MHCC97中肝癌干细胞的分离及其特性

目的 分离肝癌细胞系MHCC97中肝癌干细胞并观察其干细胞特性.方法 利用流式分选法从MHCC97中分离出边缘群(SP)和主群(MP).分别采用软琼脂克隆形成和裸鼠成瘤实验观察SP和MP细胞体内、外成瘤能力;羟基喜树碱(HCPT)体外诱导,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析其分化潜能.结果 SP细胞克隆形成率为57%,MP细胞仅为13%;1×103SP细胞可成瘤(2/8),MP细胞则需1×105才能成瘤(2/8).诱导3 d后,约15%SP细胞出现双核;诱导后SP细胞甲胎蛋白和r-谷氨酰转肽酶的表达降低,白蛋白表达增强,葡萄糖磷酸酶仅诱导后表达.结论 MHCC97中SP亚群富集具有干细胞特性的癌细胞,即肝癌干细胞.     

人肝癌细胞系MHCC97H中侧群细胞初探

目的 从人肝癌细胞系MHCC97H中分选侧群细胞,探索其形态、表型和功能特征.方法 利用流式细胞仪从MHCC97H中分选得到侧群细胞,用相差显微镜和透射电镜观察其形态学特点;Western blotting观察其ABCG2表达;用流式细胞仪评估侧群细胞与干细胞基因CD133、CD117的关系;用克隆形成实验和NOD/SCID接种实验分别观察侧群细胞体外增殖和体内成瘤情况.结果 侧群细胞体积较小,呈圆形或短梭形;侧群细胞的细胞器如线粒体、内质网等明显少于非侧群细胞;流式检测显示侧群细胞中含有CD133、CD117阳性细胞;Western blotting显示侧群细胞和非侧群细胞中均有ABCG2表达,两者无明显差异;平板克隆形成实验显示SP具有较强的克隆形成能力;体内移植实验显示2000个SP细胞即能在体内形成肿瘤.结论 肝癌细胞系MHCC97H中侧群细胞具有肿瘤干细胞样细胞的表型和特性;ABCG2可能不是决定肝癌侧群细胞表型的主要因素.     

肠癌SW-620肿瘤细胞SP亚群研究

目的 观察肠癌细胞株SW-620中肿瘤干细胞相关的SP(side population)亚群比例,分选出相关的SP和NSP细胞,并鉴别相关的SP是否具有干细胞某些生物学特性.方法 制备SW-620细胞悬液,经Hoechst33342和PI染色(其中对照组同时加入拮抗剂维拉帕米),流式细胞仪分析SP亚群.通过流式细胞仪分选出肠癌细胞株SW-620中SP细胞.克隆形成实验和噻唑蓝(MTT)实验检测SP和NSP细胞增殖能力的差异.裸鼠体内成瘤对比实验验证SP细胞和NSP细胞致瘤性.结果 SP亚群占SW-620细胞的1.0%左右,维拉帕米阻断后减少为0.01%左右.流式细胞仪分选出SP细胞7.5×105个,大部分为NSP细胞.克隆形成实验和MTT证实SP细胞和NSP细胞增殖能力有差异.裸鼠体内成瘤实验发现:1×105个SP细胞可以致裸鼠成瘤,1×105个NSP细胞及以下数量级别细胞不能致裸鼠成瘤.结论 人肠癌细胞株SW-620中存在SP亚群细胞,维拉帕米可抑制染料外排而明显减少SP细胞的比例.可以通过流式细胞仪分选出SP细胞,通过克隆形成实验和MTT实验检测SP和NSP细胞增殖能力有差异.裸鼠成瘤对比实验证实SP比NSP细胞更具致瘤性.     

不同转移潜能人肝癌单克隆细胞株的分离和建立

目的 从高转移潜能的人肝癌细胞系中分离出不同转移潜能的单克隆细胞株。方法 采用有限稀释法,对高转移潜能人肝细胞癌细胞系MHCC97进行单克隆培养,筛选不同转移潜能的克隆细胞株,测定目标克隆株的生长速度、核型、AFP分泌情况,体外侵袭能力、裸鼠接种肺转移率。结果 筛选出高、低两个不同转移潜能的单克隆细胞株,分别命名为MHCC97-H和MHCC97-L,前者肺转移率为100%,后者为40%;MHCC97-H的细胞倍增时间为34.2h,MHCC97-L为60.0h;流式细胞分析显示,MHCC97-H与MHCC97-L相比,前者G0-G1期细胞比例低,S期、G2-M期细胞比例高;人工基底膜穿透能力前者明显强于后者。结论 本实验证实了MHCC97癌细胞系的异质性。这两个单克隆细胞株对于肝癌生物学行为的比较研究有一定的使用价值。     

缺氧增加肝癌细胞胚胎干细胞基因表达促进恶性转化

目的 研究缺氧对原发性肝癌恶性表型的影响及相关机制.方法 建立体内、外缺氧模型,比较缺氧对MHCC97H肝癌细胞成瘤和侵袭转移能力的影响,并通过检测细胞增殖周期,CD90、CD133标记的肝癌干细胞数量以及胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)样基因Oct4,Nanog,Sox2等的表达分析缺氧对肝癌细胞生物学特性的影响.结果 缺氧促进MHCC97H肝癌细胞运动(t=2.792,P=0.023)、侵袭(t=7.624,P＜0.0001)、转移(x~2=5.507,P=0.031)潜能,并增加软琼脂集落形成(t=3.292,P=0.011)和裸鼠皮下成瘤率(x~2=8.571,P=0.015).在缺氧环境中,MHCC97H肝癌细胞增殖能力受到抑制,G1期细胞比例显著增加,Oct4,Nanog,Sox2等基因表达明显上调.结论 缺氧促进MHCC97H肝癌细胞成瘤和转移等恶件表型与获得胚胎干细胞样特征有关.     

利用Rhodamine 123染色初步分离及纯化肠上皮干细胞

目的 探讨肠上皮干细胞初步的分离、纯化方法. 方法 利用Rhodamine 123对小鼠肠上皮细胞进行染色,流式细胞仪分选Rhodaminel23(Rho)染色阴性(Rholow)和强阳性细胞群(Rhobn);RT-PCR检测Rholow和Rhobn细胞musashi-1和p-糖蛋白1(p-g-p1)mRNA的表达;流式细胞术分析细胞周期和musashi-1蛋白表达情况. 结果 肠上皮细胞Rhodamine123染色可明显分为3个细胞群,分别是Rho阴性、Rho弱阳性和Rho强阳性细胞,分别约占总细胞的12.34%、45.26%和41.40%;成功分选出Rholow和Rhobri细胞群;前者musashi-1和p-g-p1mRNA表达阳性,后者p-g-p1mRNA少量表达;Rholow细胞群大部分细胞处于G0/G1期,约10.37%细胞musashi-1蛋白表达阳性. 结论 利用Rhodamine 123染色特点可实现肠上皮干细胞的初步分离、纯化.     

抗黏附多肽对人肝癌高转移细胞系MHCC97侵袭转移的抑制作用

目的　研究抗黏附多肽GRGDS、YIGSR对人肝癌高转移细胞系MHCC97侵袭转移的抑制作用。方法　选择GRGDS、YIGSR作为抗黏附多肽 ,选具有高转移潜能的人肝癌细胞系MHCC97为靶细胞。用体外细胞 基质黏附实验检测两种多肽对MHCC97细胞对所包被的纤维连接蛋白 (FN)的黏附抑制作用 ;用体外细胞侵袭实验检测两种多肽对MHCC97细胞的侵袭抑制作用。结果　GRGDS、YIGSR对MHCC97细胞对FN黏附的抑制作用呈时间剂量依赖。当药物浓度达 2 0 0mg/L时 ,黏附抑制率达 60 %。两种多肽分别与细胞共育 48h后 ,均显示出明显的侵袭抑制能力。将细胞接种于裸鼠后给予GRGDS或YIGSR治疗 ,与对照组比较 ,有明显的肺重减轻、肺转移灶减少 (P <0 .0 5 )。结论　抗黏附多肽GRGDS、YIGSR对人肝癌高转移细胞系MHCC97具有明显抑制黏附、抑制侵袭转移的作用。     

高/低转移人肝癌细胞株MHCC97-H/L中侧群细胞分析

目的观察高／低转移人肝癌细胞株MHCC97-H／L是否存在侧群（SP）细胞并鉴定其致瘤性。方法MHCC97-H／L予Hoechst33342和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）荧光染色；流式细胞分选MHCC97．H／L中SP细胞，分选后细胞皮下接种非肥胖性糖尿病联合免疫缺陷（NOD／SCID）小鼠，观察成瘤情况。结果Hoechst33342和CFSE染色结果显示，MHCC97-H／L中未染色细胞分别为（4．02±0．02）％／（1．02±0．01）％，流式细胞分选结果示MHCC97-H／L中sP细胞为（4．88±0．66）％／（0．88±0．36）％，比例差异有统计学意义（P〈0．05）。体内成瘤实验显示，SP细胞只需1×10。个即可在NOD／SCID小鼠皮下成瘤（5／6），而1×10^6个非SP细胞均未成瘤（0／6）。结论高／低转移人肝癌细胞株MHCC97-H／L中均存在SP细胞亚群，但前者比例显著高于后者。肝癌SP细胞具有极高的致瘤性，并可能和肝癌转移潜能相关。     

胃癌CD133阳性细胞亚群肿瘤起始细胞样特性的检测

目的 探讨人胃癌细胞CD133＋亚群的分选及其特性的鉴定.方法 对50例胃癌原发灶和癌旁胃黏膜组织标本行免疫组织化学染色及Western blot检测CD133蛋白的表达.采用流式细胞仪检测不同分化胃癌细胞系CD133所占百分比,免疫磁珠法分选CD133＋细胞亚群,悬浮培养并观察其生长特性,并检测CD133阳性细胞裸鼠皮下接种致瘤能力.单细胞克隆观察单个CD133＋细胞生长特性,半定量反转录聚合酶链反应法鉴定相关干细胞标记的表达.结果 CD133蛋白多定位于胃癌原发灶黏膜及黏膜下层的肿瘤细胞膜表面,其相对表达量高于癌旁胃黏膜组织（P＜0.05）.不同分化程度的人胃癌细胞系KATO-Ⅲ、SGC-7901、AGS及MKN-45中CD 133＋亚群所占相对百分比为（28±2）％、（17±2）％、（6±2）％及（4±2）％.人胃癌细胞系KATO-Ⅲ分选后阳性组中CD133＋亚群比例分别为（91±3）％;培养1周后,达到（95±2）％,并不断增殖形成细胞球.而且其增殖能力强于阴性细胞[群体倍增时间分别为（21±3）h和（40±8）h,P＜0.05].CD133阳性组和未分选组细胞裸鼠皮下接种时成瘤率分别为100％和80％;而CD133阴性组不成瘤,CD133阳性组移植瘤平均体积及重量均大于未分选组（P＜0.05,P＜0.05）.单克隆形成实验示单个CD133＋细胞可形成新的细胞克隆.半定量RT-PCR检测示其表达干细胞标记物Oct-4、Nanog、Sox-2、Musashi-1及EGFR.结论 体外可成功分离、纯化和扩增人胃癌细胞CD133＋亚群,其具有自我更新、增殖能力及较强的致瘤能力,并表达部分干细胞相关基因.     

骨髓间充质干细胞对人肝癌细胞系MHCC97-H增殖能力的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSC)对肝癌细胞增殖能力的影响.方法 人肝癌细胞系MHCC97-H培养液中分别加入0、25%和50%MSC的条件培养基(MSC-CM),采用CyQUANT细胞增殖实验检测吸光度A值变化.在MHCC97-H细胞培养液中添加50%MSC-CM,荧光实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki-67抗原的变化.16只裸鼠皮下接种MHCC97-H细胞后,实验组经静脉注射MSC,1×106个/次,每周3次,对照组静脉注射PBS;比较肿瘤体积.结果 培养液中加入MSC-CM后A值依次为211.65±54.72、236.24±57.15和283.59±62.16(P<0.05).PCNA和Ki-67的表达水平分别升高1.8和7.0倍.实验组肿瘤体积(1745±455)mm3m大于对照组(972±568)mm3(P<0.05),肿瘤体积平均增加速度(56.0±26.1)mm3/d高于对照组(32.4±14.5)mm3/d(P<0.05).结论 骨髓间充质干细胞可促进肝癌细胞系MHCC97-H的增殖.     

利用噬菌体肽库筛选高转移潜能人肝癌细胞结合肽

目的筛选高转移潜能人肝癌细胞特异性结合肽。方法以高转移潜能人肝癌细胞系HCCLM3作为靶细胞，低转移潜能人肝癌细胞系MHCC97L为吸附细胞对噬菌体随机7肽库进行差减筛选，采用噬菌体结合实验和抗噬菌体免疫细胞化学染色对阳性克隆的特异性进行鉴定。结果经3轮筛选，随机挑选48个噬菌体克隆进行DNA序列分析，展示AWYPLPP肽的噬菌体被高度富集77％（37／48）；噬菌体结合实验显示，与低转移潜能人肝癌细胞系MHCC97L、PLC／PRE／5和无转移潜能入肝癌细胞系Hep3B以及正常入肝细胞系CCLl3相比，AWYPLPP噬菌体特异性与高转移潜能人肝癌细胞系HCCLM3、HCCLM6、MHCC97H和MHCC97结合（P〈0．01）；抗噬菌体免疫细胞化学染色证实AWYPLPP噬菌体特异性靶向高转移潜能人肝癌细胞系HCCLM3、HCCLM6、MHCC97H和MHCC97。结论从噬菌体肽库中获得与高转移潜能人肝癌细胞特异性结合肽，可作为肝癌转移复发靶向治疗研究的载体。     

野菊花提取物对人肝癌MHCC97H细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察中药野菊花提取物(chrysanthemum indicum extact,CIE)对人肝癌MHCC97H 细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制.方法 体外培养人肝癌MHCC97H细胞,以0.4、0.8、1.2 mg/ml的CIE(实验1、2、3组)作用于MHCC97H细胞,并设立空白对照组.分别于药物作用24、48、72 h时,应用MTT法检测细胞增殖情况.于药物作用24 h时,用AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡、Rhol23检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)变化;Western blot检测细胞色素C、Caspase-9、-3的蛋白表达.结果 三种浓度的CIE对MHCC97H细胞的增殖均有明显的抑制作用,且呈明显的时间和浓度依赖性.与对照组相比,各实验组MHCC97H细胞的凋亡率明显增高(P＜0.05),线粒体膜电位水平明显降低(P＜0.05),细胞色素C、Caspase-9和-3的蛋白表达显著增强(P＜0.05),以上各项均呈明显的量效关系.结论 野菊花提取物对肝癌MHCC97H的增殖具有抑制作用,这可能与药物诱导肝癌细胞凋亡有关.线粒体途径可能是CIE诱导MHCC97H细胞凋亡的主要机制之一.     

Mir-145在肝癌细胞及肝癌组织中的表达及其意义

目的 观察微小RNA(miRNA)mir-145在正常胚肝细胞株L02、肝癌细胞株MHCC97和SMMC7721中的表达,同时检测该miRNA在正常肝组织及肝细胞癌组织中的表达,探讨其在肝癌发生发展中的作用和意义.方法 应用实时定量聚合酶链反应(PCR)方法检测mir-145在正常细胞株及肝癌细胞株中的表达,同时收取肝细胞癌手术患者正常组织、癌周组织、癌组织,检测其表达并分析其意义.结果 mir-145在肝癌细胞(MHCC97、SMMC7721)中的表达比正常肝细胞L02显著降低(0.312±0.025、0.396±0.076、0.954±0.037,P＜0.05),在癌组织中表达显著低于正常组织与癌周组织(0.162±0.002、0.972±0.054、0.956±0.018,P＜0.05),正常组织及癌周组织比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 mir-145在肝癌细胞及肝癌组织中的低表达,可能与肝癌发生发展密切相关,并可能作为肝癌的诊断及预后的指标.

Abstract：

Objective To explore the role of miR-145 in human hepatocellular carcinoma ( HCC). We investigate the expression of miR-145 in human embryonic hepatocytes ( L02 cells),hepatocellular carcinoma cell lines (MHCC97 ,SMMC7721) ,HCC tissues and normal liver. Methods We detected the expressions of miR-145 in human embryonic hepatocytes, hepatocellular carcinoma cell lines ( MHCC97,SMMC7721) ,HCC tissues,cancer organizations and normal liver by real-time PCR. Result The expression of miR-145 in hepatocellular carcinoma cell lines ( MHCC97,SMMC7721) is significantly lower than the human embryonic hepatocytes ( 0. 312 ± 0. 025,0. 396 ± 0. 076,0. 954 ± 0. 037, P ＜ 0. 05), and compared with the cancer organizations and normal liver,the expression of miR-145 in HCC tissues is significantly decreased (0. 162 ±0.002,0. 972 ±0.054,0.956 ±0. 018,P＜0. 05). Conclusion These results indicate that the miR-145 probably involved in HCC pathogenesis and was the indicator of diagnosis and prognosis of the HCC.     

siRNA干扰ABCG2影响肝癌细胞的耐药及侵袭能力

目的探讨ABCG2在肝癌细胞的耐药及转移侵袭过程中的作用。方法 MTT方法检测siRNA干扰前后三种肝癌细胞MHCC97-L、MHCC97-H、SMMC-7721对多柔比星的药物敏感性;划痕与Transwell实验证实这几种肝癌细胞在siRNA干扰前后的转移、侵袭能力;western-blot、PCR实验证实siRNA转染效率。结果 SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H细胞内ABCG2水平呈逐渐上升趋势,对多柔比星的耐受程度也同样逐步上升,同时侵袭能力逐渐增强;siRNA干扰后,MHCC97-L、MHCC97-H两株细胞中ABCG2水平明显降低,对多柔比星敏感性明显增强,侵袭能力明显下降。结论 ABCG2不仅在肝癌细胞的耐药过程中起到重要作用,同时还影响肝癌细胞的转移侵袭能力,靶向干扰ABCG2水平增加了化疗药物敏感性并降低肝癌细胞的转移侵袭能力。     

GRIM-19在肝细胞癌组织中的低表达及对其侵袭能力的影响

目的：检测GRIM-19在肝细咆癌（HCC）中的表达,分析其与HCC生物学行为的关系,并探讨GRIM-19对HCC侵袭能力的影响。方法：应用实时定量PCR技术检测83例HCC及其相对应的癌旁组织和8例正常肝组织中GRIM-19mRNA的表达,分析其与HCC临床病理因素之间的关系。用Westernblot法检测低侵袭力细胞株HL-7702、MHCC-97L和高侵袭力细胞株MHCC-97H、Huh-7中GRIM-19蛋白的表达。应用细胞转染技术将GRIM-19shRNA转入HL-7702和Huh-7,从而构建HL-7702和Huh-7的GRIM-19kd细胞系,并用Westernblot法检测转染效果。应用Transwell细胞迁移实验研究GRIM-19对HCC侵袭能力的影响。结果：实时定量PCR结果显示,83例HCC组织中有52例（62．65％）GRIM-19的表达低于相对应的癌旁组织（P〈O．01）,其表达水平也低于8例正常肝组织（P〈005）。GRIM-19的表达与HCC的TNM临床分期（P=O．011）、微血管浸润（P=O．047）和包膜浸润（P=O．013）密切相关。Westernblot显示HL-7702、MHCC-97L、MHCC-97H、Huh-7细胞系表达GRIM-19蛋白,且低侵袭力细胞株HL-7702、MHCC-97L中GRIM-19表达高于高侵袭力细胞株MHCC-97H、Huh-7。细胞侵袭实验显示GRIM-19低表达促进了HCC的侵袭能力。结论：GRIM-19在HCC的侵袭中起重要作用,可能为检测HCC的侵袭潜能提供新的研究思路。     

肝细胞肝癌侵袭性及门静脉癌栓形成与ezrin

目的探讨细胞骨架连接蛋白ezrin在肝癌组织以及肝癌细胞系中的表达，及其与肿瘤侵袭性的关系。方法手术切除肝细胞肝癌标本及其相应癌旁肝组织41例以及同期良性肝病肝组织9例，按照肿瘤大小、有无播散灶及远处转移、有无包膜、有无门静脉癌栓等将肿瘤分为高侵袭和低侵袭两组，分别采用RTPCR、Western和免疫组化技术检测ezrin的表达。并检测MHCC97L、MHCC97H和LM3三株细胞系的ezrin表达。结果高侵袭肝细胞肝癌组织ezrin表达强度显著高于低侵袭肝细胞肝癌组织（P〈0．05），癌栓组织ezrin表达强度更高（P〈0．05）。三株细胞系均表达ezrin，其强度随侵袭性增高依次增强。结论Ezrin在肝癌组织中的表达增加与肿瘤侵袭及门静脉癌栓的形成相关。Ezrin在MHCC97L、MHCC97H和LM3三株细胞系均表达，其表达强度随侵袭性增强而依次增加。     

抑制肝癌细胞β-catenin表达能降低缺氧诱导的侵袭转移潜能

目的 研究β-catenin表达对缺氧环境中肝癌细胞侵袭转移潜能的影响.方法 利用100 μmol/L氯化钴处理高转移性MHCC97肝癌细胞模拟体外缺氧;将红色荧光标记的上述细胞(MHCC97-R)行肝脏原位种植并肝动脉结扎,构建体内缺氧模型.在此基础上,以RNAi技术敲除上述细胞内β-catenin基因,观察其对缺氧环境中肝癌细胞侵袭、转移能力的影响.结果 缺氧抑制MHCC97肝癌细胞增殖及MHCC97-R移植瘤生长,但增加其体外侵袭及体内转移.敲除β-catenin不能进一步加强缺氧对细胞增殖的抑制效应,但可明显减少由缺氧诱导的侵袭、转移.结论 缺氧环境中,肝癌细胞增强的侵袭转移潜能与β-catenin功能相关.     

绿脓杆菌制剂对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨绿脓杆菌制剂(pseudomonas aeruginosa vaccine,PA)对有转移潜能的人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 采用不同浓度的PA分别作用于MHCC97L细胞,观察细胞增殖、生长曲线、克隆形成率、流式细胞术分析(FCM)、侵袭、运动、迁移、VEGF和MMP2蛋白表达(ELISA法).结果 PA明显抑制MHCC97L细胞增殖和克隆形成,呈良好的剂量-效应关系.PA 48 h和72 h的IC50分别为3.1×108/ml和1. 9×108/ml.PA浓度为0.5×108/ml、1×108/ml和2×108/ml时,其细胞倍增时间依次增加,克隆形成率依次降低(P均＜0.01);FCM显示,G1期细胞比例随PA浓度增加而增加,S+G2期细胞比例随PA浓度增加而降低(P均＜0.01).PA浓度为1×108/ml时,穿过人工基底膜(侵袭实验)和上室底膜(运动实验)的细胞数(分别为4.8±1.3和8.8±2.2)明显低于对照组(8.6±2.1和15.6±1.2)(P均＜0.01);细胞经72 h培养后,对照组划痕逐渐愈合,1×108/ml的PA组细胞划痕依然明显.ELISA法检测发现,1×108/ml的PA组其VEGF蛋白和MMP2蛋白含量和对照组相比均无明显差异(P均＞0.05).结论 在一定条件下,绿脓杆菌制剂可抑制人肝癌MHCC97L细胞增殖和克隆形成,其作用部分是通过使细胞周期阻滞在G1期实现的;绿脓杆菌制剂可以明显抑制MHCC97L细胞的侵袭、运动和迁移能力,其作用和VEGF、MMP2蛋白分泌关系不明显.