-1mRNA表达,Westernblot和荧光免疫细胞化学法均检测到hIGF-1蛋白表达,荧光免疫细胞化学法可见hIGF-1蛋白定位于阴茎海绵体细胞胞质中。结论PCDB-hIGF-1成功转染入大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞可表达hIGF-1基因,蛋白定位于胞质。     

人arresten基因的真核表达及其对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 真核表达人arresten蛋白,并观察其对血管平滑肌细胞体外增殖的影响.方法 用脂质体介导,将含有人arresten基因的重组质粒pSecTag2-AT转染COS-7细胞;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞目的 基因mRNA表达;收集浓缩转染48 h细胞上清液,Western blot检测目的 蛋白的表达.离体培养大鼠血管平滑肌细胞,用CCK-8法检测转染细胞上清液对平滑肌细胞体外增殖的影响.结果 重组质粒pSecTag2-AT转染的COS-7细胞有目的 基因mRNA的表达;转染细胞上清液中有arresten蛋白的表达.细胞体外增殖分析显示转染细胞上清液可显著抑制血管平滑肌细胞的体外增殖(F=40.154,P＜0.01).结论 真核表达的人arresten蛋白能有效抑制血管平滑肌细胞的体外增殖,为日后开展抑制血管新生内膜增生的基因治疗奠定了基础.     

反义人端粒酶RNA亚基对胆囊癌端粒酶活性及细胞生长的抑制作用

目的探讨反义RNA技术对胆囊癌细胞端粒酶活性的影响及对胆囊癌细胞生长增殖的作用。方法根据测定的胆囊癌人端粒酶RNA亚基(hTR)基因的序列结果，并根据真核表达载体多克隆酶切位点的物理图谱，体外合成反义RNA及正义RNA的基因序列，并构建入pTriEx-4真核表达载体，酶切鉴定正确后，采用脂质转染法导入胆囊癌细胞。TRAP法检测端粒酶活性。流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况，电镜观察细胞微观形态变化。结果实验组胆囊癌细胞的端粒酶活性较对照组明显减低，正义组、转染空载体及单纯脂质体转染的细胞端粒酶活性与未转染细胞比较则变化不明显。反义RNA基因作用后，G0／G1期细胞比例明显增高，S期细胞比例明显降低。细胞的分裂、增殖受到明显抑制。反义RNA基因转化后，10d凋亡率为11．10％。13d后凋亡率为29．02％。电镜下可见明显凋亡细胞。结论反义RNA技术对胆囊癌细胞端粒酶活性有明显的抑制作用；并抑制胆囊癌细胞的生长，促进细胞的凋亡；且克服了反义寡核苷酸作用时间短的缺点。     

电穿孔法转染人端粒酶逆转录酶至许旺细胞的研究

目的 利用电穿孔技术,将人端粒酶催化亚基(hTERT)转染至SD大鼠许旺细胞,观察及检测外源性hTERT在许旺细胞内表达及对许旺细胞寿命及增殖能力的影响.方法 从食管癌组织中提取hTERT RNA,构建pcDNA3.1-hTERT质粒,利用电穿孔技术,转染许旺细胞,PCR检测hTERTRNA,TRAP-PCR银染法端粒酶活性检测试剂盒检测端粒酶活性,PI-annexin V染色,流式细胞仪测第15代转染及未转染ADSCs细胞凋亡.并且绘制15代转染及未转染细胞传代次数及传代时问曲线.结果 成功构建pcDNA3.1-hTERT质粒.转染后,许旺细胞内hTERT RNA表达,并且TRAP端粒酶活性检测结果为阳性,许旺细胞标志物S100阳性,转染后细胞传代能力较未转染细胞显著增强.结论 成功构建hTERT-许旺细胞.为构建许旺细胞永生化细胞系打下基础.     

反义人端粒酶RNA组分基因对胃癌细胞端粒酶活性的影响

目的 克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分（hTR）基因片段并构建其正交和反义真核表达载体，研究反义端粒酶RNA对人胃癌细胞株MKN－45端粒酶活性的影响。方法 采用RT－PCR方法从人胃癌细胞株MKN－45中扩增出人hTR部分cDNA序列，将该片段分别正向的反向插入PEF6V5－His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分（hTR）基因正，反义真核表达载体，随后采用脂质体转染法将该正，反义载体转染入人胃癌细胞株MKN－45，用TRAP法观察后端粒酶活性的改变。结果 所克隆的基因片段其碱基序列与献报导完全一致，且插入载体的方向完全正确。与正常对照，转染正义载体，空载体比较，转染反义载体端粒酶活性显下降。结论 本实验已成功克隆和人端粒酶RNA组分（hTR）基因的部分序列并成功构建hTR正反义真核表达载体，而且反义端粒酶RNA能有效降低人胃癌细胞株MKN－45端粒酶活性。     

深圳市某两所小学流行性腮腺炎突发疫情的流行病学分析

目的：通过对深圳市某两所小学发生的流行性腮腺炎突发疫情的流行病学特点及差异性进行分析,为制定科学、高效的防控策略提供科学依据。方法2013年5～7月深圳市大鹏新区某两所小学爆发流行性腮腺炎,以学校为整体研究对象,分别标记为学校A（24个班,学生1210例）和学校B（27个班,学生1274例）,对比两所小学的疫情流行病学差异性。结果分析发现,学校A流行性腮腺炎发病率为4.30%,发病班级所占比54.17%,均较学校B1.73%和29.63%高,对比差异有统计学意义（P＜0.05）;分析显示学校A学生出现疫病平均年龄为（11.2±1.1）岁,较学校B（9.34±1.0）岁,对比差异明显（P＜0.05）;且两组疫病患儿在接种疫苗率对比上差异无统计学意义（P＞0.05）;但疫情发生时,学校B疫苗紧急接种率明显高于学校A,对比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论小学作为流行性腮腺炎爆发的主要场所之一,疫病爆发高峰季节前,针对易感染人群给予相应的疫苗接种等预防控制措施,同时加强流行性腮腺炎的监测,对于降低感染人群数量,减轻、遏制疫情有着积极的意义,值得相关防控部门重视。     

复合小剂量阿曲库铵对顺苯磺酸阿曲库铵起效时间的影响

目的观察顺苯磺酸阿曲库铵同时复合阿曲库铵用于全凭静脉诱导的起效时间。方法择期全麻手术患者80例,随机均分为A、B、C、D四组。A组单用3ED95(0.15 mg/kg)顺苯磺酸阿曲库铵作为对照组;另三组分别用3ED95顺苯磺酸阿曲库铵复合阿曲库铵0.05 mg/kg(B组)、0.10 mg/kg(C组)或0.15 mg/kg(D组)。采用TOF-Watch SX肌松监测。静注咪唑安定0.05mg/kg、芬太尼5μg/kg、依托咪酯0.3 mg/kg及相应剂量肌松药,记录起效时间,进行气管插管条件评级。结果B、C、D组肌松起效时间依次加快,均明显短于A组(P<0.01),但B、C、D组之间差异无统计学意义。结论复合小剂量阿曲库铵能缩短3ED95顺苯磺酸阿曲库铵的起效时间。     

主动脉窦瘤破裂外科治疗的临床研究

目的　探讨主动脉窦瘤破裂局部病理改变及其合并主动脉瓣关闭不全的手术方法。方法　 3 6例主动脉窦瘤破裂 (RASV)合并主动脉瓣关闭不全 (AI) 15例、室间隔缺损 (VSD) 2 6例。补片修补 3 5例 ,其中合并VSD的均以一片法修补 ,合并AI的主动脉瓣置换 (AVR) 6例 ,主动脉瓣成形 4例。手术取材作病理检查 5例。结果　本组 3 6例中手术死亡 2例 ( 5 .6% )。存活的 3 4例病人均经门诊复查或通信随访 0 .3～ 18年 ,其中 2例死亡。病理检查见RASV合并VSD的瘤壁为纤维素样坏死或玻璃样变性。结论　主动脉窦壁纤维素样或玻璃样变性可能是其形成的病理基础。合并主动脉瓣关闭不全时应探查其病变程度 ,酌情一期矫正 ,瓣膜损伤明显时宜行主动脉瓣置换 ,对主动脉瓣环细小的病例 ,可借修补VSD和RASV的补片扩大主动脉瓣环。     

胰头癌63例临床病理分析

目的:探讨接受外科治疗的胰头癌患者的临床病理特点。方法:回顾性将根治性切除与姑息性切除手术病例进行对照,对其年龄、性别、症状、体征、围手术期情况、肿瘤标记物检查、临床病理、手术并发症、手术切除率、生存率及其影响因素进行分析。结果:63例中,52例(91.2%)获得随访,根治组中位生存时间(13.8个月)明显高于姑息组(6.2个月)(P0.05),姑息组(6.2个月)与非手术组(5.4个月)无明显差异(P0.05);根治组患者导管腺癌发生率与姑息组比较有显著差异(P0.05);T1期患者切除率高于T4期(P0.01),CA19-9数值与胰头癌可切除率无明显相关(P0.05)。结论:手术是提高胰头癌患者生存率的重要手段,具有不同临床分期的胰头癌病人手术切除率及术后生存期具有显著差异。CA19-9可作为胰头癌常规的筛查方法,但与疾病进展程度无关。     

胰十二指肠切除术治疗胰头及壶腹部癌（附97例临床分析）

为提高胰头及壶腹部癌的疗效，总结９７例胰十二指肠切除术（ＰＤ）治疗胰头及壶腹部癌的诊治经验。癌肿切除率为３４．４％，手术并发症发生率为３８．４％，手术死亡率为１１．３％，术后１、３和５年生存率分别为６８．８％、４３．１％和３０．０％。认为要提高本病早期诊断率，必须对可疑高危病人提高警惕，首选Ｂ超检查，Ｂ超和ＥＲＣＰ两项联合检查可提高本病早期诊断。     

Pathogenesis of carcinoma of the papilla of Vater

Most adenomas and carcinomas of the small intestine and extrahepatic bile ducts arise in the region of the papilla of Vater. In familial adenomatous polyposis (FAP) it is the main location for carcinomas after proctocolectomy. In many cases symptoms due to stenosis lead to diagnosis at an early tumor stage. In about 80%, curative intended resection is possible. Operability is the most relevant prognostic factor. Most ampullary carcinomas resp. carcinomas of the papilla of Vater develop from adenomatous or flat dysplastic precursor lesions. They can be sited in the ampulloduodenal part of the papilla of Vater, which is lined by intestinal mucosa. They also can develop in deeper parts of the ampulla, which are lined by pancreaticobiliary duct mucosa. Intestinal-type adenocarcinoma and pancreaticobiliary-type adenocarcinoma represent the main histological types of ampullary carcinoma. Furthermore, there exist unusual types and undifferentiated carcinomas. Many carcinomas of intestinal type express the immunohistochemical marker profile of intestinal mucosa (keratin 7–, keratin 20+, MUC2+). Carcinomas of pancreaticobiliary type usually show the immunohistochemical profile of pancreaticobiliary duct mucosa (keratin 7+, keratin 20–, MUC2–). Even poorly differentiated carcinomas, as well as unusual histological types, may conserve the marker profile of the mucosa they developed from. These findings underline the concept of histogenetically different carcinomas of the papilla of Vater which develop either from intestinal- or from pancreaticobiliary-type mucosa of the papilla of Vater. Molecular alterations in ampullary carcinomas are similar to those of colorectal as well as pancreatic carcinomas, although they appear at different frequencies. In future studies, molecular alterations in ampullary carcinomas should be correlated closely with the different histologic tumor types. Consequently, the histologic classification should reflect the histogenesis of ampullary tumors from the two different types of papillary mucosa.     

不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效分析

目的：探讨不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效。方法：2008年3月-2013年2月收治指尖离断患者80例,38例吻合指侧方静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1或1：2或2：2,平均1：2;22例吻合指腹静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1;20例未吻合静脉,术中仅吻合1条动脉,行侧切口或甲床放血。观察各组治疗效果。结果：吻合指侧方静脉组手指全部成活,无一例发生回流障碍;吻合指腹静脉组19例发生静脉危象,其中4例手指坏死;未吻合静脉组20例均发生回流障碍,其中6例手指坏死。58例获随访,随访时间6~28个月。吻合指侧方静脉组32例,指尖外形佳、指腹饱满;吻合指腹静脉组14例,指体轻度萎缩,指甲生长不平整;未吻合静脉组12例,指体萎缩明显。吻合指侧方静脉组指甲生长近平整,长度长于其他两组[（14.4±3.2）mm比（12.5±2.3）mm和（12.2±2.2）mm],远侧指间关节活动度大于其他两组[（63±5）°比（48±3）°和（45±7）°],两点分辨觉小于其他两组[（4.6±0.4）mm比（7.1±1.2）mm和（7.3±0.6）mm],感觉级别高于其他两组[S（3.45±0.39）级比S（2.57±0.42）级和S（2.55±0.49）级],差异均具有显著性（P〈0.05）。吻合指腹静脉组和未吻合静脉组在指甲长度、运动和感觉方面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：吻合指侧方静脉能有效解决指尖再植静脉回流问题,可避免回流障碍,成活率高,促进指甲生长,可恢复 DIPJ 活动度及感觉。     

192-Saporin对SD大鼠股骨发育的作用研究

目的研究胆碱能神经系统对骨发育的影响。方法用192-Saporin抑制SD乳鼠胆碱能神经系统的发育和功能,每2d腹腔注射1次,持续2周,股骨进行大体测量和生物力学检测,坐骨神经行Loyez髓鞘染色。结果药物处理对乳鼠生理状态和运动能力无明显影响,处理前后处理组与对照组体重比较无显著性差异(P>0.05);处理组股骨中段冠状面皮质直径小于对照组(P<0.01),直径/全长比值无显著性差异(P>0.05);处理组股骨最大抗折应力小于对照组(P<0.05),刚性比较则无显著性差异(P>0.05);处理组坐骨神经轴突排列较紊乱,密度较对照组低(P<0.01)。结论处理组股骨发育较慢但发育比例正常,以及矿化程度未受影响,提示胆碱能神经系统可能在成骨细胞的增殖过程中起重要作用。     

Frequency of complications of manipulation of the spine

Summary A survey of all members of the Swiss Medical Association of Manual Medicine was undertaken for the year 1989. Informative data were given by 425 respondents on the frequency of complications of manipulation as related to the spine. The number of thoraco-lumbar manipulations during 1989 (225 working days) was 805 for each respondent, and the number manipulations of the cervical spine 354. Thus, the total number of thoraco-lumbar manipulations was 342 125, and the total number of cervical manipulations was 150 450. The overall incidence of side-effects of transient complications due to cervical spine manipulation such as disturbance of consciousness or radicular signs was 1: 16716. Seventeen patients (ratio 1: 20 125) after manipulation of the lumbar spine presented, in addition to increased pain, a transient sensorimotor deficit with precise radicular distribution. Nine of the 17 patients (ratio 1: 38013) developed a progressive radicular syndrome with sensorimotor defict and radiologically verified disc herniation and had to be referred for surgery. Side effects and complications of cervical and lumbar spine manipulation are rare. Taking in to account the yearly number of manipulations performed by a single physician in Switzerland and the rate of complications, it can be calculated that a physician practicing manual medicine will encoutner one complication due to manipulation of the cervical spine in 47 years and one complication due to lumbar spine manipulation in 38 years of practice. However, it is important that a careful clinical assessment is carried out to avoid complications due to manipulation carried out on the basis of inappropriate indications. Furthermore, the decision as to which technique is indicated for any particular functional disorder of the spine should be made on the basis of rational criteria resting on a knowledge of clinical biomechanics, functional anatomy and neurophysiology. The authors recommend a prospective morbidity study to be carried out among physicians, chiropractors, osteopaths and physiotherapists, taking into account the different indications and therapeutic techniques in relation to complications.